westernblot常见问题及处理总结

免疫细胞研究western blotWestern Blot常见问题及处理总结阿木1、western blot 的优点答：灵敏，可达ng级，用Ecl显色法理论上可达pg 级。

方便，特异性高。

2、为什么我的细胞提取液中没有目标蛋白？答：原因有很多: a) 你的细胞中不表达这种蛋白质，换一种细胞；b) 你的细胞中的蛋白质被降解掉了，你必需加入PMSF，抑制蛋白酶活性；c) 你的抗体不能识别目标蛋白，多看看说明，看是否有问题。

3、我的细胞提取液有的有沉淀，有的很清亮，为什么呢？答：a) 有沉淀可能因为你的蛋白没有变性完全，可以适当提高SDS 浓度，同时将样品煮沸时间延长，b) 也不排除你的抗原浓度过高，这时再加入适量上样缓冲液即可。

4、我做的蛋白质分子量很小（10KD），请问怎么做WB？答：可以选择0.2μml的膜，同时缩短转移时间。

也可以将两张膜叠在一起，再转移。

其他按步骤即可。

5、我的目的带很弱，怎么加强？答：可以加大抗原上样量。

这是最主要的。

同时也可以将一抗稀释比例降低。

6、胶片背景很脏，有什么解决方法？答：减少抗原上样量，降低一抗浓度，改变一抗孵育时间，提高牛奶浓度。

7、目标带是空白，周围有背景，是为什么？答：你的一抗浓度较高，二抗上HRP 催化活力太强，同时你的显色底物处于一个临界点，反应时间不长，将周围底物催化完，形成了空白即“反亮现象”。

将一抗和二抗浓度降低，或更换新底物。

8、我的胶片是一片空白，是怎么回事？答：如果能够排除下面的几个问题那么问题多半出现在一抗和抗原制备上。

a) 二抗的HRP 活性太强，将底物消耗光；b) ECM底物中H2O2，不稳定，失活；c) ECL底物没覆盖到相应位置；d) 二抗失活。

9、我在显影液中显影1分钟和5分钟后,底片漆黑一片,是什么原因呢?答：a) 可能是红灯造成的, 胶片本来就被曝光了，可以在完全黑暗的情况下操作.看是否有改善.；b) 显影时间过长。

10、DAB好还是ECM好？答：DAB 有毒，但是比较灵敏，是HRP 最敏感的底物；ECM结果容易控制，但被催化时灵敏度差一点，但如果达到阀值，就特别灵敏，可以检测pg 级抗原。

（完整版）westernblot问题汇总WesternBlot问题解答1.凝胶肿胀或卷曲：注意转膜之前，切割下来的凝胶一定要在转膜缓冲液中浸泡平衡5-10分钟，要含有20%的甲醇。

2.条带歪斜、或漂移因为转膜仪使用时间太长，两块板之间的海绵由于长期使用变得很薄。

当按照阴极-海棉-滤纸-胶-膜-滤纸-海绵依次放好后两块板不能压紧，因而在胶和膜之间可能存在潜在的间隙，电转移时蛋白从胶和膜之间的空隙中流走，形成如图所示的形状。

