Western Blot 技术原理及常见问题分析2

-70℃保存
Western Blot 操作要点
--蛋白上样量的计算
后续试验对上样量的要求 蛋白浓度 上样孔的容积

Western Blot 操作要点
--目的蛋白含量过低的处理 加大上样体积 浓缩样品 --亲和沉淀或者免疫沉淀 --专一吸附富集和洗脱的亲和柱 --超滤浓缩：离心超滤管 加大胶的厚度
-- 相关试剂的选择 一抗的选择 样本的种属 适用于WB实验方法 单克隆抗体或经亲和纯化的多克隆抗体 二抗的选择 与一抗种属匹配 HRP标记的 抗体的保存和使用： 按说明书的要求分装保存，避免反复冻融 工作液现配现用，4度不超过2周 说明书推荐的稀释倍数作参考，
Western Blot 操作要点
-- 相关试剂的选择 封闭液的选择（脱脂奶粉；BSA） 脱脂奶粉成本低但不能用于磷酸化蛋白（因 脱脂奶粉含有酪蛋白,该蛋白本身就是一种磷 酸化蛋白），使用脱脂奶粉会结合磷酸化抗 体从而易产生高背景 如无高背景担忧，用含低浓度(0.5 – 0.25%) 脱脂奶粉或 BSA 的封闭液来稀释抗体，可 产生相对更强的信号条带

蛋白提取与样品处理
① ② ③

电泳与转膜
① ② ③
④
裂解液的选择与使用 蛋白定量 蛋白变性与保存 目的蛋白含量过低的处理
大分子与小分子蛋白的电泳 转印不完全的对策 免疫检测前如何判断蛋白的 转移效果

免疫杂交与底物显色
①
② ③

膜的再利用
①
②
试剂的选择与使用方法 试剂反复使用中的注意点 优化结果的要点
Western Blot 技术探讨
研究生： ##### 导师：########
Western Blot 基本原理

电泳步骤： 1.清洗玻璃板 2.灌胶与上样 （1）玻璃板对齐后放在夹中卡紧，然后垂 直卡在架子上准备灌胶 （2）配置10%的分离胶，加入TEMED后立 即摇匀即可灌胶。灌胶至玻璃板高度的2／ 3处即可，然后胶上加一层水，液封后的胶 凝的更快（30min）。
（3）当水与胶之间有一条明显的折射线时， 说明胶已凝了。等三分钟胶完全凝固后倒 去上层水，并用吸水纸将水吸干。 （4）按方法配置5%的浓缩胶，加入TEMED 后积极摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓 缩胶，然后将梳子插入浓缩胶中，待浓缩 胶凝过后，两手分别捏住梳子的两端竖直 向上轻轻将其拔出（一般20分钟时最好 拔）。 (5将装置放入电泳槽中，加入足量的电泳液 后开始准备上样（电泳液至少漫过小玻璃 板内侧）
（1）25mg/mL BSA的配制: 取0.8mL蛋白标准配制液加入到一管蛋白 标 准(20mg BSA)中，充分溶解后配制 25mg/mL的蛋白标准溶液。配制后可立即使用， 也以-20℃长期保存。 （2）1mg/mL BSA的配制: 取BSA贮备液25mg/mL（0.1mL），用 1×loading buffer（2.4mL）稀释至2.5mL， 按0.5mL分装成5个包装，标记放入-20℃。 （3）60% TCA工作液的配制: 取2.2g TCA（三氯醋酸）溶于3.67mL双蒸水 中，即为60% TCA工作液，使用前配制。 （4）配制BSA标准系列和样品 如表格：
封闭
用5%的脱脂奶粉封闭液 （2.5g脱脂奶粉， 50mlPBST缓冲液）封闭， 在摇床上封闭一小时。
一抗杂交


