胡萝卜的植物组织培养王晶

山西师范大学学报(自然科学版)第18卷第2期Journal of Shanxi Teacher c s University Vol.18No.2 2004年6月Natural Science Edition June2004文章编号:1009-4490(2004)02-0071-06胡萝卜愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养研究尹文兵,李丽娟,黄勤妮,李艳红(首都师范大学生物系,北京100037)摘要:分别以胡萝卜子叶、下胚轴和直根形成层为外植体诱导出愈伤组织,并建立细胞悬浮系.实验结果表明:胡萝卜下胚轴是诱导愈伤组织和进行细胞悬浮培养的理想外植体;诱导松散型愈伤组织的最佳激素浓度配比是1.0mg/L2,4-D+0.5mg/L KT;细胞悬浮培养细胞最佳起始密度为1.125@104个/mL~2.325@104个/50mL时,7d~9d为对数生长期;继代培养4代~5代时,可得到稳定的悬浮细胞系.关键词:胡萝卜;组织培养;细胞悬浮培养;松散型愈伤组织;生长曲线中图分类号:S631.2文献标识码:A胡萝卜(Daucus carota L.),属于十字花科植物,是一种十分重要的蔬菜作物,由于其营养价值高,及其适于生食、加工、烹调等多种用途,在世界范围内广泛栽培.中国是农业大国,胡萝卜作为蔬菜作物在人们生活中起着重要的作用.因此,加快我国胡萝卜育种研究以成为迫切需要[1].近些年来,随着生物技术与分子生物学技术的快速发展,作为生物技术研究的理想材料,许多国家对胡萝卜体细胞杂交技术、遗传转化与再生技术、分子标记与基因克隆技术进行了广泛深入的研究.我国科研工作者在胡萝卜的生物技术与分子生物学研究上也取得了一定进展,特别是在组织培养、原生质体融合[2]、遗传转化及再生等方面.但是在胡萝卜细胞培养方面并不是太多,因此继续深入研究还是很有必要的.本文对胡萝卜愈伤组织诱导的最佳培养基和细胞悬浮培养的条件进行探讨,为其次生代谢产物A-胡萝卜素、B-胡萝卜素的生产以及将来的工厂化和分子生物学研究打下基础.1材料和方法1.1材料来源胡萝卜种子由中国农科院蔬菜所提供.1.2方法收稿日期:2004-03-22作者简介:尹文兵(1979)),男,山西安泽人,首都师范大学在读硕士研究生,主要从事功能基因组学方面的研究.72山西师范大学学报(自然科学版)2004年1.2.1胡萝卜愈伤组织的诱导(1)以胡萝卜子叶和下胚轴为外植体诱导[2].将胡萝卜种子搓去种毛,然后在75%的酒精中消毒5min,无菌水冲洗一遍后,用0.1%的升汞消毒10min,接着用无菌水漂洗一遍,再用无菌水浸泡30min,最后用无菌水漂洗一遍,接种在无激素的MS培养基上.10d左右种子开始萌发,待两片子叶伸展,而心叶刚刚显露时,将幼苗的下胚轴和子叶切成0.3c m 左右的小段,接种在附加植物激素1.0mg/L2,4-D,1.0mg/L2,4-D+0.5mg/L KT,2.0mg/L 2,4-D,2.0mg/L2,4-D+0.5mg/L KT的MS培养基的三角瓶中,培养30天左右,即可诱导出愈伤组织.继代培养时,将老的和生长不良的愈伤组织去掉,将大的健康的愈伤组织切至0.5c m,再放于含0.1mg/L2,4-D的MS培养基(pH5.7)上继续培养.诱导和继代培养均在黑暗条件下进行,培养温度为25e,继代培养时间为3周~4周更换一次培养基.观察并记录继代过程中愈伤组织状态的变化.(2)以胡萝卜直根形成层为外植体诱导.用清水洗净胡萝卜直根,用小刀削去表皮和顶部,将其在75%的酒精中消毒5min,再用0.1%的升汞消毒10min,接着用无菌水漂洗一遍,再用无菌水浸泡30min,最后用无菌水漂洗一遍.消毒好的胡萝卜直根,切去下边的2/ 3部分,留下部分用消毒好的小刀,沿截面横切成厚度1mm左右的小圆片,然后将小圆片的韧皮部和木质部切去,留下形成层,再切成长3mm,宽1.5mm,高1mm的小长块,接种在(1)中的诱导培养基上,获得愈伤后进行继代培养,培养环境条件与(1)相同.1.2.2胡萝卜细胞悬浮系的建立[3]用镊子夹取在固体继代培养基上继代20d左右的胚性愈伤组织即分散性好、疏松的愈伤,接种在含0.3mg/L2,4-D的液体培养基(pH5.7)中,每100mL的三角瓶中加入液体培养基50mL,摇床转速为110r/min,温度为25e,黑暗培养.每隔7d继代一次,连续培养4代~5代后逐渐形成稳定的细胞系.细胞悬浮培养液体培养基成分与愈伤组织继代培养的培养基相同,但不加琼脂.每隔1d在倒置显微镜下观察细胞形态、分散程度并照相,进行细胞计数,以建立细胞数生长曲线.1.2.3细胞悬浮生长曲线的测定取0.5g悬浮培养物,接入新鲜液体培养基中,进行振荡培养,每隔1d取样1次,共培养13d,连续做3次平行实验.1.2.4悬浮细胞数目的测定用血球计数板法[1]对胡萝卜悬浮细胞计数,全部操作在无菌环境下进行,每个结果为4次平行实验的平均值.