使用十几张普通的草纸垫在两块海棉之间，条带就可以变得非常的漂亮。

另外，转膜时转膜液一定要浸没凝胶和膜，否则也可能出现上述情况。

3.单个或多个白点：转膜时在膜与胶之间有气泡。

做三明治时一定要逐层压紧，赶尽气泡。

同时转膜液要提前配置好，加好甲醇，保证转膜前夜体内气泡排净。

气泡存在的局部会抵抗蛋白转膜，降低转膜效率。

4、转膜缓冲液过热：缓冲液离子强度太低，或电压及电流过高。

按照上述方式配液，同时转膜过程中注意降温。

我在冰水混合物中转膜，效果很好。

5背景过高！1）封闭不全，我用5%-10%的光明脱脂奶粉，效果还可以，现在做基本上没什么背景。

如果你觉得不够可以加点BSA,1%吧。

2）一抗或者是封闭液与膜蛋白的交叉反应。

这种情况通常可以通过加入TWEEN-20或多次洗膜加以解决。

如果问题不能解决，那么降低一抗浓度，或更换封闭液种类可能解决3）一抗二抗中某些不纯的物质也可以造成背景。

4）抗体浓度太高，或孵育时间太常都可能遇到这种情况。

那么可以适当降低一抗二抗的浓度，或是用提高温度的方式来代替杂交时间的延长；另外，少量多次得洗膜效果要优于多量而长时间得洗膜效果。

5)曝光时间的控制。

通常我们线曝光一分钟试试，条带清晰背景也强，可以缩短曝光时间，或者过一段时间等荧光减弱以后再发光，一般也可以发出比较好的条带。

如果背景强于条带，那么肯定是前面默默个原因的一种，这是可以将膜在TBST中漂洗以下再发光，有时会有比较好的效果（仅限于国外较好的试剂盒，国产的不行，洗一下啥也没了！）这个时候可以洗膜，洗膜后重新发光。

Westernblot实验注意事项和常见问题1 我的细胞提取液有的有沉淀，有的很清亮，为什么呢？答：有沉淀可能因为你的蛋白没有变性完全，可以适当提高SDS 浓度，同时将样品煮沸时间延长；也不排除你的抗原浓度过高，这时再加入适量上样缓冲液即可。

2 我做的蛋白质分子量很小（10 KD），请问怎么做WB？答：可以选择0.2 μm的膜，同时缩短转移时间。

也可以将两张膜叠在一起，再转移。

3最后显色时用 DAB好还是ECM好？答：DAB 有毒，但是比较灵敏，是HRP 最敏感的底物；ECM结果容易控制，但被催化时灵敏度差一点，但如果达到阀值，就特别灵敏，可以检测pg 级蛋白，具体可以根据你实验的情况。

4 要验证某个细胞上有无该蛋白的存在，需要做免疫组化和western blot试验吗？做这两个试验时的一抗和二抗可以共用吗？答：①免疫组化可以用来进行定位，但是不能精确定量，而且有时会有假阳性，不易与背景区分；Western blot可以特异性检测某个蛋白质分子，进行定量，但是不能定位。

②两种实验的一抗有时候不能通用，公司的产品说明一般都会说明可以进行什么实验，在免疫组化时，是否适合石蜡切片或者冰冻切片。

5 细胞水平要做western blot，多少细胞提的蛋白够做western blot？答：一般5×106就足够了。

6 同一样品能同时提RNA又提蛋白么？这样对western blot有无影响？答：能，没有问题。

7同一蛋白样品能同时进行两种因子的Western Blot检测吗？答：当然可以，有的甚至可以同时测几十种样品。

8 蛋白变性后可以存放多久？答：－80℃，一两年没有问题。

最关键两条：不要被蛋白酶水解掉；不要被细菌消化掉（也是被酶水解了）。

9 二抗是生物素化的抗体，三抗是亲和素生物素体系，不知采用这样的方案后，封闭液是否要作调整，能否再用5％的脱脂奶粉呢？答：不能使用脱脂奶粉，因为脱脂奶粉中含生物素，用ＢＳＡ代替应该好一点。

westernblot转膜常见现象及处理方法1，转膜不充分/过转对于非小分子量尤其是大分子量（>100kd）蛋白而言，一般不会出现过转情况，转膜不充分是主要原因，增加转膜力度无非是加大电压/电流，延长时间。

但对于小分子蛋白（<30kd就要注意了，<15kd 尤其要当心）很可能出现过转，丽春红染膜或观察marker有没有穿膜可以确认，没有丽春红也可以考染转膜后的胶，如果是一片空白，则要小心了，可适当降低转膜力度。

