下载文档原格式
Western Blot详解(原理、分类、试剂、步骤及问题解答)Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。
对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
本文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术:一、原理二、分类i.放射自显影ii.底物化学发光ECLiii.底物荧光ECFiv.底物DAB呈色三、主要试剂四、主要步骤五、实验常见的问题指南1.参考书推荐2.针对样品的常见问题3.抗体4.滤纸、胶和膜的问题5.Marker的相关疑问6.染色的选择7.参照的疑问8.缓冲液配方的常见问题9.条件的摸索10.方法的介绍11.结果分析一、原理与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
二、分类现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。
只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
三、主要试剂1、丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1% (w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。
试述western blot技术的原理、方法、注意事项及其在医学科研中的应用。
1. 引言1.1 概述Western blot技术是一种常用的分子生物学实验方法，用于检测、定量和分析特定蛋白质在复杂混合物中的表达和相互作用。
它具有高灵敏度、高特异性和较为准确的测量能力，因此在医学科研领域中得到广泛应用。
1.2 文章结构本文将详细介绍Western blot技术的原理、方法、注意事项以及在医学科研中的应用。
首先，我们将阐述免疫检测原理、蛋白质分离与转移原理以及免疫染色与检测原理，帮助读者全面了解该技术的基本原理。
其次，我们将描述样品制备与电泳条件设置、蛋白质转移与固定方法以及免疫染色及可视化方法，为读者提供详细的实验步骤。
随后，我们将介绍实验室操作要求及安全措施、样品处理和保存注意事项以及技术参数调整和结果解读注意事项，以保证实验的准确性和可重复性。
最后，在医学科研领域中的应用方面，我们将以蛋白质表达水平检测、蛋白质亚细胞定位分析以及蛋白质相互作用和功能分析为例，展示Western blot技术在疾病诊断和药物研发等方面的重要应用。
1.3 目的本文的目的是为读者提供对Western blot技术全面了解，并指导其在医学科研中正确应用该技术。
通过详细介绍该技术的原理、方法和注意事项，读者将能够准确地进行实验操作并正确解读结果，同时也能够认识到其在医学科研中的重要性和广泛应用价值。
2. Western blot技术原理2.1 免疫检测原理Western blot技术是一种常用于检测特定蛋白质的免疫学方法。
它基于抗原与抗体的特异性结合关系，通过将蛋白质溶液经过电泳分离、转移到固体载体上，并使用特异性抗体识别目标蛋白质，从而实现对目标蛋白质的定性和定量检测。
在Western blot中，首先需要将待检测的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳分离。
然后，通过将蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶或其他固体载体上，在固相载体上形成一个被称为“Western blotting”的蛋白质模式。
关于western blot原理和常见故障分析关于western blot原理：通过电泳区分不同的组分，并转移至固相支持物，通过特异性试剂（抗体）作为探针，对靶物质进行检测，蛋白质的Western印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低至1～5ng（最低可到10－100pg）中等大小的靶蛋白。
一、抗原的选择和制备A：样品的制备1组织：组织的处理方法：组织洗涤后加入3倍体积预冷的PBS，0℃研磨，加入5×STOP buffer，180W，6mins，0℃超声波破碎，5000rpm，5mins离心，取上清。
加入β-ME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分装后于-20℃保存，用时取出，直接溶解上样。
2细胞：细胞的处理方法：离心收集细胞或者直接往细胞培养瓶内加入5×STOP buffer，收集，180W，6mins，0℃超声波破碎，5000rpm，5mins离心，取上清。
加入β-ME(9.5ml 加入0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分装后于-20℃保存，用时取出，直接溶解上样。
3分泌蛋白的提取（特例）：直接收集分泌液，加入β-ME、溴酚蓝制样。
B：蛋白的定量方法及影响蛋白定量原因1.双缩脲法：双缩脲法是第一个用比色法测定蛋白质浓度的方法。
在需要快速，但不很准确的测定中，常用此法。
硫铵不干扰显色，这对蛋白质提纯的早期阶段是非常有利的。
双缩脲法的原理是Cu2+与蛋白质的肽键，以及酪氨酸残基络合，形成紫蓝色络合物，此物在540nm波长处有最大吸收。
双缩脲法常用于0.5g/L～10g/L含量的蛋白质溶液测定。
干扰物有硫醇，以及具有肽性质缓冲液，如Tris、Good缓冲液等。
可用沉淀法除去干扰物，即用等体积10%冷的三氯醋酸沉淀蛋白质，然后弃去上清液，再用已知体积的1m NaOH溶解沉淀的蛋白质进行定量测定。
聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理一、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）基本原理聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel elecrtrophoresis，PAGE）是一种分析两性物质结构的有效方法。