细胞数按下面公式计算:1mL悬浮液中的总细胞数=A/5@25@ 104@B,A为5个中方格总细胞数,B为稀释倍数.2结果与讨论2.1外植体对愈伤组织状态的影响有文献报道,不同外植体的脱分化能力不同,诱导出愈伤组织的频率和愈伤组织的状态也不同.在胡萝卜愈伤组织诱导时,本实验采用三种外植体:胡萝卜子叶、下胚轴和直根形成层.经过30d观察发现,三种外植体经过培养均诱导获得了愈伤组织.结果如下:以子叶为外植体的大约有2/3诱导获得了愈伤组织,多数愈伤组织呈浅黄色,生长旺盛,质地松散,含水量大,分散性好,但也有一些状态不好,色泽发暗,选取好的可作为细胞悬浮培养的材料;以下胚轴为外植体几乎所有都获得了愈伤组织,并且愈伤组织生长旺盛,呈黄色,比较疏松,分散性好,适宜于细胞悬浮培养;而以直根形成层为外植体获得的愈伤组织不多,色泽较暗,有些带褐色,愈伤组织生长缓慢,质地较硬,分散度差,不适宜于细胞悬浮培养.因此,可认为胡萝卜下胚轴是诱导愈伤组织和进行细胞悬浮培养的理想外植体.2.2 激素对愈伤组织状态的影响不同的激素及激素浓度直接影响着愈伤组织的状态、质地和分散性,而这些因素又是松散愈伤组织的关键,也是进行细胞悬浮培养的必要前提.因此,本实验诱导胡萝卜愈伤组织及继代培养设计了4种激素组合[见1.2.1(1)],通过多次继代培养发现,1.0mg/L 2,4-D+0.5mg/L KT 组合诱导出的胚性愈伤组织(见图1)生长旺盛、呈黄色米粒状分散性好、质地松软、含水量小,有利于细胞悬浮培养,而半胚性愈伤不适合进行细胞悬浮培养.其他3种组合中,2.0mg/L 2,4-D+0.5mg/L KT 诱导出的愈伤组织也比较疏松,而另两种诱导出的愈伤组织质地比较坚实,有褐化现象.可见,2,4-D 与KT 的结合有利于疏松愈伤组织的诱导.图1 胡萝卜松散型愈伤组织 左图:胚性愈伤 右图:半胚性愈伤Fig.1 The imcompact calli.of Daucus carota L Left:embrogenic callus Ri ght:semiembrogenic callus2.3 继代次数与细胞状态之间的关系在细胞悬浮培养的过程中,需要不断地进行继代,来筛选出良好的、较稳定的细胞系.继代过程中,细胞悬浮液的颜色、细胞的形态、大小、数量不断在发生着变化.第1、2次继代时,细胞悬浮液为白色或浅黄色,混浊,有许多大颗粒,倒置显微镜下观察,细胞多数成团,保持较旺盛的分裂能力,单细胞大多呈长形、梭形、不规则形(见图2),细胞个体较大;3、4次继代时,细胞悬浮液变为黄色,比较粘稠,颗粒大小分布均匀,倒置显微镜下观察,分裂的细胞团增多,有的细胞团明显可见有20个~30个球形细胞组成,单细胞数目增多,而且大多呈球形;5次继代时,细胞悬浮液(见图3)呈透明的黄色,澄清,呈油状流动,颗粒分布很均匀,直径大多在0.5m m~1mm,倒置显微镜下观察,细胞团和单细胞很多,大多呈球形(见图4),大小均匀;6、7次继代以上时,悬浮液变得比较澄清,呈浅黄色,悬浮颗粒大小均匀,倒置显微镜下观察,细胞大多成团,可以清楚的看出细胞呈球形,比较均匀,73 第2期 尹文兵,等:胡萝卜愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养研究也有单细胞,但是不多,这可能与细胞聚集成团的特性有关.图2 不规则细胞(10@) 图3 黄色的细胞悬浮液Fig.2 Irregular cell (10@)Fig.3 Yellow cell suspension因此,继代培养过程中,随着继代次数的增多,细胞悬浮液由无色或浅黄色变为黄色,由混浊变为澄清、透明,颗粒大小由不均匀到均匀,最终直径在0.5mm~1mm,倒置显微镜下观察,单细胞由长形、梭形、不规则形变为规则的球形,细胞系逐渐趋于稳定.随后,我们又从筛选出来的细胞系将细胞接种到不含激素的MS 培养基上,7d 后长出新的愈伤组织,30d 后长出胡萝卜全苗并转入蛭石成活(图5),说明以细胞系转化为新的愈伤组织生成再生植株是成功的.图4 球形细胞(40@) 图5 再生植株Fi g.4Global cell (40@) Fig.5Plant regeneration2.4 细胞起始密度对细胞悬浮培养的影响在细胞悬浮培养时,细胞生长需要一个最低生长密度,低于此密度,细胞生长速率降低或根本不生长[4].适宜的起始密度可以缩短细胞系筛选的时间,起始密度过大过小不仅会影响细胞系筛选的时间而且不利于稳定细胞系的建立.同时,细胞的起始密度对细胞培74山西师范大学学报(自然科学版) 2004年养周期也有影响.为此,本实验设计了4个密度梯度:0.4@104个/50mL,1.125@104个/50mL,2.325@104个/50mL,8.875@104个/50mL.培养13d,细胞状态随天数的变化见表1。

