WB免疫印迹实验常见问题全汇总

WB免疫印迹中常见问题和解决方法1．电泳中常出现的一些现象：●︶条带呈笑脸状原因：凝胶不均匀冷却，中间冷却不好; 电泳系统温度偏高。

●︵条带呈皱眉状原因：可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全。

●拖尾原因：样品溶解不好。

●纹理（纵向条纹）原因：样品中含有不溶性颗粒。

●条带偏斜原因：电极不平衡或者加样位置偏斜。

●条带两边扩散原因：加样量过多。

2．Western blot 结果中背景较高可能的原因及建议：●膜封闭不够延长封闭的时间；选择更加适合的封闭液。

●一抗稀释度不适宜对抗体进行滴度测试，选择最适宜的抗体稀释度。

●一抗孵育的温度偏高建议4℃结合过夜。

●选择的膜容易产生高背景一般硝酸纤维素膜的背景会比PVDF 膜低。

●膜在实验过程中干过实验过程中要注意保持膜的湿润。

●检测时曝光时间过长减少曝光时间。

3．Western blot 结果中杂带较多可能的原因及建议：●目的蛋白有多个修饰位点（磷酸化位点、糖基化位点、乙酰化位点等），本身可以呈现多条带。

查阅文献或进行生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，通过去修饰确定蛋白实际大小。

●目的蛋白有其它剪切本查阅文献或生物信息学分析可能性。

●样本处理过程中目的蛋白发生降解加入蛋白酶抑制剂；样本处理时在冰上操作。

●上样量过高，太敏感适当减少上样量。

●一抗特异性不高重新选择或制备高特异性的抗体。

●一抗不纯纯化抗体●一抗或者二抗浓度偏高降低抗体浓度。

4 . Western blot 结果中无信号或显示信号弱可能的原因及建议：●检测样本不表达目的蛋白选择表达量高的细胞作为阳性对照，用于确定检测样本是否为阴性。

●检测样本低表达目的蛋白提高上样量，裂解液中注意加入蛋白酶抑制剂。

●转移不完全或过转移可以用丽春红染膜并结合染胶（考马斯亮蓝）后确定条带是否转至膜上或转移过头；适当调整转膜的时间和电流。

●抗体不能识别测试种属的相关蛋白购买抗体前应当认真阅读抗体说明书，确定其是否能够交叉识别测试种属的对应蛋白。

wb实验过程中的各种问题和解决方法在进行WB实验过程中，可能会遇到一些问题，下面是一些常见问题和相应的解决方法。

1.染料溶液没有颜色或颜色很浅。

解决方法：-检查染料溶液是否过期，如果过期需要更换新的溶液。

-检查染料溶液的浓度是否正确，可能需要重新制备一份更浓的溶液。

-检查染料溶液的保存条件是否正确，染料溶液应避光保存，并且在低温下保存。

2.染料在染色过程中不均匀。

解决方法：-在染色前先将细胞均匀地分布在载玻片上，可以通过离心或其他方法来实现。

-在染料溶液中加入混匀剂，如液体洗涤剂，以帮助染料均匀地渗透到细胞内。

-改变染色时间和温度，染色时间过长或温度过高都可能导致染料渗透不均匀。

3.染色结果不明显。

解决方法：-检查抗体的质量，可能需要更换新的抗体。

-检查染色的时间和温度，染色时间过短或温度过低可能导致染色结果不明显。

-检查染色液的浓度，可能需要调整染色液的浓度以获得更明显的染色结果。

-提高显微镜的放大倍数，以便更清楚地观察染色结果。

4.细胞在染色过程中丧失形态。

解决方法：-确保在染色前细胞的状态良好，新鲜的细胞应该被使用。

-降低染色液的渗透压，使用低渗透压的缓冲液来进行染色。