对于低分子量一般转膜液不要加SDS以防过转，《抗体技术实验指南》提供的针对中低分子量的湿转缓与高分子量的相比也是不含SDS的。

2，封闭时间不足这一点似乎多数人都不重视，所以有时候会有些意外。

我一般室温2~4h，但4度过夜确实是最好的。

另外在平皿中摇似乎比封口膜更容易掌握并获得较好的效果，对新手似乎更好。

3，抗体与封闭液有交叉。

实际上牛奶对于多数抗体来说还是很好的，但所有二抗也都写着：与牛奶可能有交叉反应。

BSA蛋白单一，可降低因牛奶其他成分引起的背景。

单用TBST也可以，此法虽然减少了交叉，但单就封闭能力而言却也因此而降低。

4，抗原-抗体浓度过高一般10min*3次就足够了，如果不放心可按自己意志加强时间、次数、洗脱液用量。

5，暴光时间过长降低曝光时间，以牺牲敏感度为代价其最低标准是使目的条带能够正常显影，对一切原因有效，但效果局限。

6，抗原-抗体浓度过高降低抗体浓度或蛋白上样量，以牺牲敏感度为代价其最低标准是使目的条带能够正常显影，仅对膜上蛋白和一抗引起的有效。

7，转膜不良（如有气泡在胶-膜之间)主要是气泡在胶-膜之间引起的绝缘区使蛋白无法通过而不能到达膜上，这一步在操作时尤其要小心，我自己犯过，也看到其他人犯过。

我的办法是把胶铺到膜上，先使其一边接触膜的一边，这样就会在胶和膜交界的地方形成一个水相前缘，然后慢慢落下凝胶，这样这个水相前缘就会逐渐推进直至胶膜重合，如是则不会有气泡产生。

Western blot常见问题解决1. 啥也没有原因：比较多，如果单纯一张没有任何显色的X光片，可能是一抗加成其他抗体，或者二抗种属加错了，比如兔的加成鼠的。

解决办法：仔细检查抗体是否加错，确认转膜没有问题。

经验：上面的图片展示的是一点信号都没有，可能一抗，二抗加错，可能是蛋白浓度太低，上样量太少，一抗浓度过低，ECL发光液失效。

另外如果转膜出现了问题，比如膜放反了，自然是一个白片。

2. 高背景原因：封闭不够好，一抗浓度高，洗膜时间和次数不够解决办法：降低一抗浓度，增加洗膜时间和次数。

经验：高背景可能是WB中最常见出现的问题，目的条带单一清晰，但是其他地方又弥漫性较为均一的背景（比较连续的）。

其实只要我们注意操作规范，不偷工减料就很容易避免，洗膜按照规定来8min*5次或者10min*4次，不要改成5min*3次，或者10min*2次。

3. 非特异性条带原因：一抗非特异性与蛋白结合解决办法：更换一抗或降低一抗浓度经验：此种情况绝大多数是因为一抗不好，你无法判断那一条是目的条带。

如果实在没有更好的抗体，建议采用阴性对照和阳性对照来确定上述哪个条带是目的条带。

当然这种情况下也有可能是一抗浓度太高引起的非特异性结合。

4. 条带中出现边缘规则的白圈原因：电转中膜和胶之间存在气泡。

解决办法：转膜前去掉膜和胶之间的气泡经验：我们常常将电转液倒入一个盘子里，倒入的液体不能太多也不能太少，最好的高度是与放上第一层滤纸齐平，然后往滤纸上浇点转膜液，把电泳胶用清水清洗下，将电泳胶平铺到滤纸上，仔细检查滤纸与胶之间是否有气泡，可以左右前后观察，不同方向观察之后确认无气泡，然后再往胶上面浇点电转液，用两只手的拇指和食指轻轻夹住PVDF膜的两侧，使膜成U型，然后将U型的底部接触胶的中间，慢慢往两边放下膜，这样一般气泡很少。

然后上层滤纸同样用U型的放置方法，用玻璃棒稍微贴实下，然后盖上海绵。

注意不要来回赶气泡，这样反而会带入气泡。

Western Blot常见问题及处理Western印迹要想做的好，每个步骤都不能马虎，细节决定成败！做的过程中自己要多总结，用心去体会，失败不可怕，可怕的是不去总结经验和教训，成功都是从不断的失败中得来的。

