WB免疫印迹实验常见问题全汇总

WB免疫印迹中常见问题和解决方法1．电泳中常出现的一些现象：●︶条带呈笑脸状原因：凝胶不均匀冷却，中间冷却不好; 电泳系统温度偏高。

●︵条带呈皱眉状原因：可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全。

●拖尾原因：样品溶解不好。

●纹理（纵向条纹）原因：样品中含有不溶性颗粒。

●条带偏斜原因：电极不平衡或者加样位置偏斜。

●条带两边扩散原因：加样量过多。

2．Western blot 结果中背景较高可能的原因及建议：●膜封闭不够延长封闭的时间；选择更加适合的封闭液。

●一抗稀释度不适宜对抗体进行滴度测试，选择最适宜的抗体稀释度。

●一抗孵育的温度偏高建议4℃结合过夜。

●选择的膜容易产生高背景一般硝酸纤维素膜的背景会比PVDF 膜低。

●膜在实验过程中干过实验过程中要注意保持膜的湿润。

●检测时曝光时间过长减少曝光时间。

3．Western blot 结果中杂带较多可能的原因及建议：●目的蛋白有多个修饰位点（磷酸化位点、糖基化位点、乙酰化位点等），本身可以呈现多条带。

查阅文献或进行生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，通过去修饰确定蛋白实际大小。

●目的蛋白有其它剪切本查阅文献或生物信息学分析可能性。

●样本处理过程中目的蛋白发生降解加入蛋白酶抑制剂；样本处理时在冰上操作。

●上样量过高，太敏感适当减少上样量。

●一抗特异性不高重新选择或制备高特异性的抗体。

●一抗不纯纯化抗体●一抗或者二抗浓度偏高降低抗体浓度。

4 . Western blot 结果中无信号或显示信号弱可能的原因及建议：●检测样本不表达目的蛋白选择表达量高的细胞作为阳性对照，用于确定检测样本是否为阴性。

●检测样本低表达目的蛋白提高上样量，裂解液中注意加入蛋白酶抑制剂。

●转移不完全或过转移可以用丽春红染膜并结合染胶（考马斯亮蓝）后确定条带是否转至膜上或转移过头；适当调整转膜的时间和电流。

●抗体不能识别测试种属的相关蛋白购买抗体前应当认真阅读抗体说明书，确定其是否能够交叉识别测试种属的对应蛋白。

WB发光检测中常见的问题及解决⽅法免疫印迹试验（Western blot）是分⼦⽣物学、⽣物化学和免疫遗传学中常⽤的⼀种实验⽅法，被⼴泛应⽤于蛋⽩表达⽔平的研究、抗体活性检测和早期疾病诊断等多个⽅⾯。

其中较为简单也为⼤家所普遍接受的Western blot显⾊⽅法为底物化学发光法ECL，⽂章根据发光检测中常见的⼏种问题现象与各位⽣物⼈⼀起探讨。

疫印迹试验（Western blot）是分⼦⽣物学、⽣物化学和免疫遗传学中常⽤的⼀种实验⽅法，被⼴泛应⽤于蛋⽩表达⽔平的研究、抗体活性检测和早期疾病诊断等多个⽅⾯。

其中较为简单也为⼤家所普遍接受的Western blot显⾊⽅法为底物化学发光法ECL，⽂章根据发光检测中常见的⼏种问题现象与各位⽣物⼈⼀起探讨。

众所周知，Western blot的原理是蛋⽩质在电⼒场的作⽤下，由⼤到⼩的进⾏排列，利⽤电泳进⾏分离和富集。

拥有抗原表位的蛋⽩质分⼦被抗体（⼀抗）特异性识别并与之结合。

在此基础上，酶或荧光标记的⼆抗识别并结合⼀抗，通过与底物反应显⾊来观察⽬的蛋⽩。

Western blot显⾊的⽅法主要有以下⼏种：⼀、放射⾃显影，⼆、底物化学发光ECL，三、底物荧光ECF，四、底物DAB呈⾊。

现常⽤的有底物化学发光ECL和底物DAB呈⾊。

⼤部分Western blot显⾊底物是化学发光底物，发表⽂章通常也是⽤底物化学发光ECL。

ECL法检测辣根过氧化物酶的原理是辣根过氧化物酶在H2O2存在下，氧化化学发光物质鲁⽶诺（lumino，氨基苯⼆酰⼀肼）并发光，在化学增强剂存在下光强度可以增⼤1000倍，通过将印记放在照相底⽚上感光就可以检测辣根过氧化物酶的存在。

