DNA重组（DNA recombination）技术：DNA重组的载体-2
二、噬菌体载体
作为细菌寄生物的噬菌体，大多数具有编码多种蛋白质的基因，能利用宿主细胞的蛋白质合成体系，进行生长和增殖。构建的噬菌体载体，以λ噬菌体、M13和粘粒最为常用。
㈠ λ噬菌体载体
野生型λDNA是一种基因组为4.8 kb的线性双链DNA，全部序列已知，共编码50多个基因。其中约一半基因参与了噬菌体的生命周期活动，称为必需基因；另一部分基因，当被外源基因取代后，并不影响噬菌体的生命功能。另外，在分子两端各有12个碱基的互补单链，是天然的粘性末端，称cos位点。
野生型的λ噬菌体是一种中等大小的温和噬菌体，即既能进入溶菌性生命周期又能进入溶源性生命周期。λ噬菌体感染细菌后，λDNA通过粘性末端而环化。既可溶菌性生长（裂解），即λDNA在宿主中多次复制并合成大量基因产物，装配成噬菌体颗粒，最后裂解宿主菌；又可以溶源性生长，即λDNA整合到宿主染色体基因组DNA中，与之一起复制并遗传给子代，但宿主细胞不被裂解。裂解途径和溶源途径的选择取决于宿主与噬菌体之间的许多因素的相互作用，以及噬菌体基因组的精确调控。
λ噬菌体具有二个重要特征，使之成为一类重要的、很有价值的基因克隆载体。①除必需基因外的功能相关（溶源生长和重组）基因成簇排列在一起位于中间部分，约占全基因组的30%，不是溶菌生长所必需的。因此，该区可缺失或作外源DNA的插入区。②噬菌体颗粒成熟的包装过程（外壳蛋白包装DNA），只要重组DNA不小于野生型λDNA全长75%和大于105%，均可被包装成具有噬菌体活性的成熟颗粒。因此大约可插入长达15kb的外源DNA。
当外源DNA片段克隆到插入型载体上，噬菌体便丧失某些生物学功能，即插入失活效应。又可分为免疫功能失活的和β-半乳糖苷酶失活的两种亚型。①免疫功能失活的插入型载体。插入位点位于基因组中的免疫编码区，外源DNA片段插入后，就会使载体合成阻遏蛋白的能力被破坏，导致不能进入溶源生长周期。因此凡有外源DNA插入的λ重组体都会形成清晰的噬菌斑，而未有外源DNA插入空载体则形成混浊的噬菌斑。这种形态上的差别，为分离阳性重组体提供了方便的选择标记。②大肠杆菌β-半乳糖苷酶失活型载体。插入位点位于基因组中的β-半乳糖苷酶（LaZ）编码区，因此可通过蓝白斑实验筛选。对于替换型载体，当外源DNA插入时，一对克隆位点间的基因组DNA被替换（取代），从而丧失某些生物学功能，造成重组体与空载体形成噬菌斑形态（清晰和混浊）或颜色（蓝白斑实验）差别，这种差别即可作为筛选标记。
M13噬菌体
M13 phage
一种丝状噬菌体，可感染含F因子的大肠杆菌细胞。
遗传学（一级学科）；分子遗传学（二级学科）
M13噬菌体是一种丝状噬菌体，内有一个环状单链DNA分子，长6407个核苷酸，含DNA复制和噬菌体增殖所需的遗传信息。M13DNA的复制起始位点定位在基因间隔区内。但是基因间隔区的有些核苷酸序列即使发生突变、缺失活插入外源DNA片段，也不会影响M13DNA的复制，这为M13DNA构建克隆载体提供了条件。
其中M13mp系列对野生型M13加以改造，插入了多克隆位点和
LacZ基因，可容纳外源DNA300-400bp，可用于制备DNA测序时用的单链模板和核酸探针。
它是一种质粒载体。
M13噬菌体在感染雄性大肠杆菌（F+或Hfr）时，都是以一端吸附在F型菌毛的顶端，所以称为F特异性丝状噬菌体。而对雌性大肠杆菌（F-）不敏感。所以Hfr型的大肠杆菌和携带F'质粒的大肠杆菌都能被感染
相关应用配置：M13噬菌体单链基因组DNA快速提取试剂盒