根愈伤组织转接到胡萝卜细胞悬浮培养基中，于 25 ℃、全黑暗、摇床上震荡培养 以分离得到单细胞[5]。 （3）胡萝卜肉质根愈伤组织再分化培养 将实验 3-1 建立的生长状态良好、色泽新鲜、结构紧密的胡萝卜肉质根愈伤组 织转接到胡萝卜不定芽分化培养基上，置于温度 25 ℃ 、光照时间 14 h/d、光照强 度 1000～2000Lx 条件下诱导胡萝卜愈伤组织再分化成苗（或丛芽）[6]。 （4）培养结果 文字描述配合图片记录培养结果 Ⅳ、镜检 用无菌尼龙滤网将培养物滤去。除去滤网上的愈伤组织碎块和大的细胞团。留 下胡萝卜细胞液，用滴管吸取一滴在培养皿上，用台盼蓝染色，然后置于倒置显微 镜下观察。也可以做成临时装片进行观察。
2． 实验原理、实验流程或装置示意图 实验原理
1） 、将继代一次的胡萝卜愈伤组织选择生长状态良好、色泽新鲜未褐化的部分转接 到愈伤组织增殖培养基上培养，即可实现愈伤组织的增殖[1]。 2） 、一般情况下，适合于愈伤组织增殖的培养基也适合于细胞的悬浮培养，只是要 把琼脂去掉。 3） 、影响茎芽分化因素主要是培养基中生长素和细胞分裂素的浓度和比例。当生长 素的相对浓度较高时，有利于细胞的增殖和根的分化，若细胞分裂素的相对浓度较 高，则促进芽的分化，当这两种激素之间的比例适中时[2]，则仍产生无结构的愈伤 组织。 4） 、将实验 3-1 建立的生长状态良好、色泽新鲜、结构松散的胡萝卜肉质根愈伤组 织转接到胡萝卜细胞悬浮培养基中，于 25 ℃、全黑暗、摇床上震荡培养[3]，即可 分离得到单细胞，进一步可建立胡萝卜细胞悬浮培养系。 5） 、将实验 3-1 建立的生长状态良好、色泽新鲜、结构紧密的胡萝卜肉质根愈伤组 织转接到胡萝卜不定芽分化培养基上，置于温度 25 ℃ 、光照时间 14 h/d、光照强 度 1000~2000Lx 条件下即可分化再分化成苗（或丛芽） 。

北京师范大学珠海分校实验报告姓名：实验名称：胡萝卜愈伤组织的诱导学院（系、所）：工程技术学院学科专业：生物技术导师姓名：报告时间：2012.2.15—2012.3.20实验序号01实验名称胡萝卜愈伤组织的诱导实验时间2012.2.15—2012.3.20实验室工程技术学院1206 1209 1．研究背景1.1 胡萝卜胡萝卜（Daucus carrot），属于十字花科植物，是一种十分重要的蔬菜植物。

由于其营养价值高,及其适于生食、加工、烹调等多种用途,在世界范围内广泛栽培。

中国是农业大国,胡萝卜作为蔬菜作物在人们生活中起着重要的作用.因此,加快我国胡萝卜育种研究以成为迫切需要。

近些年来,随着生物技术与分子生物学技术的快速发展，作为生物技术研究的理想材料，许多国家对胡萝卜体细胞杂交技术、遗传转化与再生技术、分子标记与基因克隆技术进行了广泛深入的研究。

