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基因工程载体体外获得的任一DNA片段,必须插入到能够自我复制的载体内,再转入宿主细胞,才能得到复制和进行表达。
基因工程载体(Vectors)确实是携带外源基因进入受体细胞进行繁育和表达的一种工具。
载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件基因工程中3种要紧类型的载体：1.质粒载体2.噬菌体载体3.柯斯质粒〔cosmid〕载体基因工程对载体的要求〔1〕在宿主细胞内能独立复制。
〔2〕有选择性标记。
〔3〕有一段多克隆位点。
外源DNA插入其中不阻碍载体的复制。
〔4〕分子量小，拷贝数多。
〔5〕容易从宿主细胞中分离纯化。
第一节质粒(plasmid)载体质粒是一种独立于染色体外的双链闭环的DNA分子，具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。
质粒的复制和转录要依靠于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞那么不能存活，而宿主即使没有它们也能够正常存活。
(一)质粒的构形环形双链的质粒DNA在提取过程中通常显现三种不同的构型：①共价闭合环形DNA〔cccDNA〕②开环DNA〔open circular,ocDNA〕③线形DNA〔linear,lDNA〕〔二〕质粒的转移性指质粒从一个细胞转移到另一个细胞的特性。
接合型质粒：除了带有自我复制所必需的遗传信息外，还带有一套操纵细菌配对和质粒接合转移的基因。
如：F质粒〔性质粒或F因子〕甚至能使寄主染色体上的基因随其一道转移到原先不存在该质粒的受体菌中。
不符合基因工程的安全要求。
非接合型质粒：带有自我复制所必需的遗传信息，但失去了操纵细菌配对和质粒接合转移的基因，因而不能从一个细胞转移到另一个细胞。
如R质粒〔抗性质粒〕、Col质粒〔细菌素养粒〕。
符合基因工程的安全要求。
R质粒：带有一种或数种抗生素抗性基因，使寄主获得同样的抗生素抗性性状〔resistance〕。
Col质粒：细菌素通过与敏锐细菌细胞壁的结合作用，抑制一种或数种细胞生命过程。
目录第一章基因与基因工程第一节基因研究的发展第二节基因的现代概念第三节基因工程的诞生及其主要的研究内容第二章基因操作的主要技术原理第一节核酸的凝胶电泳第二节核酸分子杂交第三节细菌转化1.肺炎球菌的转化2.大肠杆菌的转化3.细菌转化频率第四节DNA核苷酸序列分析第五节基因的化学合成第六节基因定点突变第七节基因扩增第八节研究DNA与蛋白质相互作用的方法第三章基因克隆的酶学基础第一节核酸内切限制酶与DNA分子的体外切割1.寄主控制的限制与修饰现象2.核酸内切限制酶的类型3.I 型和III型核酸内切限制酶的基本特性4.II型核酸内切限制酶的基本特性[1].基本特性[2].同裂酶[3].同尾酶[4].限制片段末端的连接作用5.核酸内切限制酶的命名法6.影响核酸内切限制酶活性的因素[1].DNA的纯度[2].DNA的甲基化程度[3].酶切消化反应的温度[4].DNA分子的结构[5].核酸内切限制酶的缓冲液7.核酸内切限制酶对DNA的消化作用[1].核酸内切限制酶与靶DNA识别序列的结合模式[2].核酸内切限制酶对DNA分子的局部消化作用[3].核酸内切限制酶对真核基因组DNA的消化作用第二节DNA连接酶与DNA分子的体外连接1.DNA连接酶2.粘性末端DNA片段的连接3.平末端DNA片段的连接[1].