ECL法操作简便，应⽤现成的试剂盒，按照说明，将两种显⾊底物等体积混合后将其覆盖在膜表⾯使其均匀，⽤玻璃胶⽚把膜包起来，马上在暗室中将X光⽚覆盖在膜的上⾯，显影、定影（或⽤荧光检测仪检测）。

ECL法具有灵敏度⾼，线性范围⼴等特点。

wb实验过程中的各种问题和解决方法在进行WB实验过程中，可能会遇到一些问题，下面是一些常见问题和相应的解决方法。

1.染料溶液没有颜色或颜色很浅。

解决方法：-检查染料溶液是否过期，如果过期需要更换新的溶液。

-检查染料溶液的浓度是否正确，可能需要重新制备一份更浓的溶液。

-检查染料溶液的保存条件是否正确，染料溶液应避光保存，并且在低温下保存。

2.染料在染色过程中不均匀。

解决方法：-在染色前先将细胞均匀地分布在载玻片上，可以通过离心或其他方法来实现。

-在染料溶液中加入混匀剂，如液体洗涤剂，以帮助染料均匀地渗透到细胞内。

-改变染色时间和温度，染色时间过长或温度过高都可能导致染料渗透不均匀。

3.染色结果不明显。

解决方法：-检查抗体的质量，可能需要更换新的抗体。

-检查染色的时间和温度，染色时间过短或温度过低可能导致染色结果不明显。

-检查染色液的浓度，可能需要调整染色液的浓度以获得更明显的染色结果。

-提高显微镜的放大倍数，以便更清楚地观察染色结果。

4.细胞在染色过程中丧失形态。

解决方法：-确保在染色前细胞的状态良好，新鲜的细胞应该被使用。

-降低染色液的渗透压，使用低渗透压的缓冲液来进行染色。

-控制染色液的温度，避免用过高或过低的温度来处理细胞。

5.染色结果有杂质。

解决方法：-使用高纯度的试剂和试验设备，避免使用过期的试剂。

-对比试验，使用负对照来排除非特异性染色引起的杂质。

-进行洗涤步骤时，确保从载玻片上完全洗去所有未结合的染料。

6.染色结果无法观察到。

解决方法：-检查显微镜的镜头和光源是否正常，可能需要清洁镜头或更换光源。

-调整显微镜的对焦和光源的亮度，以找到最佳的观察条件。

-检查染色实验的结果是否正常，可能需要重新实验。

在进行WB实验时，还应注意以下问题：1.实验操作要准确无误，遵循实验方案的步骤和要求。

2.注意个人防护，佩戴实验室服和防护手套等个人防护用品。

3.注意实验器材的清洁与消毒，避免交叉污染。

4.正确保存和处理实验样品和废弃物，按照实验室安全规范进行处理。

WB常见问题及处理方法问题描述可能原因验证或解决办法无信号一抗和二抗不匹配1.二抗需和一抗宿主的物种相同（如一抗来自兔，二抗为抗兔抗体）。

没有足够的一抗或二抗结合目标蛋白1.降低一抗的稀释度（二抗一般确认体系之后不调）；2.使用效价高的一抗；3.延长抗体孵育时间，一抗4℃过夜，二抗室温1-2h；4.在孵育一抗或者二抗的时候，几张膜叠在一起，导致孵育不充分；5.一抗和二抗量不足，或者膜飘浮在表面，导致孵育不充分。

封闭液与一抗或二抗有交叉反应1.选择合适的封闭液（例如磷酸化抗体选择BSA溶液进行封闭）；2.选择合适的一抗，二抗的稀释液（建议选择成分比较清楚的BSA或者明胶）。

一抗不识别检测物种的蛋白1.参考说明书，此抗体是否适合这个物种；2.分析比对免疫原序列和蛋白序列，保守性强的可以尝试；3.设置能检测的阳性对照。

抗原量不足1.检测样本中目的蛋白表达较少；2.每泳道蛋白上样量少，总蛋白量不低于20-30μg，使用蛋白酶抑制剂并设置阳性对照；3.磷酸化抗体检测优先使用BSA进行封闭。