我国科研工作者在胡萝卜的生物技术与分子生物学研究上也取得了一定进展，特别是在组织培养、原生质体融合、遗传转化及再生等方面。

但是在胡萝卜细胞培养方面并不是太多。

因此继续深入研究还是很有必要的。

此外，由于市面上的胡萝卜价格比较便宜，材料易得，而且在组织培养方面容易诱导发生，我们可以通过这个实验熟悉植物组培。

1.2 组织培养植物组织培养概念（广义）又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织。

器官或细胞，原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。

植物组织培养概念（狭义）指用植物各部分组织，如形成层。

薄壁组织。

叶肉组织。

胚乳等进行培养获得再生植株，也指在培养过程中从各器官上产生愈伤组织的培养，愈伤组织再经过再分化形成再生植物。

2．实验设备与材料2.1 实验设备冰箱、普通天平、分子天平、试剂瓶（棕色和白色）、量筒、烧杯、容量瓶、药勺、称量纸、玻棒、标签纸、三角瓶、吸管、玻璃棒、精密pH试纸（5.4～7.0）、PH试纸（5.4～7.0）、封口膜、橡皮筋、微波炉、高压蒸汽灭菌锅、已灭菌滤纸、手术剪、解剖刀、已灭菌培养皿、酒精灯、大烧杯、小烧杯、50ml三角瓶、50ml 量筒、100ml量筒、10ml和5ml还有2ml吸管、200ml定容瓶。

常见错误举例
托盘端到超净工作台里。 材料切得过小。 材料消毒时间过长。 切材料时下面没垫滤纸。 镊子、刀在酒精灯上烧过立即放到盛酒精的烧杯里。 操作时，手、三角烧瓶在盛材料的培养皿上方活动，容易 把菌带到材料上。 把接种的切块压入培养基里面。 接种时瓶口垂直向上，手、镊子上的赃物容易掉到瓶里。 升汞回收倒入酒精桶里。
注意事项： Fra bibliotek防火。实验中要经常用酒精消毒、用酒精灯烧 镊子、刀具，注意安全。 无菌操作。材料经升汞消毒后，即认为是消毒 干净，此后的操作中的用具要求无菌。为防止 染菌，注意：手要用酒精擦干净；镊子和刀经 常在火焰上烧；锥形瓶、手不要放在盛材料的 培养皿上方。 废液处理。酒精要回收，放原处；升汞有剧毒， 小心不要溅出，废液倒回原处。

二、消毒和清洗
1. 2. 3.
把切好的材料，放在100ml的烧杯里，加 入75％酒精，浸泡30秒； 把酒精倒入废液瓶里，然后加入0.2％升 汞，浸泡25－30分钟； 把带有升汞的烧杯拿到超净工作台，取出 材料，放入培养皿，用灭菌水洗4－5分钟， 重复3次。
三、接种
1.
2.
把洗净的材料用烧过的镊子夹到盛有滤纸 的培养皿里，去除表面一层，然后切成约 7x5x5mm的块； 把切好的材料，用烧过的镊子夹到锥形瓶 里，3－5块/瓶。
三接种三接种把洗净的材料用烧过的镊子夹到盛有滤纸把洗净的材料用烧过的镊子夹到盛有滤纸的培养皿里去除表面一层然后切成约的培养皿里去除表面一层然后切成约77xx55xx55mmmm的块
胡萝卜组织培养程序
制作人：唐少保20116203 薛钰龙20116207
一、材料处理


把胡萝卜切成约4cm的段； 去除表皮； 靠外层切成约4x1x1cm的 条，里面木质部和髓不要。

芸苔素内酯在胡萝卜组培快繁中的应用唐汇东,周浩林,王旭辉,易桂烽（长沙医学院生物技术系，湖南长沙410000）摘要：芸苔素内酯是新发现的一种天然植物激素。

本文对不同浓度芸苔素内酯对胡萝卜组培苗诱导率、出芽率、平均芽长、生根率、平均根数、平均根长的影响进行研究，得出芸苔素内酯对胡萝卜组培快繁最佳浓度范围。

通过不同激素混合作用对比，得出影响胡萝卜组培快繁的最佳激素组合。

关键词：芸苔素内酯；植物激素；组织培养中图分类号：S533文献标识码：A文章编号：1005-7897（2021）04-0007-021970年美国农业部科学家J.W.Mitchell等从油菜籽中提取出一种对植物根茎伸长和细胞分裂有超强促进作用的物质，这种物质被定名为芸苔素（Brassins）。

1970年至今发现了大约80种天然芸苔素内酯类化合物，其被合称为油菜素甾醇类物质（Brassinosteroid，BR），1998年国际上正式确认芸苔素内酯为第六类植物激素[1]。

芸苔素内酯用途广泛，具有治疗黄叶病、促进根芽生长、壮根、促进果实成熟、提高作物产量、减轻病虫害、提高植物抗干旱能力、提高植物御寒能力。

对因农药、病虫影响、干旱高寒等原因造成的根腐烂、幼苗枯萎、倒伏现象急救效果显著，施用24h内明显见效，可以使植物迅速恢复生机。

适用各类经济作物，蔬菜和水果等。

本试验研究芸苔素内酯对胡萝卜组织培养快速繁殖的影响，并与其他植物激素进行比较[3]。

1材料和方法1.1材料胡萝卜采自商场常见胡萝卜品种，现场剥皮洗净切取1cm 厚片段备用。

全营养的MS培养基加水稀释高压蒸汽灭菌备用。

6-苄氨基嘌呤（6-BA）、芸苔素内酯（BR）、α-萘乙酸（NAA）、采自九鼎化学生产高纯标准品（纯度>95%）。

1.2消毒采用多次消毒法消毒外植体[4]。

将已切的胡萝卜先用70%乙醇浸泡3min，用吸水纸擦干，再用酒精灯消毒外植体15s；接着用20%次氯酸钠溶液浸泡10min，接着用酒精灯消毒外植体15s，再用超纯水冲洗5次，吸干，切去周围组织，留下形成层，外植体大小5~8mm3。