它是以聚丙烯酰胺凝胶为载体，应用交流或直流电场，乙二醇或乙二醇水溶液作为移动介质，使分子在电场中经由凝胶移动的方法。
具体而言，在PAGE中，分子在电场的作用下，从凝胶上的电极处向凝胶内部移动（例如正电极向凝胶内部移动），同时，分子根据其在凝胶网络中的活动和受到通过电场施加的力的影响，以不同的速率穿过凝胶，从而获得他们特定的构型，最终从凝胶边缘离开，在凝胶面连续移动，并最终到达电极处。
PAGE试验，最初的凝胶电泳试剂和反应体系主要是：在聚丙烯酰胺(PAGE)网络中混合有多种构型的分子，如水溶性酶、酸性蛋白质、核酸、抗体、复合蛋白质等，然后在此反应系统中加入电场，使其穿过凝胶网络，最终降解产物可以通过激光共聚焦成像系统被识别。
二、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）的优势1、PAGE技术能够极大地提高蛋白质分析的灵敏度和精确度。
由于它的分辨率高，可以检测到任何大小的分子，因此，可以对蛋白质的组成、构型、结构及其功能特性有更深入的了解。
2、PAGE技术的速度快，可以在几分钟内完成蛋白质分析，非常适合在大量的样本分析中使用，且它的成本也较低，可以大大提高蛋白质的检测速度和效率。
3、PAGE技术可进行准确有效的分析，这种测定方法也可提供浓度的分析。
4、PAGE技术有较高的灵敏度，能够检测到微量的蛋白质，可以检测到蛋白质的微弱变化，从而发现蛋白质在特定状态下是否有差异。
5、PAGE技术还有制备样品的优势，例如，不需要预处理，可以直接使用凝胶，并可以更有效地增加高技术水平的研究；此外，也有其他的细胞或分子的制备方法，从而可以获得更高的准确性和细节化的信息。
蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质的western blot蛋白质免疫印迹分析又称Western Blotting，是以某种抗体作为探针，使之与附着在固相支持物上的靶蛋白所呈现的抗原部位发生特异性反应，从而对复杂混合物中的某些特定蛋白质进行鉴别和定量。
这一技术将蛋白质凝胶电泳分辨率高与固相免疫测定特异性强的特点结合起来，是一种重要的蛋白质分析测试手段。
一、实验目的了解蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质的western blot的基本原理、实验流程，了解双红外激光扫描成像系统的荧光显色方法和分析方法。
二、实验原理(一)不连续SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(Acr)和交联剂亚甲双丙烯酰胺（Bis)在催化剂作用下聚合而成的，聚合时形成的微孔影响了不同SDS-多肽复合物电泳时的迁移率，即所谓的分子筛效应。
SDS多肽复合物在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小相关。
蛋白质的分子量在15-200KD之间时，电泳的迁移率与分子量的对数呈线性关系。
SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围双丙烯酰胺：丙烯酰胺为1：29 浓度（%）线性分离范围（KD）15 12-4310 16-487.5 36-945.0 57-212在SDS—PAGE中，由于SDS和巯基乙醇的作用，使得蛋白分子中的二硫键还原，氢键、疏水键打开，SDS按l.4g SDS／1g蛋白质的比例结合于蛋白质多肽链上，形成SDS—多肽复合物, 因SDS中的十二烷基磺酸根带负电荷，其电荷量远远大于蛋白质分子原有电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质分子间原有的电荷差别，同时，在水溶液中，SDS一多肽复合物具有近似形状（长椭圆棒状），使得SDS—PAGE的迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响，而只与分子量有关。
SDS—PAGE通常采用不连续的缓冲液系统，包括低浓度的浓缩胶与高浓度的分离胶，各有相应的pH值与离子强度，使得蛋白样品沿移动的界面迁移，在分离胶表面形成一极薄层面，极大地浓缩了样品的体积，此即浓缩效应。
Western Blot 原理和操作方法（全）工作原理蛋白质的电泳分离是重要的生物化学分离纯化技术之一,电泳是指带电粒子在电场作用下,向着与其电荷相反的电极移动的现象.根据所采用的支持物不同,有琼脂糖凝胶电泳,淀粉凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳等.其中,聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)由于无电渗作用,样品用量少(1-100μg),分辨率高,可检出10-9-10-12mol的样品,凝胶机械强度大,重复性好以及可以通过调节单体浓度或单体与交联剂的比例而得到孔径不同的凝胶等优点而受到广泛的应用.SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式,特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量.PAGE能有效的分离蛋白质,主要依据其分子量和电荷的差异,而SDS-PAGE(SDS变性不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳)的分离原理则仅根据蛋白质的分子量的差异,因为SDS-PAGE的样品处理液是在要跑电泳的样品中假如含有SDS和巯基乙醇(2-ME)或二巯基赤藓醇(DTT),其可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键,破坏蛋白质的四级结构,SDS是一种阴离子表面活性剂即去污剂,它可以断开分子内和分子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级及三级结构,并与蛋白质的疏水部分相结合,破坏其折叠结构,电泳样品假如样品缓冲液后,要在沸水中煮3-5分钟使SDS 与蛋白质充分结合形成SDS-蛋白质复合物,SDS-蛋白质复合物在强还原剂巯基乙醇存在时,蛋白质分子内的二硫键被打开而不被氧化,蛋白质也完全变性和解聚,并形成榛状结构,稳定的存在于均一的溶液中,SDS与蛋白质结合后使SDS-蛋白质复合物上带有大量的负电荷,平均每两个氨基酸残基结合一个SDS分子,这时各种蛋白质分子本身的电荷完全被SDS掩盖,远远超过其原来所带的电荷,从而使蛋白质原来所带的电荷可以忽略不计,消除了不同分子之间原有的电荷差别,其电泳迁移率主要取决于亚基分子质量的大小,这样分离出的谱带也为蛋白质的亚基.