4.使用相应的刺激，使目的蛋白表达丰度提高。

组织中目的蛋白含量低1.选择特异表达目的蛋白的组织；2.组织新鲜，及时提取，尽快使用；3.使用相应的蛋白酶抑制剂。

转膜不充分或电极插反没转成功1.根据目的蛋白的分子量，选择合适的转膜条件；2.转膜结束后，用丽春红对膜进行染色，分析转膜效果（也可对残留胶进行考染，观测转膜效率）；3.转膜时电极插反，导致转膜失败4.选择相应的转膜液，5.膜孔太大，转膜条件过大，目的蛋白转过。

洗膜过度 1.降低洗膜强度（洗膜时间，次数和温度）。

过度封闭使目标蛋白不能显色1.减少封闭时间，考虑封闭温度；2.更换封闭剂，使用含0.5%脱脂奶粉或无脱脂奶粉的抗体稀释液，代替5%脱脂奶粉、显色液失活 1.检测使用的显色液是不是有效，特别是ECL显色中，ECL-B特别容易失效。

激发光波长选择不合适 1.对于不同荧光标记的二抗，选择合适的激发光波长。

【干货收藏贴】WB常见问题精品全集锦做了很久的WB（western blot），走了很多弯路，但是WB想要做好并不难，总结WB实验中可能会遇到的问题，分析可能的原因及对应的解决方案，这就是实验成功的基石。

以下，我们先解决很多技术菌的疑惑，然后再着手汇总实验中常见问题和可能原因分析以及给出建议解决方案。

WB常见问题分析1.为什么我的细胞提取液中没有检测到目的蛋白？原因有很多：a) 细胞中不表达这种蛋白质，换一种细胞；b) 细胞中的蛋白质被降解掉了，可加入蛋白酶抑制剂，抑制蛋白酶活性；c) 抗体不能识别目标蛋白，多看看说明，是否有问题；d) 酶降解可能是没有保持低温操作，样品保存不当，样品放置时间过长。

2.我做的蛋白质分子量很小（10KDa），请问怎么做WB？a)可以选择PSQ 膜，同时缩短转移时间。

也可以将两张膜叠在一起，再转移。

其他按步骤即可；b)也可选择孔径0.22um的PVDF膜或者NC膜，转膜时间缩短，另外可采用Tricine-SDS-PAGE体系。

3.我的目的带很弱，如何加强？a)可以加大抗原上样量，这是最主要的；b)也可以将一抗稀释比例降低；c)还可以延长曝光时间。

4.DAB好还是ECL好？DAB 有毒，但是比较灵敏，是HRP 最敏感的底物；ECL结果容易控制，但被催化时灵敏度差一点，但如果达到阀值，就特别灵敏，可以检测pg 级抗原。

5.胶片是一片空白，是怎么回事？如果能够排除下面的几个问题那么问题多半出现在一抗和抗原制备上。

a) 二抗的HRP 活性太强，将底物消耗光；b) ECM底物中H2O2，不稳定，失活；c) ECL底物没覆盖到相应位置；d) 一抗选择不当二抗失活；e) 二抗失活。

6.磷酸化抗体的检测样本制备时是否一定要加NaF等？NaF是一种广谱磷酸化酶的抑制剂，一般最好加。

但是不加也可以，大部分时候是不用加的。

7.细胞水平要做WB，多少细胞提的蛋白够做WB？一般5×106就足够。

Western Blot（蛋白质印迹）技术是生物医学研究中常用的蛋白质分析技术之一，可以用于检测蛋白质样品中的特定抗原。

然而，在进行Western Blot实验时，可能会遇到一些问题，下面列举了一些常见问题及解决方法：1.电泳条带不清晰或无条带：解决方法：•检查样品质量，确保待检测样品是可用的，无降解或污染。