云南大学生命科学实验教学中心实验报告课程名称：细胞工程实验院系：生命科学学院年级专业：2013级生物技术（国家生命科学与技术姓名：杨梦梅选课号：2015107066学号：20131070156座号：A2开课日期：2015.09 学期：2015秋季学期任课教师：吕琦、牛芸云南大学生命科学实验教学中心制胡萝卜愈伤组织的诱导、继代及细胞悬浮培养研究第一作者：杨梦梅同组实验者：赵姗( 云南大学生命科学学院,昆明650504)摘要: 以胡萝卜肉质根为外植体诱导出愈伤组织, 并建立细胞悬浮系. 实验结果表明: 胡萝卜肉质根是诱导愈伤组织和进行细胞悬浮培养的可行外植体; 诱导致密型愈伤组织的最佳激素浓度配比是 0.5 mg/ L 2, 4- D+ 0.4 mg/ L KT;继代培养 1代~ 2时,可得到高活性的悬浮细胞系；细胞悬浮培养细胞经过 14 天达到高峰期（生长平台）。

关键词: 胡萝卜; 组织培养; 细胞悬浮培养; 致密型愈伤组织;The study about inducement, subculture and suspension celllines of Carrots’ callusAbstract: Carrots’ flesh roots can induce callus as explants, and then it establishes suspension cell lines. The experimental results show that: Carrot s’flesh roots really can induce callus and then make suspension cell lines. In order to induce high density callus, the best hormone ratio is 0.5 mg/ L 2, 4- D+ 0.4 mg/ L KT. Subculturing the cell line for 1 to 2 times, we can obtain the suspension cell line with high activity. After 2 weeks, the cell line reaches to the peak of growth.Keywords: Carrot; tissue culture experiments; suspension cell; callus in high density胡萝卜( Daucus carota L . ) , 属于十字花科植物, 是一种十分重要的蔬菜作物, 由于胡萝卜肉质根营养丰富，约含有88％的水、6％～8％糖、1％～2％植物纤维，0．7％～1．2％蛋白质、1％灰份及0～3％脂肪，及其适于生食、加工、烹调等多种用途, 在世界范围内广泛栽培。

胡萝卜的愈伤组织培养摘要本试验以胡萝卜的形成层组织为试验材料，材料经消毒灭菌，无菌接种在附加植物激素1.0mg/L 2,4-D的MS诱导培养基的三角瓶中,培养温度28-30℃，避光培养30天左右，即可诱导产生胡萝卜的愈伤组织。

关键词：胡萝卜组织培养愈伤组织ABSTRACTIn this experiment, we use carrot’s formation layer as materials. After disinfection and sterilization, the materials are inoculated in MS induction medium with additional plant hormones 1.0mg / L 2,4-D. Culture the materials with temperature of 28-30 ℃and about 30 days in dark, then carrot callus can be induced.Key words:carrot tissue culture callus前言在无菌条件下，将植物器官或组织（如芽、茎尖、根尖或花药）的一部分切下来，放在适当的人工培养基上进行培养，这些器官或组织就会进行细胞分裂，形成新的组织。

不过这种组织没有发生分化，只是一团薄壁细胞，叫做愈伤组织。

再适合的光照、温度和一定的营养物质与激素等条件下，愈伤组织便开始分化，产生出植物的各种器官和组织，进而发育成一棵完整的植株。

愈伤组织（callus）原指植物体的局部受到创伤刺激后，在伤口表面新生的组织。

它由活的薄壁细胞组成，可起源于植物体任何器官内各种组织的活细胞。

在植物体的创伤部分，愈伤组织可帮助伤口愈合；在嫁接中，可促使砧木与接穗愈合，并由新生的维管组织使砧木和接穗沟通；在扦插中，从伤口愈伤组织可分化出不定根或不定芽，迸而形成完整植株。