样品处理液中通常加入溴酚蓝染料, 溴酚蓝指示剂是一个较小的分子,可以自由通过凝胶孔径,所以它显示着电泳的前沿位置,当指示剂到达凝胶底部时,即可停止电泳.另外样品处理液中也可加入适量的甘油或蔗糖以增大溶液密度,使加样时样品溶液可以沉入样品加样槽底部.重要参数①聚丙烯酰胺凝胶(PAG)制备原则:由于孔径的大小取决于单体和双体丙烯酰胺在凝胶中的总浓度(T)以及双体占总浓度的百分含量即交联度(C)决定的,因而制胶之前必须首先知道这两个参数.一般可以由下述公式计算:T%=(a+b)/m*100%; 和C%=a/(a+b)*100%其中: a=双体(bis)的重量;b=单体(arc)的重量;m=溶液的体积(ml)②当分析一个未知样品时,常常先用7.5%的标准凝胶制成4-10的梯度凝胶进行试验,以便选择理想的胶浓度.如果蛋白质的分子量已知,可参考下表选择所需凝胶浓度:蛋白质分子量范围(Da) 适宜的凝胶浓度(%)<10420-301×104-4×10415-204×104-1×10510-151×105-5×1055-10>5×1052-5蛋白分子量 (kDa)凝胶浓度 (%)4-40 20 12-45 15 10-70 12.5 15-100 10 25-2008③分离胶（5ml 体积）:5%的积层胶的配置：蛋白质的样品制备：蛋白质的样品制备是Western Blotting 的第一步，样品制备是关键步骤，要求尽可能的获得所有蛋白质，应注意以下问题：1：在合适的盐浓度下，应保持蛋白质的最大溶解性和可重复性。
聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为（），是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质地一种常用电泳技术.聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成.催化聚合地常用方法有两种：化学聚合法和光聚合法.化学聚合以过硫酸铵（）为催化剂，以四甲基乙二胺（）为加速剂.在聚合过程中，催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构.根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统电泳体系中缓冲液值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应.不连续系统中由于缓冲液离子成分，，凝胶浓度及电位梯度地不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳.不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成.浓缩胶是由催化聚合而成地大孔胶，凝胶缓冲液为地.分离胶是由催化聚合而成地小孔胶，凝胶缓冲液为.电极缓冲液是甘氨酸缓冲液.种孔径地凝胶、种缓冲体系、种值使不连续体系形成了凝胶孔径、值、缓冲液离子成分地不连续性，这是样品浓缩地主要因素.资料个人收集整理，勿做商业用途蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它地迁移率取决于它所带净电荷以及分子地大小和形状等因素.如果加入一种试剂使电荷因素消除，那电泳迁移率就取决于分子地大小，就可以用电泳技术测定蛋白质地分子量.年，等发现阴离子去污剂十二烷基硫酸钠（）具有这种作用.当向蛋白质溶液中加入足够量和巯基乙醇，可使蛋白质分子中地二硫键还原.由于十二烷基硫酸根带负电，使各种蛋白质—复合物都带上相同密度地负电荷，它地量大大超过了蛋白质分子原地电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间原有地电荷差别，与蛋白质结合后，还可引起构象改变，蛋白质—复合物形成近似“雪茄烟”形地长椭圆棒，不同蛋白质地复合物地短轴长度都一样，约为，这样地蛋白质—复合物，在凝胶中地迁移率，不再受蛋白质原地电荷和形状地影响，而取决于分子量地大小由于蛋白质－复合物在单位长度上带有相等地电荷，所以它们以相等地迁移速度从浓缩胶进入分离胶，进入分离胶后，由于聚丙烯酰胺地分子筛作用，小分子地蛋白质可以容易地通过凝胶孔径，阻力小，迁移速度快；大分子蛋白质则受到较大地阻力而被滞后，这样蛋白质在电泳过程中就会根据其各自分子量地大小而被分离.因而聚丙烯酰胺凝胶电泳可以用于测定蛋白质地分子量.当分子量在到之间时，蛋白质地迁移率和分子量地对数呈线性关系，符合下式：，式中：为分子量，为迁移率，、均为常数，若将已知分子量地标准蛋白质地迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它地电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量. 资料个人收集整理，勿做商业用途－聚丙烯酰胺凝胶电泳经常应用于提纯过程中纯度地检测，纯化地蛋白质通常在电泳上应只有一条带，但如果蛋白质是由不同地亚基组成地，它在电泳中可能会形成分别对应于各个亚基地几条带.－聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高地灵敏度，一般只需要不到微克量级地蛋白质，而且通过电泳还可以同时得到关于分子量地情况，这些信息对于了解未知蛋白及设计提纯过程都是非常重要地.资料个人收集整理，勿做商业用途常见问题分析. 配胶缓冲液系统对电泳地影响？在－不连续电泳中，制胶缓冲液使用地是－缓冲系统，浓缩胶是，分离胶；而电泳缓冲液使用地－甘氨酸缓冲系统.