•调整电泳参数，如电压、电流和时间等，以优化电泳效果。

•更换抗体，确认抗体的特异性，避免非特异性结合。

2.膜上背景过重：解决方法：•在抗体孵育之前，使用封闭剂封闭膜上的非特异性位点，减少抗体非特异性结合。

•减少一抗和二抗的浓度，减轻非特异性结合。

•增加洗涤次数和时间，以清除未结合的抗体和蛋白质。

3.目的蛋白信号弱或无：解决方法：•调整一抗和二抗的浓度，提高特异性结合的信号强度。

•选择更灵敏的显色方法，如化学发光法等。

•在转膜前，优化样品处理，如提取、纯化和浓缩等步骤。

4.非特异性条带：解决方法：•检查抗体特异性，确认抗体的特异性，更换抗体以减少非特异性结合。

•检查样品处理步骤，避免样品中的杂蛋白干扰。

•增加洗涤次数和时间，以清除未结合的抗体和非特异性结合的蛋白质。

5.显影后膜上条带处变为黄色或白色：解决方法：•可能是由于曝光时间过长或显影液浓度过高导致的，可以降低曝光时间和减少显影液浓度来解决问题。

•在膜清洗时使用甲醇或乙醇等有机溶剂，清除膜上的多余抗体和显色剂。

6.条带内无显影的白点：解决方法：•在转膜前检查是否存在气泡，气泡会影响转膜效果和条带形成。

•增加转膜时间和电流，以促进蛋白质的转移。

•检查显影液是否过期或存在质量问题。

7.存在散在小圆斑：解决方法：•这可能是由于封闭液中的杂质颗粒导致的，可以通过过滤封闭液来清除杂质。

•检查一抗和二抗是否含有杂质抗体或存在抗体污染的情况，更换抗体可以解决问题。

•检查显色液是否存在问题，如过期或存在杂质等，更换显色液可以解决问题。

8.条带变形或不均匀：解决方法：•检查电泳胶的质量和制备过程是否存在问题。

蛋白Westernblot电泳——试验中常见问题及解答蛋白质电泳与western blot1Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。

对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。

该文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术。

（1）原理（2）分类①放射自显影②底物化学发光ECL ③底物荧光ECF ④底物DAB呈色（3）主要试剂（4）主要程序（5）实验常见的问题指南 1. 参考书推荐 2. 针对样品的常见问题3. 抗体 4. 滤纸、胶和膜的问题 5. Marker 的相关疑问 6. 染色的选择7. 参照的疑问8. 缓冲液配方的常见问题9. 条件的摸索10. 方法的介绍11. 结果分析（1）原理：与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。

经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。

以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

（2）分类①放射自显影②底物化学发光ECL ③底物荧光ECF ④底物DAB呈色现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。

只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP 标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。

（3）主要试剂1、(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。

western免疫印迹实验流程和蛋白条带的注意事项一、条带中所遇到的情况1. 完全没有条带完全没有条带的原因主要有以下4点：（1）抗体加错（最常见一抗加错抗体，或二抗种属加错）。

（2）转膜出现了问题（常见膜放反）。

（3）发光液失效或不够灵敏。

（4）蛋白上样量过少，一抗浓度太低2. 目的条带有但高背景高背景可能是WB中最常见出现的问题，目的条带单一清晰，但是其他地方又弥漫性较为均一的背景，主要原因：（1）洗膜时间和次数不够（常用10min*3）。

（2）封闭不够好。

（3）一抗浓度过高，可通过调整一抗浓度来降低背景。

3.出现非均一性背景原因：膜可能曾经干过，在封闭的时候，洗一抗，洗二抗，以及发光的时候都时刻需要注意蛋白面不要风干，风干之后结果很可能就是这个样子。

注意与高背景区别。

4.背景出现黑点由于封闭时牛奶不纯，没有完全溶解致使颗粒残留，同时封闭后清洗不完全，也会导致背景出现黑色斑点。

5.条带上有白色小点由于电转中膜和胶之间存在气泡，转膜时一定要将气泡都去除。

6.非特异性条带主要由于一抗非特异性与蛋白结合，建议更换抗体。

7.条带拖尾主要原因：（1）蛋白量太大。

（2）一抗浓度过大，孵育时间太长。

8.条带呈哑铃状（1）胶在配置过程中未冷却完全，胶不够均一。

（2）样品中含有太多杂质，没有离心下来，杂质沉积在孔的中间。

9.电泳中出现问题（1）整个条带呈“ ︶” 状：凝胶冷却不均一，电泳时电压过大发热，应该降低电压或者冰浴。

（2）整个条带呈“ ︵”：凝胶左右两头没有凝固好（3）溴酚蓝拖尾：样品溶解不好。

（4）纵向的纹理：上样样品中存在不溶性颗粒（5）溴酚蓝很粗：浓缩胶浓缩效果不好，可能是浓缩胶太短，或者是浓缩胶配错。

（6）在分离胶中跑不动：Tris-Cl PH值不对，或者忘记加SDS。

二、内参的选择1. Actin，Tubulin，GAPDH都为最常用的内参抗体，Actin，Tubulin的缺点是有时候会出现复带，GAPDH与前两者相比比较稳定，建议选择。