胡萝卜的贮藏根（根的变态）表面消毒后切割成小块接种于愈伤组织诱导培养基上，诱导外植体脱分化产生愈伤组织。愈伤组织能够分化，形成完整植株，因此，经常通过愈伤组织的诱导培养来获得植株。
愈伤组织诱导的培养基与愈伤组织扩大培养所需的培养基不同，而愈伤组织诱导的成败关键主要不是外植体的来源和种类，而是培养条件，所以培养基的成分对于愈伤组织的产生与否有很重要的作用。
与其他同学的比较，发现胡萝卜的块根大的，愈伤组织形成情况较好。
在愈伤组织继代培养中，结果不理想分析其原因可能如下：
（1）由于扎培养瓶的线较粗，而瓶口较小，扎线不紧，导致培养过程中染菌。
(2)在接种过程中，操作方式不够规范，因为在实验中，我发现自己会不自主的将双手太过靠近培养基，将细菌带到培养基中。致使在接种过程中染菌。
（2）胡萝卜愈伤组织的诱导
①实验材料的准备：a准备新鲜健康的胡萝卜肉质直根作实验材料；b实验材料的修整、刷洗、冲洗；c用洗衣粉水或肥皂水浸洗后再用自来水冲净。
2植物材料的表面灭菌和接种
a、操作人员洗手消毒
b、装材料的容器及玻璃棒用酒精表面消毒
c、将待消毒的材料浸入75％的酒精中10秒，取出用无菌水冲洗干净。
②配制流程：同胡萝卜愈伤组织诱导培养基的配制
（4）胡萝卜愈伤组织的继代培养
将上次接种在愈伤组织诱导培养基中的无污染的外植体上产生的愈伤组织剥离转接到愈伤组织继代诱导培养基上，放置在25℃全黑暗条件下进行愈伤组织的增值培养，以获得足够的愈伤组织，作为后续实验的实验材料。
注意事项：
在操作过程中，要严谨细致；
（2）实验药品和试剂
MS培养基母液、琼脂、蔗糖、生长调节物质、蒸馏水、1mol·L-1HCl、1mol·L-1NaOH
2,4-D、6-BA、无菌水、75％酒精、0.1%HgCl2、

（2）配置胡萝卜愈伤组织诱导培养培养基所需的仪器设备和药品：
①仪器设备：
冰箱、普通天平、三角瓶、移液管、量筒、烧杯、容量瓶、玻璃棒、医用口杯、精密pH试纸（pH5.4~7.0）、药勺、称量纸、标签纸、封口膜、橡皮筋、电炉、高压蒸汽灭菌锅等。
②药品和试剂：
MS培养基母液、琼脂、蔗糖、生长调节物质、蒸馏水、1mol/LHCl、1mol/LNaOH
5.掌握组培室常用的化学试剂。
6.学会设计和配制胡萝卜细胞悬浮培养的培养基。
7.熟练掌握愈伤组织继代培养的基本操作技术。
8.使同学熟练掌握胡萝卜细胞悬浮培养的基本操作技术，进一步熟悉、规范无菌操作技术。
9.使同学了解胡萝卜愈伤组织器官分化培养的基本操作技术。
（二）、实验原理、实验流程或装置示意图
1、实验原理
②、培养瓶封口后置于恒温培养箱中全黑暗培养。温度控制在25℃左右。
③、接种结束后，清理和关闭超净工作台。
4、胡萝卜愈伤组织的继代培养
（1）、准备工作
接种室的清洁和消毒；超净工作台的开机和消毒；剪刀、镊子、已灭菌培养皿和滤纸、待用培养基等的准备；实验材料的准备（选择装有无污染的已分化出愈伤组织的外植体的三角瓶摆放于超净工作台）。
配制流程：
(1)根据需要配制培养基的量（各小组500ml）称好所需的琼脂放入医用口杯中，加入适量的蒸馏水置于电炉上加热溶解，边加热边用玻棒搅拌。
(2)待琼脂完全溶解后，加入规定用量的母液（可事先取好放在一烧杯中），再加入规定用量的蔗糖，继续加温并不断搅拌，待琼脂煮透后端离火源，根据培养基配方及培养基体积加入所需的生长调节物质，定容至所需的体积，并用玻棒搅拌均匀。
实验名称
胡萝卜肉质根愈伤组织诱导、继代增殖、细胞

本科学生综合性实验报告
实验课程名称：胡萝卜肉质根愈伤组织诱导、继代增殖、细胞
悬浮及体细胞胚胎发生培养实验
教师：
开课学期：2013至2014学年第二学期
填报时间：2013年6月日Байду номын сангаас
实验序号
实验二
实验名称
胡萝卜肉质根愈伤组织诱导、继代增殖、细胞
悬浮及体细胞胚胎发生培养实验
实验时间
2013年3月-6月
实验室
（4）植物组织培养的优点：
①研究材料来源单一，无性系遗传背景一致；
②经济方便效率高；
③条件可控误差小；
④生长快周期短重复性强；
⑤可周年试验或生产。
（5）组织培养实验室布局的总体要求：
便于隔离，便于操作，便于灭菌，便于观察。
（6）组培上常用的灭菌方法有物理和化学法。
常用的物理方法有：
物理灭菌干热、湿热、射线处理、物理除菌、过滤、离心、沉淀等。
愈伤组织诱导的成败关键主要不是外植体的来源和种类，而是培养条件，其中激素的种类和浓度最为重要。诱导愈伤组织常用的生长素是2，4-D，IAA和NAA，常用的细胞分裂素是KT和6-BA。
愈伤组织形成的过程分为3个时期：诱导期、分裂期、分化期（形成期）。愈伤组织的生长是发生在不与琼脂培养基接触的表面。
（3）调节培养基的酸碱性至PH5.8。由于培养基的PH值直接影响到培养
（4）胡萝卜愈伤组织的继代培养所需设备：
①仪器设备：
酒精棉球、小块纱布、已灭菌培养皿和滤纸、枪状镊子、眼科手术剪、手术刀、酒精灯、100ml三角瓶、500或1000ml搪瓷杯、50ml量筒、1ml、2ml、5ml、10ml吸管、精密pH试纸（5.4~7.0）、封口膜、橡皮圈、药勺、称量纸等。