注意事项：未聚合的丙烯酰胺具有神经毒性,操作时应该戴手套防护.梳子插入浓缩胶时,应确保没有气泡,可将梳子稍微倾斜插入以减少气泡的产生,梳子拔出来时应该小心,不要破坏加样孔,如有加样孔上的凝胶歪斜可用针头插入加样孔中纠正但要避免针头刺入胶内.加水液封时用100ul的枪,缓慢均匀的加,以免产生胶不均匀.电泳槽内加入电泳缓冲液冲洗清除黏附在凝胶底部的气泡和未聚合的丙烯酰胺,同时建议低电压短时间的预电泳,清除凝胶内的杂质,疏通凝胶孔径以保证电泳过程中电泳的畅通(恒压10-20V,20-30min) .加样前样品应先离心,尤其是长时间放置的样品,以减少蛋白质带的拖尾现象为避免边缘效应,可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液样品缓冲液中煮沸的样品可在-20℃存放数月,但是反复冻融会使蛋白质降解为减少蛋白质条带的扩散,上样后应尽快进行电泳,电泳结束后也应直接或者转印.上样时,小心不要使样品溢出而污染相临加样孔取出凝胶后应注意分清上下,可用刀片切去凝胶的一角作为标记(如左上角)转膜时也应用同样的方法对pvdf膜做上标记(如左上角)以分清正反面和上下关系.否则一旦弄错先后顺序会很麻烦的。

转膜前1-2个小时-20°预冷转膜液，特别是新鲜配的转膜液。

预冷后转膜效果较好。

转膜液可以重复利用，每次用的时候再加点甲醇就可以了。

转膜时，一定要将三明治各层之间的气泡赶干净，否则转膜时产热量会很大，很影响转膜效率。

离心管装满水放-20°冻好，放在转膜液中降温。

转膜完，可以通过预染marker看看转膜的情况。

有没有转过了穿到膜后的滤纸上，或者还有部分残留在胶上。

以便下次调整转膜时间和电压。

二抗浓度不宜太高否则会导致背景过高.常见问题：1．电泳中常出现的一些现象：●︶条带呈笑脸状原因：凝胶不均匀冷却，中间冷却不好; 电泳系统温度偏高。

Western Blot（蛋白质印迹）技术是生物医学研究中常用的蛋白质分析技术之一，可以用于检测蛋白质样品中的特定抗原。

然而，在进行Western Blot实验时，可能会遇到一些问题，下面列举了一些常见问题及解决方法：1.电泳条带不清晰或无条带：解决方法：•检查样品质量，确保待检测样品是可用的，无降解或污染。