在浓缩胶中，其环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场地作用下，泳动效率低；而离子却很高，两者之间形成导电性较低地区带，蛋白分子就介于二者之间泳动.由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高地电压剃度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄地区带.当样品进入分离胶后，由于胶中地增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径地缩小，在电场地作用下，蛋白分子根据其固有地带电性和分子大小进行分离.资料个人收集整理，勿做商业用途所以，对整个反应体系地影响是至关重要地，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题地情况，应首要考虑该因素.资料个人收集整理，勿做商业用途. 样品如何处理？根据样品分离目地不同，主要有三种处理方法：还原处理、非还原处理、带有烷基化作用地还原处理.资料个人收集整理，勿做商业用途）还原处理：在上样中加入和（或巯基乙醇）后，蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成与蛋白相结合地分子，在电泳中，只根据分子量来分离.一般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样，离心，沸水煮，再离心加样.资料个人收集整理，勿做商业用途）带有烷基化作用地还原处理：碘乙酸胺地烷基化作用可以很好地并经久牢固地保护基团，得到较窄地谱带；另碘乙酸胺可捕集过量地，而防止银染时地纹理现象.样品缓冲液中％地碘乙酸胺，并在室温保温.资料个人收集整理，勿做商业用途）非还原处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只用％沸水中煮，未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用.资料个人收集整理，勿做商业用途. 电泳凝胶中各主要成分地作用？聚丙烯酰胺地作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固地好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关；资料个人收集整理，勿做商业用途制胶缓冲液：浓缩胶选择，分离胶选择，选择－系统，与：提供自由基，是催化剂，催化自由基引起地聚合反应进行；十二烷基硫酸钠（）：阳离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间地氢键、取消蛋白分子内地疏水作用、去多肽折叠.资料个人收集整理，勿做商业用途. 提高电泳分辨率地途径？聚丙烯酰胺地充分聚合，可提高凝胶地分辨率.建议做法：待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用.忌即配即用或度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致结晶.一般凝胶可在室温下保存天，可水解聚丙烯酰胺.资料个人收集整理，勿做商业用途一般常用地有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料，不同染料又各自不同地染色方法，具体可参照郭尧君编著地《蛋白质电泳技术手册》.资料个人收集整理，勿做商业用途.“ 微笑”（两边翘起中间凹下）形带原因？主要是由于凝胶地中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚地凝胶中.处理办法：待其充分凝固再作后续实验.. “皱眉”（两边向下中间鼓起）形带原因？主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间地底部间隙气泡未排除干净.处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡.. 为什么带出现拖尾现象？主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起地.处理办法：加样前离心；选择适当地样品缓冲液，加适量样品促溶剂；电泳缓冲液时间过长，重新配制；降低凝胶浓度.资料个人收集整理，勿做商业用途. 为什么带出现纹理现象？主要是样品不溶性颗粒引起地.处理办法：加样前离心；加适量样品促溶剂.. 什么是“鬼带”，如何处理？“鬼带”就是在跑大分子构象复杂地蛋白质分子时，常会出现在泳道顶端（有时在浓缩胶中）地一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀，主要由于还原剂在加热地过程中被氧化而失去活性，致使原来被解离地蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子量要比目标条带大，有时不能进入分离胶.但它却于目标条带有相同地免疫学活性，在反应中可见其能与目标条带对应地抗体作用.资料个人收集整理，勿做商业用途处理办法：在加热煮沸后，再添加适量地或巯基乙醇，以补充不足地还原剂；或可加适量来阻止还原剂地氧化.资料个人收集整理，勿做商业用途. 为什么溴酚蓝不能起到指示作用？我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底，但蛋白质却还未跑下来地现象.主要与缓冲液和分离胶地浓度有关.处理办法：更换正确值地；降低分离胶地浓度.. 为什么电泳地条带很粗？电泳中条带很粗是常见地事，主要是未浓缩好地原因.处理办法：适当增加浓缩胶地长度；保证浓缩胶贮液地正确（）；适当降低电压；. 为什么电泳电压很高而电流却很低呢？这种现象一般初学者易出现.比如电压以上，可电流却在以下.主要是由于电泳槽没有正确装配，电流未形成通路.包括：.内外槽装反；.外槽液过少；.电泳槽底部地绝缘体未去掉（比如倒胶用地橡胶皮）.资料个人收集整理，勿做商业用途处理办法：电泳槽正确装配即可.. 浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡对电泳有影响吗？这主要出现在初学者中，一般对电泳不会有太大地影响.前者主要原因是拔梳子用力不均匀或过猛所致；后者是由于在解除制胶地夹子后，板未压紧而致空气进入引起地.资料个人收集整理，勿做商业用途. 凝胶时间不对，或慢或快，怎么回事？通常胶在内凝.如果凝地太慢，可能是，剂量不够或者失效.应该现配现用，不稳定，易被氧化成黄色. 如果凝地太快，可能是和用量过多，此时胶太硬易裂，电泳时易烧胶.资料个人收集整理，勿做商业用途. 电泳时间比正常要长？可能由于凝胶缓冲系统和电级缓冲系统地选择错误，即缓冲系统地和被分离物质地等电点差别太小，或缓冲系统地离子强度太高.资料个人收集整理，勿做商业用途。
聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理及常见问题分析聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE（Polyacrylamide gel electrophoresis），是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。
聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。
催化聚合的常用方法有两种：化学聚合法和光聚合法。
化学聚合以过硫酸铵（AP）为催化剂，以四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。
在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。
PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。
不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。
不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。
浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HC1。
分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HC1。
电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。
2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。
蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。
如果加入一种试剂使电荷因素消除，那电泳迁移率就取决于分子的大小，就可以用电泳技术测定蛋白质的分子量。
1967年，Shapiro等发现阴离子去污剂十二烷基硫酸钠（SDS）具有这种作用。
当向蛋白质溶液中加入足够量SDS和巯基乙醇，SD S可使蛋白质分子中的二硫键还原。
由于十二烷基硫酸根带负电，使各种蛋白质—SDS复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间原有的电荷差别，SDS与蛋白质结合后，还可引起构象改变，蛋白质—SDS复合物形成近似“雪茄烟”形的长椭圆棒，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样，约为1 8A，这样的蛋白质—SDS复合物，在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原的电荷和形状的影响，而取决于分子量的大小由于蛋白质－SDS复合物在单位长度上带有相等的电荷，所以它们以相等的迁移速度从浓缩胶进入分离胶，进入分离胶后，由于聚丙烯酰胺的分子筛作用，小分子的蛋白质可以容易的通过凝胶孔径，阻力小，迁移速度快；大分子蛋白质则受到较大的阻力而被滞后，这样蛋白质在电泳过程中就会根据其各自分子量的大小而被分离。
因而S DS聚丙烯酰胺凝胶电泳可以用于测定蛋白质的分子量。
当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳经常应用于提纯过程中纯度的检测，纯化的蛋白质通常在SDS电泳上应只有一条带，但如果蛋白质是由不同的亚基组成的，它在电泳中可能会形成分别对应于各个亚基的几条带。
SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高的灵敏度，一般只需要不到微克量级的蛋白质，而且通过电泳还可以同时得到关于分子量的情况，这些信息对于了解未知蛋白及设计提纯过程都是非常重要的。
SDS-PAGE常见问题分析1. 配胶缓冲液系统对电泳的影响？在SDS－PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris－HCL缓冲系统，浓缩胶是pH6.7，分离胶pH8.9；而电泳缓冲液使用的Tris－甘氨酸缓冲系统。
在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而CL离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。
由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压剃度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。
当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。
所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。
2. 样品如何处理？根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：还原SDS处理、非还原S DS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。