胡萝卜愈伤组织培养试验及改进作者：罗文俊来源：《文理导航》2015年第26期【摘要】在高中生物教学中，胡萝卜愈伤组织培养试验是一项重要的试验教学，对胡萝卜愈伤组织培养试验进行研究和改进十分有必要。

因此，本文对胡萝卜愈伤组织培养试验进行探讨和分析，希望为相关人士提供有价值的参考，促进胡萝卜愈伤组织培养试验的不断进步，不断完善。

【关键词】胡萝卜；愈伤组织培养；试验1.植物组织培养研究及与高中生物学科的联系在生物学科重新进入高考以来，与植物组织培养息息相关的知识点如：细胞全能性、植物的激素调节、及植物组织培养技术历年来都被列入高考大纲和考试说明，故在高中建立组培实验室并开展组培实验能为现阶段高中生物教学，尤其是实验教学提供第一手的可靠数据资料，对现阶段高中生物教研来说是十分必要的。

1.1植物组织培养的定义植物组织培养是指在无菌的条件下，将离体的植物器官、组织、细胞以及原生质体，培养在人工配制的培养基上，给予适当的培养条件，使其长成完整的植株。

由于培养物是脱离植物母体，在玻璃瓶中进行培养，所以也叫做离体培养。

其完整过程是：2.胡萝卜组织培养技术2.1胡萝卜组织培养实验流程MS母液配制→培养基配制及灭菌→愈伤组织诱导→遇上组织继代培养→观察记录2.2胡箩卜组织培养实验用品新鲜的胡箩卜茎段，超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、电子天平、电热炉、恒温箱、pH值测试器、紫光灯、镊子、烧杯、量筒、三角瓶、培养皿、滤纸、吸水纸、封口膜、MS固体培养基、Na2S2O3、1mol/LNaOH、2mg/L2，4-D溶液，1mg/L6-BA溶液、0.5mg/ml NAA溶液、15%盐酸、3%次氯酸钠、无水乙醇、0.1%升汞、蒸馏水。

2.3胡箩卜组织培养实验准备工作2.3.1母液配制MS母液培养基配制：去植物组织培养MS固体培养基并加蒸馏水稀释配置母液植物激素配置：2，4-D：2mg/L、6-BA：1mg/L注：2，4-D和NAA可先用酒精溶解在加蒸馏水定容，6-BA用浓盐酸溶解后加蒸馏水定容。

细胞分裂、 分化调节
培养基： MS+2，4-D 0.5mg/L+KT
0.5mg/L
单细胞或细胞细胞团块的获得
方法（机 械和酶法）
液体培养
细胞活力 细胞分裂和生长 分化和代谢调节
做今天实验之前:
►前面实验的观察和数据收集 ------胡萝卜愈伤组织的诱导和生长反
应的观察 ►植物细胞工程实验部分实验报告的
去除下层甲醇，保留上层乙醚溶液 倒入蒸馏瓶，蒸去乙醚，
残留物用4-5ml己烷溶解
含量的测定
在波长452nm下测定吸光值A452。
• 己烷中的β-胡萝卜素在波长452nm 下的摩尔消光系数ε1cm1%=2500， 即溶液的OD452为0.25时每ml含β胡萝卜素1μg。
撰写
污染源: 细菌,霉菌?现象?
• 观察
生 有污染 长 反 应 无污染
原因: 外植体?环境?操作?
不生长,发白或死亡
不生长,不死亡,也无愈伤形成 发生部位
愈伤形成 颜色质地 差异原因?
• 拍照 • 分析
形式
综合性的一篇论文 分开的三次实验报告
实
验
结构上的完整性
报
文字 术语的正确使用
告
内容
图片
不同污染源导致的污染 不同生长情况的图片 不同愈伤组织的图片
数据
存活率 污染率
分析讨论
污染原因的分析 实验结果的分析 思考和讨论
具体操作：
1.悬浮培养 选择疏松性愈伤组织
• 8人/组 • 2瓶悬浮培养基/组 • 约1g 细胞/瓶
无菌条件下将愈伤组织的细胞轻轻地剥离和分开
单细胞或小细胞团块
接种入已预先称重的液体培养基,接种后再次称重,获得细胞的鲜重(1g 左右)