同聚物加尾法[2].衔接物连接法[3].DNA接头连接法4.热稳定的DNA连接酶[1].寡核苷酸连接测定法[2].连接酶链式反应(LCR)第三节DNA聚合酶1.DNA聚合酶I与核酸杂交探针的制备[1].DNA聚合酶I[2].DNA缺口转移[3].DNA杂交探针的制备2.大肠杆菌DNA聚合酶I 的Klenow片段与DNA末端标记3.T4 DNA聚合酶和取代合成法标记DNA片段4.依赖于RNA的DNA聚合酶与互补DNA的合成5.T7 DNA聚合酶6.修饰的T7 DNA聚合酶第四节DNA及RNA的修饰酶1.末端脱氧核苷酸转移酶与同聚物加尾2.T4多核苷酸激酶与DNA分子5’-末端的标记3.碱性磷酸酶与DNA脱磷酸作用第五节核酸外切酶1.核酸外切酶VII (exo VII)2.核酸外切酶III (exo III)3.λ核酸外切酶(λ exo)和T7基因6核酸外切酶第六节单链核酸内切酶1.S1核酸酶与RNA分子定位2.Bal1 核酸酶与限制位点的确定第四章基因克隆的质粒载体第一节质粒的一般生物学特性1.质粒DNA2.质粒DNA编码的表型3.质粒DNA的转移[1].质粒的类型[2].F质粒[3].质粒DNA的接合作用4.质粒DNA的迁移作用5.质粒DNA的复制类型6.质粒DNA的不亲和性[1].质粒的不亲和性现象[2].质粒不亲和性的分子基础7.第二节质粒DNA的复制与拷贝数的控制1.质粒DNA复制的多样性2.ColE 1质粒DNA复制的启动3.质粒DNA拷贝数的控制[1].天然质粒拷贝数的控制[2].杂种质粒拷贝数的控制4.质粒复制控制的分子模型[1].抑制蛋白质稀释模型[2].自体阻遏蛋白质模型5.第三节质粒DNA的分离与纯化1.氯化铯密度梯度离心2.碱变性法3.微量碱变性法4.影响质粒DNA产量的因素[1].寄主菌株的遗传背景[2].质粒的拷贝数与分子大小5.第四节质粒载体的构建与类型1.天然质粒用作克隆载体的局限性2.质粒载体必须具备的基本条件3.质粒载体的选择记号[1].高拷贝数的质粒载体[2].低拷贝数的质粒载体[3].失控的质粒载体[4].插入失活型的质粒载体[5].正选择的质粒载体[6].表达型的质粒载体4.第五节重要的大肠杆菌质粒载体1.pSC101 质粒载体[1].应用pSC101 质粒作基因克隆载体的实例一---葡萄球菌质粒基因在大肠杆菌中的表达[2].应用pSC101 质粒作基因克隆载体的实例二---在大肠杆菌中克隆非洲爪蟾2.Col 1质粒载体3.pBR322质粒载体[1].pBR322质粒载体的构建[2].pBR322质粒载体的优点[3].pBR322质粒载体的改良[4].应用pBR322质粒作为基因克隆载体的实例---水稻夜绿体光诱导基因psbA的结构分析4.pUC 质粒载体[1].pUC 质粒载体的结构[2].pUC 质粒载体的优点5.其他重要的质粒载体[1].丧失迁移功能的的质粒载体[2].能在体外转录克隆基因的质粒载体[3].穿梭质粒载体第六节质粒载体的稳定性问题1.质粒载体不稳定性的类型[1].结构的不稳定性[2].分离的不稳定性2.影响质粒载体稳定性的主要因素[1].新陈代谢负荷对质粒载体稳定性的效应[2].拷贝数差度对质粒载体稳定性的影响[3].寄主重组体系对质粒载体稳定性的效应3.随机分配的分子机理[1].通过精巧的控制环路使质粒拷贝数的差度限制在最低的水平[2].通过位点特异的重组作用消除天然质粒的寡聚体[3].通过调节细胞的分裂活动阻止无质粒细胞的产生[4].大肠杆菌素的合成增进了质粒的稳定性4.主动分配的分子机理[1].分配区的结构与功能[2].