Western免疫印迹常见问题解答赛信通生物试做Western免疫印迹时，将膜孵育在稀释的抗体中轻轻摇动并4°C过夜。

抗体稀释在含5% 的w/v BSA或1X TBS, 0.1% Tween-20的脱脂奶粉当中。

注意：参考一抗的产品说明书选用合适的抗体稀释液和稀释比例。

A．所需溶液和试剂注意：所有溶液用Milli-Q或相当级别的水配制。

1. 20X 磷酸盐缓冲生理盐水(PBS):(#9808) 配制1L 1X PBS时，取50ml 20X PBS用950ml RODI水稀释到1L，混匀。

2. 1X SDS 上样缓冲液：(#7722, #7723) 62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8，25°C), 2% w/v SDS, 10% 甘油, 50 mM DTT, 0.01% w/v 溴酚蓝或酚红。

3. 转膜缓冲液：25 mM Tris 碱, 0.2 M 甘氨酸, 20% 甲醇(pH 8.5)。

4. 10X Tris缓冲盐水(TBS):配制1L时，称取24.2g Tris碱，80g NaCl加入1L水中；调整pH为7.6（稀释至1X使用）。

5. 脱脂牛奶:(#9999) (重量体积比[w/v])6. 封闭液：含5% w/v脱脂奶粉，0.1% Tween-20的1X TBS。

配150ml时，在135ml水中兑入15ml 10X TBS，混匀；加入7.5g脱脂奶粉，使之溶解；边搅拌边加入0.15 ml Tween-20 (100%)，混匀。

7. 洗液:1X TBS, 0.1% Tween-20 (TBS/T)。

8. 牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA): (#9998).9. 一抗稀释液：含5% w/v脱脂奶粉或BSA，0.1% Tween-20的1X TBS。

配20ml时，在18ml水中兑入2ml 10X TBS，混匀；加入1gBSA或脱脂奶粉，使之溶解；边搅拌边加入20 μl Tween-20 (100%)，混匀。

Western 免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。

对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。

WB 实验中常会出现各种问题问题可能原因建议电泳条带成笑脸状胶不均匀冷切，中间冷却不好，电泳系统温度偏高减少电压减慢电泳速度，在冷室或者冰浴中进行电泳电泳条带成皱眉状可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全调整装置拖尾样品溶解不好样品充分溶解混匀后上样纹理(纵向条纹) 样品中含有不溶性颗粒样品充分搅拌混匀条带偏斜电极不平衡或者加样位置偏斜调整电极和加样条带两边扩散加样量过多适当减少上样量Marker 变黑色抗体和 Marker 蛋白反应在 Marker 和 sample 之间空出一个孔不上样背景高膜封闭不够延长封闭时间，选择最适宜的抗体稀释度一抗稀释度不适宜对抗体进行滴度测试，选择最适宜的抗体稀释度一抗孵育的温度偏高建议4℃ 结合过夜二抗浓度度过高降低二抗浓度二抗的非特异性背景增加一个二抗对照，不加一抗，其他操作过程不变，即可验证背景是否是由于二抗所致。

可选择其它二抗（特异性更强的，只针对重链）二抗孵育时间过久减少二抗孵育时间选择膜的问题硝酸纤维素的背景会比 PVDF 膜低膜在实验过程中干过实验过程中要注意保持膜的湿润检测时曝光时间过长注意曝光时间的缩短洗膜不充分增加洗膜的时间和次数抗体和封闭蛋白有交叉反应检测抗体与封闭蛋白的交叉反应性，选择无交叉反应的封闭剂。

洗涤液中加入 Tween-20 可减少交叉反应杂带较多目的蛋白有多个修饰位点（磷酸化位点，糖基化位点，乙酰化位点等），本身可以呈现多条带查阅文献或进行生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，通过去修饰确定蛋白试剂大小目的蛋白有其他剪切本查阅文献或生物信息学分析可能性样品处理过程中目的蛋白发生降解裂解液中加入蛋白酶抑制剂，样品处理在冰上进行上样量过高，太敏感适当减少上样量一抗不纯纯化抗体一抗特异性不高重新选择或制备高特异性的抗体二抗的非特异性结合增加一个二抗对照，不加一抗，其他操作过程不变，即可验证背景是否是由于二抗所致。