胡萝卜幼苗根、茎、叶组织培养再生植株张唯;王伟;续晨;贲爱玲;张君艳;蔡小宁【摘要】[ Objective]J The aim was to study plant regeneration of carrot. [ Method] The root, stem and leaf of two month old seedlings were taken as explants. Effect of different medium and different explants on callus induction and callus differentiation was analyzed. [ Result] The three explants could induce callus. The stem as explants was the best for callus quality, its rate of callus induction and differentiation rate were the highest. [Conclusion] The callus induction and regeneration system of carrot seedlings was established, which lays foundation for the future experiments.%[目的]研究胡萝卜幼苗的组织培养再生技术.[方法]以培养约2个月的胡萝卜幼苗为材料,分别取幼苗的根、茎、叶为外植体,研究不同培养基、不同外植体对愈伤组织诱导的影响,以及培养基对愈伤组织分化的影响.[结果]根、茎、叶为外植体均能产生愈伤组织,但以茎为外植体诱导的愈伤组织质量最佳,其愈伤组织的诱导率和分化率均为最高.[结论]建立了胡萝卜试管培养幼苗的愈伤组织诱导和再生植株体系,为今后的试验打下了基础.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2012(000)012【总页数】2页(P7013-7014)【关键词】胡萝卜;幼苗;组织培养;再生植株【作者】张唯;王伟;续晨;贲爱玲;张君艳;蔡小宁【作者单位】南京晓庄学院,江苏南京211171;南京晓庄学院,江苏南京211171;南京晓庄学院,江苏南京211171;南京晓庄学院,江苏南京211171;南京晓庄学院,江苏南京211171;南京晓庄学院,江苏南京211171【正文语种】中文【中图分类】S631.2胡萝卜为伞形科二年生草本植物，是世界上最重要的蔬菜之一，栽种面积非常广泛。

胡萝卜幼苗根、茎、叶组织培养再生植株
张唯;王伟;续晨;贲爱玲;张君艳;蔡小宁
【期刊名称】《安徽农业科学》
【年(卷),期】2012(000)012
【摘要】[目的]研究胡萝卜幼苗的组织培养再生技术.[方法]以培养约2个月的胡萝卜幼苗为材料,分别取幼苗的根、茎、叶为外植体,研究不同培养基、不同外植体对愈伤组织诱导的影响,以及培养基对愈伤组织分化的影响.[结果]根、茎、叶为外植体均能产生愈伤组织,但以茎为外植体诱导的愈伤组织质量最佳,其愈伤组织的诱导率和分化率均为最高.[结论]建立了胡萝卜试管培养幼苗的愈伤组织诱导和再生植株体系,为今后的试验打下了基础.
【总页数】2页(P7013-7014)
【作者】张唯;王伟;续晨;贲爱玲;张君艳;蔡小宁
【作者单位】南京晓庄学院,江苏南京211171;南京晓庄学院,江苏南京211171;南京晓庄学院,江苏南京211171;南京晓庄学院,江苏南京211171;南京晓庄学院,江苏南京211171;南京晓庄学院,江苏南京211171
【正文语种】中文
【中图分类】S631.2
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冲净。
4
（2）植物材料的表面灭菌和接种
▪ ①操作人员洗手消毒 ▪ ②装材料的容器及玻璃棒用酒精表面消毒 ▪ ③将待消毒的材料浸入75％的酒精中10秒，
取出用无菌水冲洗干净。
▪ ④倒入消毒剂（ 0.1%HgCl2 ）并计时
▪ ⑤到预定时间（20分钟）后倒出消毒液并 用无菌水清洗干净。
▪ ⑥将材料切块后接种到诱导培养基上。
▪ ① 外植体表面灭菌前的准备工作 ▪ a 接种室的清洁和消毒； ▪ b 超净工作台的开机和消毒； ▪ c 消毒溶液、无菌水、装材料的容器、解
剖刀、镊子、培养皿、计时器、待用培养 基等的准备。
3
② 实验材料的准备
▪ a 准备新鲜健康的胡萝卜肉质直根作实验 材料；
▪ b 实验材料的修整、刷洗、冲洗； ▪ c 用洗衣粉水或肥皂水浸洗后再用自来水
1
▪ 3 主要实验用具和仪器
▪ 用具：酒精棉球、小块纱布、已灭菌滤纸、 枪状镊子、手术剪、解剖刀、已灭菌培养 皿、酒精灯等。
▪ 仪器：超净工作台、恒温培养箱
▪ 4 药品和试剂
▪ 胡萝卜愈伤组织诱导培养基、无菌水、75 ％酒精、0.1%HgCl2。
▪ 5 实验材料：胡萝卜肉质直根
2
6 实验流程
▪ （1）准备工作
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（2）胡萝卜愈伤组织增殖培养基的配制
▪ 配方：MS基本培养基＋ 2mg/L NAA＋ 0.1mg/L 6-BA＋200mg/L水解酪蛋白＋ 0.7 ％琼脂＋3％蔗糖
▪ 配制流程：同胡萝卜愈伤组织诱导培养基 的配制
6
Hale Waihona Puke 作业▪ 详细写出胡萝卜愈伤组织诱导培养的操作 步骤。
7
胡萝卜愈伤组织诱导培养基无菌水75酒精01hgcl消毒溶液无菌水装材料的容器解剖刀镊子培养皿计时器待用培养基等的准备