预配对模型[3].二聚体的解离有助于质粒的主动分配[4].寄主致死功能对质粒稳定性的效应5.第五章噬菌体载体和柯斯载体第一节噬菌体的一般生物学特性第二节λ噬菌体载体第三节柯斯质粒载体第四节单链DNA噬菌体载体第五节噬菌体载体第六章基因的分离与鉴定第一节DNA克隆片段的产生与分离1.基因组DNA克隆片段的产生与分离2.DNA片段的大小分部3.编码目的基因的克隆片段的富集第二节重组体DNA分子的构建及导入受体细胞1.外源DNA片段同载体分子的重组[1].外源DNA片段定向插入载体分子[2].非互补粘性末端DNA分子间的连接[3].最佳连接反应2.重组体分子导入受体细胞的途径[1].重组体DNA分子的转化或转染[2].体外包装的λ噬菌体的转导第三节基因克隆的实验方案1.互补作用基因克隆2.cDNA基因克隆[1].cDNA文库的建立[2].不同丰度mRNA的cDNA克隆[3].全长cDNA的合成[4].cDNA克隆的优越性3.基因组DNA克隆[1].应用 噬菌体载体构建基因组文库[2].应用柯斯质粒载体构建基因组文库4.基因定位克隆[1].拟南芥菜简介[2].RFLP分子标记[3].RFLP作图的原理与步骤[4].染色体步移[5].大尺度基因组物理图谱的构建第四节克隆基因的分离1.应用核酸探针分离克隆的目的基因[1].核酸探针的来源[2].寡核酸探针的的人工合成[3].假阳性克隆的克服2.应用差别杂交或扣除杂交法分离克隆的目的基因[1].差别杂交[2].差别杂交的局限性[3].扣除杂交3.应用mRNA差别显示技术分离克隆的目的基因[1].mRNA差别显示的原理[2].mRNA差别显示的基本过程[3].mRNA差别显示的局限性4.引用表达文库分离克隆的目的基因5.酵母双杂交体系[1].酵母双杂交体系的基本原理[2].酵母双杂交体系的寄主菌株[3].酵母双杂交体系的实验程序第五节重组体分子的选择与鉴定1.遗传检测法[1].根据载体表型特征选择重组体分子的直接选择法[2].根据插入序列的表型特征选择重组体分子的直接选择法2.物理检测法[1].凝胶电泳检测法[2].R-检测环法3.菌落或噬菌斑杂交筛选法4.免疫化学检测法[1].放射性抗体检测法[2].免疫沉淀检测法[3].表达载体产物之免疫化学检测法5.DNA蛋白筛选法6.转译筛选法[1].杂交抑制的转译[2].杂交选择的转译第七章基因的表达与调节第八章真核基因在大肠杆菌中的表达第一节真核基因的大肠杆菌表达体系第二节大肠杆菌的表达载体第三节克隆的真核基因在大肠杆菌中的表达第四节影响克隆基因在大肠杆菌中表达效率的因素第九章植物基因工程第十章哺乳动物基因工程第一节哺乳动物基因转移的遗传选择标记第二节外源DNA导入哺乳动物细胞的方法第三节SV 40病毒载体第四节反转录病毒载体第五节其他的病毒载体第十一章重组DNA与现代生物技术第十二章重组DNA与医学研究第一章基因与基因工程第一节基因研究的发展第二节基因的现代概念第三节基因工程的诞生及其主要的研究内容1.质的新组合，并使之参与到原先没有这类分子的寄主细胞内，而能够持续稳定的繁殖。