-控制染色液的温度，避免用过高或过低的温度来处理细胞。

5.染色结果有杂质。

解决方法：-使用高纯度的试剂和试验设备，避免使用过期的试剂。

-对比试验，使用负对照来排除非特异性染色引起的杂质。

-进行洗涤步骤时，确保从载玻片上完全洗去所有未结合的染料。

6.染色结果无法观察到。

解决方法：-检查显微镜的镜头和光源是否正常，可能需要清洁镜头或更换光源。

-调整显微镜的对焦和光源的亮度，以找到最佳的观察条件。

-检查染色实验的结果是否正常，可能需要重新实验。

在进行WB实验时，还应注意以下问题：1.实验操作要准确无误，遵循实验方案的步骤和要求。

2.注意个人防护，佩戴实验室服和防护手套等个人防护用品。

3.注意实验器材的清洁与消毒，避免交叉污染。

4.正确保存和处理实验样品和废弃物，按照实验室安全规范进行处理。

我做的WB中检测两个目的基因，一个是90kd，一个是42kd，内参是36kd，请问一下我这个怎么做才有可比性，后面一个目的蛋白和内参大小差不了多少，如果是一块胶的话，剪膜也不能剪。

谢谢大家！这个很容易做，跑两个膜，每张膜上分别Blot两个目的基因，只要保证两个膜使用的都是同样来源的样品就好。

然后在分别strip掉blot内参基因。

如果你非要在一张膜上做的话，取决于你的前两个目的基因使用多抗还是单抗，使用抗兔的二抗的话，你可以先加一个基因的一抗，再加另一个基因的一抗，然后用抗兔的二抗一次将两个基因同时Blot出来。

一般内参基因都是单抗，所以将blot过的膜很轻微的strip一下，去除掉抗兔的二抗即可进一步blot内参，这样两个的结果都没有互相的干扰。

但是你一定要记得，不管你怎么做，内参一定要最后才能blot，如果你先blot了内参，由于内参蛋白在膜上的量实在太大，导致化学发光很强，你在后来无论如何strip还是blot 你的目的基因，都没办法拿到很好的结果。

1．为什么一定需要内参？内参的重要性。

2。

常用的几种内参。

3。

不同的情况如何选择不同的内参。

1：用内参照是为了评价你的各个上样孔内蛋白的总量是否基本一致，通常使用一些看家蛋白，比如β-actin、GAPDH等等。

这些蛋白在所有细胞中的表达量基本一致，所以用他们来作为你加样量的对照。

这样western结果中你的目的蛋白经过处理后发生变化，而内参的条带基本均匀一致。

这样才有说服力，表明的确是处理因素造成目的蛋白的变化而不是加样误差或是人为造成目的条带浓度的变化。

严格意义上说，内参事必须做的。

2：常用的内参有：b-actin，GAPDH，近2-3 年，更详细的研究发现，β-Tubulin (球管蛋白)，被广泛应用于Western Blotting，β－Tubolin分子量为55KD左右。

3：一般我们选择内参与要检测的目的蛋白的分子量最好相差5KD以上。

刚开始接触WB实验有没有大佬可以分享常见WB常见问题的解决方法对于WB实验，我真的很有发言权，实验室苦干几年加上毕业后在试剂公司做技术支持好几年，我碰到的正常与非正常的WB实验问题肯定比一般人更多！这里给大家分享我们合作的课题组以及我们自己课题组在做WB实验的时候常见的一些问题以及解决方法！在讲WB之前，大家有兴趣的可以保存下这套课程，这是我自己买过的一套解螺旋实验技术学习的课程，2000分钟的实验讲堂，40个实验技能认证培训，有需要的可以自取，能学到非常多的实验实操知识。