相关例子：兔抗M13噬菌体酶标抗体的制备，M13噬菌体已被广泛地应用于噬菌体展示技术。M13的酶标抗体,是在噬菌体展示技术筛选结果ELISA检测中不可缺少的试剂。我们制备了兔抗M13抗血清,其效价高于1:6000;经两步饱和硫酸铵沉淀,初步纯化了兔抗M13抗体;用过碘酸钠法对抗体进行了辣根过氧化酶的标记,酶标记抗体活性为1:6400。
噬菌体释放方式： M13噬菌体溶源性，不裂解宿主菌。极大地简化了每轮淘选过程中的噬菌体纯化步骤，只用简单的PEG沉淀方法即可。
融合方式：M13噬菌体N端与pIII蛋白融合，不适合克隆cDNA，因为cDNA中为oligo
d(T))常位于翻译终止密码子的下游。
融合序列大小：M13噬菌体展示肽库为7肽、12肽和环7肽
NEBM13噬菌体展示肽库可用于定位抗原决定簇， 确定蛋白质相互作用位点， 鉴定酶的底物或抑制物，
７８４ 中国人兽共患病学报 Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｚｏｏｎｏｓｅｓ
文章编号：１００２—２６９４（２Ｏ１０）０８—０７８４—０３
化脓性链球菌毒力演化的载体——噬菌体
庞亮亮，孙建和
中图分类号：Ｒ３７８ 文献标识码：Ａ 化脓性链球菌等细菌会因基因变异，导致毒力
增强。长期以来，左右基因变异的因素一直是科学
家所关注的热点。由于噬菌体与其宿主菌的密切关
系，推测其在细菌的演化过程中发挥了重要作用。
Ｍ１Ｔ１菌株虽在侵袭性感染和非侵袭性感染中均可
普遍分离获得，但与严重的侵袭性感染似乎有着更
紧密的联系。基因水平的研究发现，该菌株的高毒
力可能与前噬菌体有关，噬菌体与宿主菌的不完整
性重组，使噬菌体在细菌的演化中扮演了一个非常
重要的角色 。
１ 化脓性链球菌的病原学
化脓性链球菌又称Ａ群链球菌（ＧＡＳ或
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ），属于革兰氏阳性菌、厚壁
菌门、链球菌属。基于菌群Ｍ表面蛋白的抗原多样
性和ｅｍｍ基因的多态性 ，这类菌群有超过１００种
类型。
化脓性链球菌无芽孢，有荚膜。链球菌抗原结
构复杂，细胞壁成分中的Ｍ蛋白与致病有关，是Ａ
群细菌的主要致病因子，它有抗吞噬作用，对中性粒
细胞和血小板有免疫毒性，并能使细菌粘附或寄居
于上呼吸道粘膜上，缺失Ｍ蛋白的菌株无致病性。
Ａ群链球菌感染后机体可产生抗Ｍ蛋白的抗体，且
可保持多年。
化脓性链球菌致病因素除与上述菌体成分有关
外，还与细菌产生的毒素和酶有关。化脓性链球菌
是一种严格的人类病原菌，通常定居在喉咙或皮肤
但不造成疾病。它是致病力最强的链球菌之一，能
产生多种毒素，可引起急性咽炎、呼吸道感染、脓疱
病、软组织感染、丹毒。 、心内膜炎和脑膜炎等，产毒
株还可引起猩红热。该群细菌可致感染后的变态反
应性疾病，如急性肾小球肾炎、风湿热等。宿主的遗
传易感性和细菌毒力特性决定着感染的严重性。
目前青霉素和其他ｆ３。内酰胺类抗生素对化脓
利用栏目的噬菌体作为载体构建基因文库的步骤
构建基因文库的基本方法:
①将特定生物体的因组DNA或cDNA分解成适当大小的DNA片段，然后分别与克隆载体连接成重组DNA分子。
②通过转化或转导的方法将带有不同DNA片段的重组DNA分子导入受体细胞，获得一套包含特定生物体所有DNA序列的克隆。
用λ噬菌体载体构建基因组文库的步骤:
①准备载体DNA（如置换型λ噬菌体载体），用适当的限制性内切核酸酶消化并分离得到载体的左右两臂。
②纯化真核细胞高分子质量DNA，并用适当的限制性内切核酸酶部分消化。
③分离适当大小的基因组DNA片段（20-24kb）。
④连接载体与外源DNA。
⑤连接产物体外包装及感染。
⑥基因组文库的扩增。