•调整电泳参数，如电压、电流和时间等，以优化电泳效果。

•更换抗体，确认抗体的特异性，避免非特异性结合。

2.膜上背景过重：解决方法：•在抗体孵育之前，使用封闭剂封闭膜上的非特异性位点，减少抗体非特异性结合。

•减少一抗和二抗的浓度，减轻非特异性结合。

•增加洗涤次数和时间，以清除未结合的抗体和蛋白质。

3.目的蛋白信号弱或无：解决方法：•调整一抗和二抗的浓度，提高特异性结合的信号强度。

•选择更灵敏的显色方法，如化学发光法等。

•在转膜前，优化样品处理，如提取、纯化和浓缩等步骤。

4.非特异性条带：解决方法：•检查抗体特异性，确认抗体的特异性，更换抗体以减少非特异性结合。

•检查样品处理步骤，避免样品中的杂蛋白干扰。

•增加洗涤次数和时间，以清除未结合的抗体和非特异性结合的蛋白质。

5.显影后膜上条带处变为黄色或白色：解决方法：•可能是由于曝光时间过长或显影液浓度过高导致的，可以降低曝光时间和减少显影液浓度来解决问题。

•在膜清洗时使用甲醇或乙醇等有机溶剂，清除膜上的多余抗体和显色剂。

6.条带内无显影的白点：解决方法：•在转膜前检查是否存在气泡，气泡会影响转膜效果和条带形成。

•增加转膜时间和电流，以促进蛋白质的转移。

•检查显影液是否过期或存在质量问题。

7.存在散在小圆斑：解决方法：•这可能是由于封闭液中的杂质颗粒导致的，可以通过过滤封闭液来清除杂质。

•检查一抗和二抗是否含有杂质抗体或存在抗体污染的情况，更换抗体可以解决问题。

•检查显色液是否存在问题，如过期或存在杂质等，更换显色液可以解决问题。

8.条带变形或不均匀：解决方法：•检查电泳胶的质量和制备过程是否存在问题。

蛋白Westernblot电泳——试验中常见问题及解答蛋白质电泳与western blot1Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。

对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。

该文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术。

（1）原理（2）分类①放射自显影②底物化学发光ECL ③底物荧光ECF ④底物DAB呈色（3）主要试剂（4）主要程序（5）实验常见的问题指南 1. 参考书推荐 2. 针对样品的常见问题3. 抗体 4. 滤纸、胶和膜的问题 5. Marker 的相关疑问 6. 染色的选择7. 参照的疑问8. 缓冲液配方的常见问题9. 条件的摸索10. 方法的介绍11. 结果分析（1）原理：与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。

经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。

以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

（2）分类①放射自显影②底物化学发光ECL ③底物荧光ECF ④底物DAB呈色现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。

只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP 标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。

（3）主要试剂1、(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。

westernblot实验步骤中常见问题和处理方法Western blot 结果中背景较高 (high background):膜封闭不够/封闭液（blocking buffer）不适合：延长封闭时间，增加封闭液的浓度；尝试不同种类的封闭液，对比结果后选出效果最佳的。

洗膜不够彻底：增长洗涤时间；增加洗涤剂的浓度。

一抗/二抗(primary/secondary antibodies) 稀释度不适宜：对抗体进行滴度测试（titre test），选择最适宜的抗体稀释度。

一抗是多克隆抗体 (polyclonal antibody): 特异性降低，可能与其他蛋白结合，建议换用单克隆抗体（monoclonal antibody）。

膜在实验过程中干过: 实验过程中要切记保持膜的湿润。

检测时曝光时间过长: 减少曝光时间。

Western blot 结果中杂带较多 (multiple/non-specific bands):目的蛋白有多个修饰位点（磷酸化位点（phosphorylation site）、糖基化位点(glycosylation site)、乙酰化位点(acetylation site) 等），本身可以呈现多条带。

样本处理过程中目的蛋白发生降解(protein degradation): 加入蛋白酶抑制剂 (protease inhibitor)；样本处理时在冰上操作; 避免/减少样本的冻融循环（free-and-thaw cycle）。

样本处理过程中目的蛋白发生聚集（protein aggregation）：增加DTT的浓度；增长加热的时间。

上样量（sample loading）/ 样本浓度过高：适当减少上样量/样本浓度。

一抗是多克隆抗体 (polyclonal antibody): 特异性降低，可能与其他蛋白结合，建议换用单克隆抗体（monoclonal antibody）。

一抗/二抗不纯：纯化抗体；购买高纯度抗体。

Western blot发光检测中常见的问题及解决方法免疫印迹试验（Western blot）是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法，被广泛应用于蛋白表达水平的研究、抗体活性检测和早期疾病诊断等多个方面。

其中较为简单也为大家所普遍接受的Western blot显色方法为底物化学发光法ECL，文章根据发光检测中常见的几种问题现象与各位生物人一起探讨。

众所周知，Western blot的原理是蛋白质在电力场的作用下，由大到小的进行排列，利用电泳进行分离和富集。

拥有抗原表位的蛋白质分子被抗体（一抗）特异性识别并与之结合。

在此基础上，酶或荧光标记的二抗识别并结合一抗，通过与底物反应显色来观察目的蛋白。

Western blot显色的方法主要有以下几种：一、放射自显影，二、底物化学发光ECL，三、底物荧光ECF，四、底物DAB呈色。

现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色。

大部分Western blot显色底物是化学发光底物，发表文章通常也是用底物化学发光ECL。

ECL法检测辣根过氧化物酶的原理是辣根过氧化物酶在H2O2存在下，氧化化学发光物质鲁米诺（lumino，氨基苯二酰一肼）并发光，在化学增强剂存在下光强度可以增大1000倍，通过将印记放在照相底片上感光就可以检测辣根过氧化物酶的存在。

