qRT-PCR和WesternBlot常见问题解决-李晔——【RT-PCR技术】

Quantion 2
扩增效率低，反应条件不够优化。
1
设计更好的引物或探针；改用三步法进行反应；适当降低退火温度；
增加镁离子浓度等。
CT值出现过晚
2
PCR各种反应成分的降解或加样量的不足。
3
PCR产物太长。
一般采用80-150bp的产物长度。
Quantion 3 标准曲线的线性关系不佳
1.加样存在误差，使得标准品不呈梯度。
2.标准品出现降解。应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释 标准品。
3.引物或探针不佳。重新设计更好的引物和探针。
4.模板中存在抑制物，或模板浓度过高。
Quantion 4 阴性对照也出现明显的起飞
1.mix或水被污染。
2.引物二聚体的出现。
用SG法在35cycles以后阴性出现起飞属正常情况，可配合熔解曲 线进行分析。
荧光定量 PCR仪
qRT-PCR基本条件
与之相连 的计算机
qRT-PCR基本流程
从样品中 提取总RNA
将RNA逆转 录为cDNA
qRT-PCR 扩增
定量结 果分析
定量引物设计要求
以MDH1为例，首先在NCBI Nucleotide中搜索基因
每个基因都有不同的转录本，任 意选择其中一个适合的转录本
找到CDS序列并复制，不同 转录本CDS序列位置不同
将CDS序列复制到引物设计 软件Primer5
根据CDS序列设计引物，Tm值为60至64， GC含量40% 到60%，且found少或没有， 长下游扩增长度为100到150。
引物设计完后BLAST预测引物特异性
预测引物是否跨内含子
定量结果分析：扩增曲线
3.反应过程中探针的降解。
用PAGE电泳对探针进行检测。
4.如果使用了ROX校正，则可能是ROX的降解所造成。
Quantion 5 熔解曲线不止一个主峰
1．引物设计不够优化。
应避免引物二聚体和发夹结构的出现。
2.引物浓度不佳。
适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。
3.镁离子浓度过高。
适当降低镁离子浓度，Baidu Nhomakorabea选择更合适的mix试剂盒。
制胶：将玻璃板清水洗净，固定在电泳槽上，并验漏。 分离胶 (20mL) ：H2O 7.9mL、30% Acrylamlde 6.7mL、1.5M Tris-HCl PH8.8 5.0mL、10% SDS 0.2mL、10% 过硫酸胺 0.2mL、TEMED 0.008mL
加入分离胶后用正丁醇覆盖，待胶凝固后倒出。 浓缩胶 (4mL) ： H2O 2.7mL、30% Acrylamlde 0.67mL、1.5M Tris-HCl PH6.8 0.5mL、 10% SDS 0.04mL、10% 过硫酸胺 0.04mL、TEMED 0.004mL
注意：PMSF有剧毒，可挥发，不能直接接触皮肤； 5×loading buffer 难溶需要加热。
蛋白浓度测定：
1、工作液200 μL/孔，A溶液：B溶液 = 50：1
2、标准曲线：标准蛋白 10 9 8 6 4 2 0
水
0 1 2 4 6 8 10
样品：水= 1 μL：9 μL
3、酶标仪570 nm测定
扩增曲线 样品放置
定量结果分析：扩增曲线
率先到达CT值得RNA浓度较高，模板较好，内参的CT值一般为10到16之间。
定量结果分析：溶解曲线
出现杂峰引物需要重新设计
单一峰引物特异性较好
qRT-PCR常见问题解决
Quantion 1
无CT值（信号）出现
1.反应循环数不够。 一般都要在35个循环以上，可根据实验情况增加循环（45cycles）， 但高于45个循环会增加过多的背景信号。 2.检测荧光信号的步骤有误。 一般SG法采用72℃延伸时采集，Taqman法则一般在退火结束时或 延伸结束采集信号。 3.引物或探针降解。 可通过PAGE电泳检测其完整性。 4.引物或探针的设计。 探针高于引物的温度不够，造成探针未杂交上而产物已延伸的情况。 5、模板量不足。 一般SG法采用72℃延伸时采集，Taqman法则一般在退火结 束时或延伸结束采集信号。 6.模板降解。 避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。
4.模板有基因组的污染。
RNA提取过程中避免DNA的引入，或通过引物设计避 免非特异扩增。
WesternBlot基本内容
WesternBlot基本内容
细胞蛋白提取： 1、细胞4 ℃预冷，PBS清洗2次。 2、配制裂解液 (6cm板) ：PMSF 1.5 μL+cocbtail (磷酸酶抑制剂) 1.5 μL。 3、取150 μL/孔细胞，加入以上裂解液没过全部细胞，冰上放置30 min。 4、用细胞刮将裂解过的细胞全部刮下来，然后转移到1.5 μL EP管中。 5、最大转速离心15 min，取上清。 6、取10 μL上清液于1.5 μL EP管中测浓度，其余上清液加入5×loading buffer 金属浴中100 ℃煮沸 ，- 20 ℃保存。
加入浓缩胶后插上梳子，待胶凝固后轻轻拔出，加蛋白样品。 电泳：浓缩胶60V，Marker分开以后调到 100V。
qRT-PCR和WesternBlot 常见问题解决
实习生：李晔
CONCENT 1 qRT-PCR基本内容 2 qRT-PCR常见问题解决 3 WesternBlot基本内容 4 WesternBlot常见问题解决
qRT-PCR基本内容
qRT-PCR基本内容
定量PCR（即时聚合酶链锁反应，Real-time Polymerase Chain Reaction，简称 Real-time PCR、即 时PCR），又称定量即时聚合酶链锁反应（Quantitative real time polymerase chain reaction，简称 QPCR/qPCR/RT-qPCR），是一种在DNA扩增反应中，以 萤光染剂侦测每次聚合酶链锁反应（PCR）循环后产物 总量的方法技术。广义概念的定量PCR技术是指以外参 或内参为标准，通过对PCR终产物的分析或PCR过程的 监测，进行PCR起始模板量的定量。狭义概念的定量 PCR技术（严格意义的定量PCR技术）是指用外标法 （荧光杂交探针保证特异性）通过监测PCR过程（监测 扩增效率）达到精确定量起始模板数的目的，同时以内 对照有效排除假阴性结果（扩增效率为零）。