第七讲噬菌体载体与柯斯载体吴乃虎中国科学院遗传与发育生物学研究所2005年8月目录一、噬菌体的一般问题1．何谓噬菌体2．噬菌体效价测定与双层平板法3．噬菌体的生命周期4．噬菌体的溶源生命周期5．超感染免疫6．溶源性的诱发7．Campbell模型二、λ噬菌体载体1．λ噬菌体的生物学概述2．λ噬菌体载体的构建(1)λ噬菌体载体构建的基本原理(2)插入型载体(3)替换型载体3．λ噬菌体载体的改良(1)Spi-正选择的λ噬菌体载体(2)具有内删除特性的λ噬菌体载体4．λ重组体DNA分子的体外包装(1)λ重组体DNA的转染作用(2)λ噬菌体的体外包装5．λ噬菌体DNA的包装限制问题(1)包装限制的概念(2)包装限制与λ噬菌体的克隆能力(3)包装限制的生物学意义6．λ重组体分子的选择方法(1)cI基因功能选择法(2)lacZ基因功能选择法(3)Spi-选择法三、柯斯质粒载体1．柯斯质粒的定义及其构建(1) 噬菌体的克隆能力(2)柯斯质粒载体定义(3)柯斯质粒pHC79的构建(4)柯斯质粒克隆能力及其组成2．柯斯质粒载体的特点3．柯斯质粒载体的改良4．柯斯克隆(1)定义(2)理论依据(3)柯斯质粒包装条件(4)柯斯克隆程序(5)柯斯克隆的优点5．柯斯克隆的改良(1)柯斯克隆的局限性及其克服办法(2)Ish-Horowicz-Burke克隆方案(3)Bates-Swift克隆方案噬菌体载体与柯斯质粒载体一、噬菌体的一般问题1．何谓噬菌体？(1)定义噬菌体英文名为Bacteriophage，简称phage，来源于希腊文“phages”，系指吞食之意，乃是一类细菌病毒的总称需要指出的是，“phage”这个英文单词既是单数又是复数形式。
作单数使用时是指一个噬菌体，如试管中含1个T4 phage；而用作复数使用时，则是指同一种噬菌体的众多颗粒，如试管中含有上百个的T4 phage。
“phages”是噬菌体的复数词，是指多种不同的噬菌体。
λDNAλDNA,就是λ噬菌体中的DNA，但是λDNA也分很多种情况的，有正常的，有突变的，还有整合了宿主染色体的。
λDNA是一种溶原性的染色体序列，可以整合到宿主的染色体组上，也可以脱离下来，他的整合和脱离所产生的失误可产生宿主的基因重组现象，所以可以用于局限转导，是一种基因转化的载体。
柯斯质粒载体目录一.柯斯质粒载体的来源二．柯斯质粒载体的特点三．柯斯克隆四．柯斯克隆的优点一.柯斯质粒载体的来源1978年由collins和hohn改建的一种新型大肠杆菌克隆载体，用正常的质粒与噬菌体λ的cos位点构成。
“cosmld”一词是由英文“cos site-carrying plasmid”缩写而成的，其原意是指带有粘性末端位点（cos）的质粒。
所谓柯斯质粒，乃是一类由人工构建的含有λ DNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。
诸如右图所示的柯斯质粒载体pHC79，就是由λ DNΑ片段和pBR322质粒DNA联合组成的。
一般长度4~6kb。
含有Amp和Tet选择标记基因。
其上的cos位点可识别噬菌体外壳蛋白。
凡具有cos位点的任何DNA分子只要在长度上相当于噬菌体的基因组，就可以同外壳蛋白结合而被包装成类似噬菌体λ的颗粒。
因此，插入柯斯质粒载体的外源DNA片段的长度可大于40kb，从而大大增加了载体的携带能力。
二．柯斯质粒载体的特点柯斯载体的特点大体上可归纳成如下四个方面：第一，具有λ噬菌体的特性。
柯斯质粒载体在克隆了合适长度的外源DNA，并在体外被包装成噬菌体颗粒之后，可以高效地转导对λ噬菌体敏感的大肠杆菌寄主细胞。
第二，具有质粒载体的持性。
柯斯质粒载体具有质粒复制子，因此在寄主细胞内能够像质粒DNA一样进行复制，并且在氯霉素作用下，同样也会获得进一步的扩增。
此外，柯斯质粒载体通常也都具有抗菌素抗性基因，可供作重组体分子表型选择标记。
第三，具有高容量的克隆能力。
柯斯质粒载体的分子仅具有一个复制起点，一两个选择记号和COS位点等三个组成部分，其分子量较小，一般只有5～7kb左右。