ECL法操作简便，应用现成的试剂盒，按照说明，将两种显色底物等体积混合后将其覆盖在膜表面使其均匀，用玻璃胶片把膜包起来，马上在暗室中将X光片覆盖在膜的上面，显影、定影（或用荧光检测仪检测）。

ECL 法具有灵敏度高，线性范围广等特点。

图1 ECL检测原理图Western blot发光检测受多种因素影响，主要包括：抗原含量，抗体敏感度，底物敏感度，显影和定影效率，等。

现根据检测中几种常见的现象问题进行分析：1.目的蛋白信号弱或无。

在Western blot发光检测中常见的问题之一就是目的蛋白信号弱或无。

首先考虑是否转膜不充分/过转，如果是，则要优化转膜条件；其次，在转膜合适的前提下考虑是否抗体-抗原敏感性过低，也可能是底物HRP或底物活性降低，可以通过加大上样量/提高抗体浓度/使用敏感底物/延长压片时间解决。

Western blotting 常见问题分析SDS-PAGE凝胶电泳常见的问题分析Western Blotting实验流程第一步：蛋白样品制备蛋白抽提质量的好坏直接决定着Western结果的好坏，因此，根据标本类型和检测类型选择合适的蛋白制备方法是至关重要的。

作为沃尔森的优势产品，我们为您提供RIPA改良型试剂盒以提取细胞或组织的总蛋白。

RIPA改良型试剂盒（WB0001，WB0002）中提供蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、裂解缓冲液Lysis Buffer、PMSF等，可在非变性条件下从哺乳动物组织和培养细胞中提取总蛋白，获得的总蛋白可用于Western Blotting、免疫共沉淀等后续研究。

第二步：蛋白定量为确保每个蛋白样品的上样量一致，收集的蛋白样品均应测定蛋白浓度。

蛋白浓度的测定方法，应根据组织细胞裂解或匀浆所使用的方法及裂解液的不同选用，因为去垢剂和还原剂等对不同蛋白浓度测定方法的影响差别很大。

如使用沃尔森公司生产的RIPA改良型试剂盒，建议您使用BCA法测定蛋白浓度（WB0003，WB0004）。

第三步：电泳(1) SDS-PAGE凝胶配制沃尔森的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒（WB0006）提供了所需的试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方，我们也为您提供了制胶所需的各种组分：30% Acr-Bis(29:1)（WB0014）； 40% Acr-Bis(39:1)（WB0015）；PMSF(100mM)（WB0016）；0.5M Tris-HCl,pH6.8（WB0017）； 1.5M Tris-HCl,pH8.8（W0018）。

(2) 样品处理每80μL样品加入20μL的5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（WB0005），混匀。

置于100℃的水浴加热10min，14000g离心20min，取上清液进行电泳。

(3) 上样与电泳第四步：转膜转膜缓冲液可以参考《分子克隆》自行配制。

W estern Blot实验中为什么检测无信号？（白板）大概总结为一下几类原因：（1）样品中目的蛋白丰度很低，低于实验的检测下限（2）一抗不识别检测物种的蛋白，同时若有阳性参照的话提供阳性对照蛋白，若阳性对照正常则说明抗体及实验参照没有问题，可能是样本中目的蛋白含量比较低。

（3）蛋白降解（4）待测样品的确为阴性；（5）一抗失效；（6）抗原量不足，每泳道蛋白上样量不低于0.1ugWestern Blot实验中为什么检测的结果分子量大小与实际不符？（1）蛋白存在翻译后修饰—比如蛋白的磷酸化，糖基化等，这些都会增加蛋白的分子量大小。