好了，继续我们的主题内容。

Western Blot，通常我们在日常交流中说的就是简称“WB”，中文名称是“蛋白印迹”或“免疫印迹”，其核心本质是抗原抗体的特异性反应。

Western Blot的基本原理是蛋白质通过凝胶电泳后，按分子量大小顺序在分离胶中分离开来，通过转膜可将胶上蛋白质转移到固相载体（通常是PVDF膜、NC膜和尼龙膜）表面，然后加入一抗去特异性结合膜上蛋白质，再加入酶或者荧光素标记的二抗，二抗与一抗结合反应后，通过底物显色、化学发光等方法检测目的蛋白。

Western Blot实验一般用来判断特定蛋白在样本中是否表达及粗略分析特定蛋白表达量的高低。

01样本问题Q：蛋白样本如何准备？A：对于细胞样本，蛋白的提取方法比较简单，只需要将细胞培养基弃掉，然后利用PBS清洗2-3次，随后添加RIPA裂解液进行冰上直接裂解，离心上清即为蛋白；但是对于植物和动物组织而言，需要将组织分解成较小的组织块，液氮研磨，后续利用RIPA裂解液进行冰上裂解，相对于细胞蛋白的提取，多了一步组织样块的处理步骤。

02电泳问题Q1：大小分子蛋白各自的电泳胶浓度如何选择？小提示：1、由于SDS能够阻止蛋白与膜的结合，因此小分子蛋白转膜可不加SDS，同时甲醇浓度提高到20%；2、大蛋白易在凝胶里形成沉淀，转膜缓冲液中加入0.1%SDS，可增加蛋白的溶解性；3、由于甲醇易使SDS从蛋白上脱离，可降低甲醇的浓度（低至10%或者更低）来防止蛋白沉淀；4、推荐浓度梯度预制胶，4-20%高分辨率梯度预制胶，分离分子量范围3.5-200kD，大分子量小分子量兼顾，非常好用幺。

Western免疫印迹常见问题解答赛信通（上海）生物试做Western免疫印迹时，将膜孵育在稀释的抗体中轻轻摇动并4°C过夜。

抗体稀释在含5% 的w/v BSA或者1X TBS, 0.1% Tween-20的脱脂奶粉当中。

注意：参考一抗的产品说明书选用合适的抗体稀释液与稀释比例。

A．所需溶液与试剂注意：所有溶液用Milli-Q或者相当级别的水配制。

1. 20X 磷酸盐缓冲生理盐水(PBS):2. 1X SDS 上样缓冲液：3. 转膜缓冲液：25 mM Tris 碱, 0.2 M 甘氨酸, 20% 甲醇(pH 8.5)。

4. 10X Tris缓冲盐水(TBS):配制1L时，称取24.2g Tris碱，80g NaCl加入1L水中；调整pH为7.6（稀释至1X使用）。

5. 脱脂牛奶:6. 封闭液：含5% w/v脱脂奶粉，0.1% Tween-20的1X TBS。

配150ml时，在135ml水中兑入15ml 10X TBS，混匀；加入7.5g脱脂奶粉，使之溶解；边搅拌边加入0.15 ml Tween-20 (100%)，混匀。

7. 洗液:1X TBS, 0.1% Tween-20 (TBS/T)。

9. 一抗稀释液：含5% w/v脱脂奶粉或者BSA，0.1% Tween-20的1X TBS。

配20ml时，在18ml水中兑入2ml 10X TBS，混匀；加入1gBSA或者脱脂奶粉，使之溶解；边搅拌边加入20 μl Tween-20 (100%)，混匀。

10. Phototope®-辣根过氧化物酶Western印迹检测体系：12. 印迹膜：本套方法在硝酸纤维素膜上优化过，CST推荐使用硝酸纤维素膜。

PVDF也能够用本方法。

B．蛋白印迹样品制备的通用方法如下所述：1. 刺激细胞：加入含调节因子的新鲜培养基处理一定的时间。

2. 吸去培养基。

用PBS清洗一次，吸去洗液。

3. 加入1X SDS样品缓冲液裂解细胞(6孔板中每孔加100 μl，10cm盘中每盘加500μl)4. 超声处理10–15秒打断DNA同时降低样品的粘度。