一抗稀释液：一抗，10ml PBST，0.1g脱脂 奶粉，30ul叠氮钠。用PBST稀释一抗至适当 浓度（一抗使用前要3000r／min离心3min）。 将一抗稀释液倒入保鲜膜袋内，从封闭液中 取出膜用滤纸吸干残留液体，将膜放入一抗 稀释液中，膜蛋白面与抗体液面接触。室温 下脱色摇床20min,4℃过夜。次日用PBST缓 冲液室温脱色摇床上洗三次，每次10min。

westen blot原理Western blot（又称为蛋白质印迹）是一种重要的蛋白质检测方法，它可以用于检测蛋白质的相对分子质量、数量和抗原特异性。

Western blot是通过将蛋白质样品经SDS-PAGE电泳分离后，将其迁移至膜上，然后使用特异性抗体对目标蛋白进行检测的技术。

Western blot 能够检测样品中可能存在于微量的蛋白质，并且能够区分具有不同结构或特征的不同蛋白质。

Western blot 的原理是：将蛋白质样品经SDS-PAGE电泳分离后，将其转移到聚丙烯酰胺或聚乙烯膜上，然后使用荧光素或辐射的能量使膜上的蛋白质变得容易检测。

Western blot 检测使用的抗体通常是标记有辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或荧光素的二抗或其他特异性抗体。

其中辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶可以清晰地显示特异信号，并且可以通过开发和显色识别来显示相对定量。

Western blot 主要用于检测特定蛋白质，如抗体和结构蛋白，但是与其他定量蛋白质方法相比，Western blot 需要相应的蛋白质特异性抗体。

尽管Western blot已成为一种常见的蛋白质分析方法，但是它的应用也因其灵敏性、帮助诊断某些疾病和进行药学研究而备受欢迎。

Western blot 的优点包括：1. 可检测特定蛋白质，能够区分不同的蛋白质。

2. 可在单个实验中同时检测多个蛋白质。

3. 可定量检测蛋白质。

4. 可在不同样品中比较蛋白质表达水平。

Western blot 检测的主要步骤包括制备蛋白质样品、SDS-PAGE电泳、转膜和检测。

下面我们就将分别介绍这些步骤。

1. 制备蛋白质样品Western blot 检测的首要步骤是样品的制备。

样品的制备是决定Western blot检测结果是否准确的关键。

在制备样品时，鼓励使用相同的样品制备方法和提取技术，包括细胞溶解、组织破碎和蛋白质提取等技术。

样品的制备要求能够尽可能避免蛋白质的失活和降解。

常用的转移膜主要有PVDF膜( Polyvinylidene-
Fluoride)和硝酸纤维素膜。PVDF膜与目的蛋白质的结
合能力高,灵敏度高,不易破碎,同时也适用于再次标记
(PVDF膜使用前需浸泡在甲醇中以增加膜的亲水性)。
✓其他注意事项
而硝酸纤维素膜虽不需要浸泡但极易破碎。
1. 从负极（黑板）到正极（透明板）方向依次：纤维垫、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤
✓膜标记正反面 转膜后有时会分不清膜的正反面。凝胶电泳时使用
有色分子量 Marker或转膜后在膜上稍微剪断一个角(可 自由决定剪断方向),会有利于判断膜的方向。 ✓其他注意事项 1. 封闭时间不宜过长，封闭时间过长会抑制抗原抗体
反应及标记抗体的酶活性。 2. 注意避免让膜变干。
4.一抗反应
✓一抗的选择 抗体有识别1个抗原决定簇的单克隆抗体和识别
1 × TBST缓冲液配制：TBS粉末，溶于2L蒸馏水中，再加入2mL TWEEN - 20。
9. Western Blot实用小技巧
9. Western Blot实用小技巧
谢谢大家
组织取绿豆粒大小（30~50 mg ）组织，加入预冷的RIPA裂解液，按照质量 体积比1：10 比例加入RIPA 裂解液（PMSF和PIC 1:100 v/v ）。然后予以组织匀 浆机处理，全程在冰上操作。匀浆结束后，将所有样本静置于冰上30 min，
上述裂解液离心，4 ℃ 12 000 rpm 离心 20 min 收集上清（即蛋白原液），避 免吸到沉淀。吸取10uL蛋白用于定量，剩余蛋白加入5 x loading buffer 进行充分 混匀（5 loading buffer和蛋白组织液比1:4），在98 ℃条件下加热10 min，然后进 行分装后保存于-20 ℃冰箱中。