（2）蛋白存在翻译后剪切—比如很多蛋白首先被合成为前体形式，然后通过剪切获得生物学活性（3）剪接变异体—相同的基因，经过选择性剪接会产生不同分子量大小的蛋白。

（4）相对电荷—氨基酸的组成（带电或不带电）（5）蛋白形成多聚体—比如蛋白二聚体。

为什么wb的结果与QPCR结果趋势不一样？（1）WB反映的是蛋白水平的结果，qpcr反映的是基因水平的结果。

理论上蛋白水平与基因水平是一致的，但是mRNA的高低不代表其表达蛋白的高低。

也有一些基因可能在组织样品中没有正常翻译（或发生泛素化修饰，修饰水平不一致），这样即使qpcr检测结果有表达，但是若蛋白没有正常翻译的话，WB则检测不到目的条带。

为什么检测结果有很多杂带？（1）可能是样品本身体内表达的蛋白具有多种修饰形式如糖基化、磷酸化、乙酰化等；（2）蛋白降解，导致蛋白分子量降低；（3）蛋白形成多聚体形式；为什么WB检测的背景比较高？（1）可能抗体浓度浓度较高，（2）抗原量较大。

（3）一张膜中有的目的条带较弱，为了能让较弱条带显示出来，曝光时间较长转膜后蛋白少或者没有可能原因（1）转膜板放置出问题（2）凝胶与膜接触不好（3）目的蛋白被其他高丰度蛋白掩盖，如白蛋白, IgG等Western Blot实验中为什么选择内参？内参即是内部参照（Internal Control），对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白(Housekeeping Proteins)，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。

常见问题及解答：1、两快玻璃板之间灌胶,胶为什么总是不平1) 你的玻璃洗干净没有应该要洗得非常干净！2) 过硫酸铵和TEMED的加量不合适，加量相对较多，凝胶凝固过快也会胶不平，最多按照分子克隆加倍3) 加完试剂以后没有很好的摇匀，导致有些部位的聚合剂浓度过高，聚合相对较快造成胶不平；4) 稍微注意手法，均匀加入5) 灌胶后应该用水或者正丁醇压胶面或用20%的乙醇封顶(没有毒性可以除气泡，使用效果极好）。

战友小新723认为：“第一天灌胶后，用乙醇直接压，待乙醇挥发完毕后，上面加一层水，第二天电泳用，效果很好。

不用正丁醇，乙醇比正丁醇效果要好多了”。

6) 边缘胶是不容易聚合完全的，灌完胶后要立即加无水正丁醇覆盖，浓度越低的胶越不要使用双蒸水压顶，另外还可以在压顶试剂如正丁醇中添加少许AP来增加边缘胶的凝聚强度7) 温度也是影响胶聚合的重要因素，我们有些同学为了让胶更快的凝固而把胶放到50度的温箱，由于受热不均匀，造成胶聚合不均匀。

【2、胶为什么总是漏1）每次电泳完后，洗净玻璃、胶条和其它附件，下次用之前，用75％酒精擦拭玻璃和胶条，能有效防漏，且利于剥胶。

2）避免玻璃边缘（与胶条接触处）破损很重要，尤其是下面和胶条接触的地方3）关键是找一块很平的桌面，使两块玻璃底面非常齐就行了4）胶条一定要干，跑完电泳后，胶条就放在实验台上晾着。

5）下面的胶条注意不要老化，如果有裂纹的话用保鲜膜垫在上面，也可以有效防止漏胶，或者反过来用6）玻璃在使用过程中容易造成小的缺口，从而导致封条无法完全密封，装好架子后，在玻璃底边上抹上一层薄薄的凡士林就好了，两边多点（容易从两边漏）这样就不会漏了，就算是用了很久的很多小缺口的玻璃都没有问题，然后转移到电泳槽的时候，去掉封条，把底上的凡士林擦干就OK了（注意，一定要擦干净，尤其是少量进入了两隔玻璃之间空腔的，赢伟凡士林不导电，会影响第2相的效果的7）你可以在海绵垫下再垫一些纸，使得它与玻璃贴的更紧密。