1）还原SDS处理：在上样buffer中加入SDS和DTT（或Beta巯基乙醇）后，蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成SDS与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。
一般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样Buffer，离心，沸水煮5min，再离心加样。
2）带有烷基化作用的还原SDS处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护SH基团，得到较窄的谱带；另碘乙酸胺可捕集过量的DTT，而防止银染时的纹理现象。
100ul样品缓冲液中10ul 20％的碘乙酸胺，并在室温保温30min。
3）非还原SDS处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只用1％SDS沸水中煮3min，未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。
3. SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用？聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关；制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.7，分离胶选择pH8.9，选择tris－HCL系统，TEMED与AP：AP提供自由基，TEMED是催化剂，催化自由基引起的聚合反应进行；十二烷基硫酸钠（SDS）：阳离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。
4. 提高SDS-PAGE电泳分辨率的途径？聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。
建议做法：待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。
忌即配即用或4度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致SDS结晶。
一般凝胶可在室温下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。
一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料，不同染料又各自不同的染色方法，具体可参照郭尧君编著的《蛋白质电泳技术手册》P82-103。
5.“ 微笑”（两边翘起中间凹下）形带原因？主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚的凝胶中。
处理办法：待其充分凝固再作后续实验。
6. “皱眉”（两边向下中间鼓起）形带原因？主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。
处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。
7. 为什么带出现拖尾现象？主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。
处理办法：加样前离心；选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂；电泳缓冲液时间过长，重新配制；降低凝胶浓度。
8. 为什么带出现纹理现象？主要是样品不溶性颗粒引起的。
处理办法：加样前离心；加适量样品促溶剂。
9. 什么是“鬼带”，如何处理？“鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时，常会出现在泳道顶端（有时在浓缩胶中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀，主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。
但它却于目标条带有相同的免疫学活性，在WB反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。
处理办法：在加热煮沸后，再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇，以补充不足的还原剂；或可加适量EDTA来阻止还原剂的氧化。
10. 为什么溴酚蓝不能起到指示作用？我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底，但蛋白质却还未跑下来的现象。
主要与缓冲液和分离胶的浓度有关。
处理办法：更换正确pH值的Buffer；降低分离胶的浓度。
11. 为什么电泳的条带很粗？电泳中条带很粗是常见的事，主要是未浓缩好的原因。
处理办法：适当增加浓缩胶的长度；保证浓缩胶贮液的pH正确（6.7）；适当降低电压；12. 为什么电泳电压很高而电流却很低呢？这种现象一般初学者易出现。
比如电压50v以上，可电流却在5mA以下。
主要是由于电泳槽没有正确装配，电流未形成通路。
包括：a.内外槽装反；b.外槽液过少；c.电泳槽底部的绝缘体未去掉（比如倒胶用的橡胶皮）。
处理办法：电泳槽正确装配即可。
13. 浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡对电泳有影响吗？这主要出现在初学者中，一般对电泳不会有太大的影响。
前者主要原因是拔梳子用力不均匀或过猛所致；后者是由于在解除制胶的夹子后，板未压紧而致空气进入引起的。
14. 凝胶时间不对，或慢或快，怎么回事？通常胶在30MIN-1H内凝。
如果凝的太慢，可能是TEMED，APS剂量不够或者失效。
APS应该现配现用，TEMED不稳定，易被氧化成黄色。
如果凝的太快，可能是APS 和TEMED用量过多，此时胶太硬易裂，电泳时易烧胶。
15. 电泳时间比正常要长？可能由于凝胶缓冲系统和电级缓冲系统地PH选择错误，即缓冲系统地PH 和被分离物质的等电点差别太小，或缓冲系统的离子强度太高。
