一株水貂源致病性粪肠球菌分离与鉴定

一株貂源绿脓杆菌的分离和鉴定
杨朋欣;丁国杰;刘可姝;张春媛;王彬
【期刊名称】《中国动物保健》
【年(卷),期】2016(18)9
【摘要】为鉴定一株引起水貂发病的致病菌,本研究从患病水貂肺脏中分离获得一株优势菌,分别对该分离株进行形态、生化和培养特性研究;分子生物学和血清型鉴定;半数致死量测定.结果表明,该分离株为血清G型水貂源绿脓杆菌;分离株16S rRNA基因序列与已知的绿脓杆菌相应序列同源性为99.16%;分离菌对小鼠的半数致死量(LD50)为1.17×106CFU,对水貂的LD50为1.5×108CFU.
【总页数】3页(P75-77)
【作者】杨朋欣;丁国杰;刘可姝;张春媛;王彬
【作者单位】哈药集团生物疫苗有限公司黑龙江哈尔滨150069;哈药集团生物疫苗有限公司黑龙江哈尔滨150069;哈药集团生物疫苗有限公司黑龙江哈尔滨150069;哈药集团生物疫苗有限公司黑龙江哈尔滨150069;哈药集团生物疫苗有限公司黑龙江哈尔滨150069
【正文语种】中文
【相关文献】
1.貂源绿脓杆菌分离株的鉴定、血清学分型及药敏试验 [J], 杨海燕;王颖;张传美;秦志华;张洪亮;单虎
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晓冰;马凤芹;单虎
4.1株貂源绿脓杆菌噬菌体的分离与鉴定 [J], 齐心; 梅纪坤; 张灿
5.貂源绿脓杆菌的分离鉴定及其生物学特性研究 [J], 许皓;刘建荣;倪佳;任飞;王力欣;王峥;刘莹
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51肠球菌属细菌为G+球菌，常成对或短链，肠球菌属有粪肠球菌、屎肠球菌等19种。

作为人和动物肠道的正常菌群，一般情况下肠球菌并不引起疾病，但在人或动物机体抵抗能力不强的情况下，它就会成为条件致病菌引起人或动物机体患病。

此外，由于肠球菌的固有耐药性以及因人类对抗生素的滥用获得性耐药性的产生，肠球菌对于抗生素的耐药情况愈发严重[1]。

本次试验对从西藏山南地区采集到病死牦牛肝脏上分离到的试验菌株进行细菌分离鉴定耐药性检测，将为西藏自治区细菌耐药性检测以及山南地区牦牛养殖和临床用药提供一定指导。

同时，本次试验利用枯草芽孢杆菌替代传统抗生素来治疗粪肠球菌导致的腹泻，将为解决粪肠球菌临床治疗提供新思路。

１　材料与方法1.1试验材料1.1.1 病料来源　对西藏山南地区一头病死牦牛进行尸体剖检，无菌采集牦牛肝脏放入密封袋中，置于冰盒后迅速送往试验室，-20℃冰箱保存待检。

1.1.2 主要试剂　营养肉汤、普通琼脂、麦康凯培养基、绵羊血液、生化鉴定管（购自杭州滨河微生物试剂公司）、2×Es Taq MasterMix （D y e ）、细菌基因组D N A 提取试剂盒、50×TAE、Maker、核酸染料（购自武汉擎科创新生物科技有限公司）。

1.1.3 主要仪器　恒温培养箱、摇床、烘箱、超净工作台、PCR仪、凝胶成像系统、普通光学显微镜、电泳仪。

1.2 试验方法1.2.1 细菌的分离　将病料充分研磨后离心，采集上清接种于普通营养肉汤，37℃摇床80r/min 培养24 h。

勾取菌液划线接种于5%血琼脂平板，37℃恒温培养箱培养24 h。

勾取典型单菌落再次接种于营养肉汤，37℃摇床80r/min培养24 h收稿日期：2019-06-24基金项目：2018年兽医学创新创业平台建设。

作者简介：孔新平（1997-），女，山东泰安人，在读本科生，动物医学专业。

通讯作者：吴庆侠（1973-），女，陕西城固人，副教授，研究方向为家畜生殖内分泌与生殖免疫。

动物医学进展,２０２０,４１(９):１２３Ｇ１２７P r o g r e s s i nV e t e r i n a r y M e d i c i n e兽医临床猪源粪肠球菌的分离与鉴定㊀收稿日期:２０１９Ｇ０４Ｇ０４㊀基金项目:国家重点研发计划项目(２０１７Y F D ０５０１０００);国家自然科学基金项目(３１６７２５２８);吉林省科技发展计划项目(２０１７０２０４０３４N Y ,２０１８０２０１０４０N Y ,２０１９０３０１０４２N Y );吉林省教育厅 十三五 科学技术项目(J J K H ２０１８０６４７K J )㊀作者简介:石春卫(１９８９－),男,助理实验师,硕士,主要从事动物微生态与黏膜免疫学研究.∗通讯作者石春卫,谢㊀静,杨桂连,王春凤∗(吉林农业大学动物科学技术学院,吉林省动物微生态制剂工程研究中心,吉林长春１３０１１８)㊀㊀摘㊀要:从新鲜仔猪粪便中分离益生菌,筛选出适合养猪生产的益生菌株,为进一步开发猪用微生态制剂奠定基础.采集长春市双阳地区某猪场健康仔猪新鲜粪便,分离纯化粪肠球菌,通过形态学观察㊁体外耐酸耐胆盐性能和抑菌能力试验,筛选出益生特性的候选菌株,１６Sr D N A 序列分析方法鉴定其种属,并对候选菌株生长情况及其对抗菌药物敏感性进行评价.成功筛选出２株(S Ｇ５０㊁和S Ｇ４)耐酸㊁耐胆盐和抑菌能力较强的粪肠球菌,且具有较好的生长性能,为研发微生态制剂提了供理论依据.㊀㊀关键词:仔猪;粪肠球菌;分离;鉴定中图分类号:S ８５１．３３文献标识码:B文章编号:１００７Ｇ５０３８(２０２０)０９Ｇ０１２３Ｇ０５㊀㊀畜牧业养殖过程中,特别是在高密度养殖环境下,为了防治动物疾病,抗生素过量㊁长期及违规使用引起的细菌耐药性和兽药残留问题,已危及到人类健康.健康养殖是解决这一问题的关键,即从减抗到禁抗最终实现 无抗 . 抗生素后的时代将成为活菌时代.用动物微生态制剂替代饲用抗生素是解决抗生素滥用问题从而实现健康养殖的有效途径.益生菌是微生态制剂的主要类别,是肠道菌群的主要菌属,通过 竞争排斥 机制对肠道菌群发挥调节功能,阻碍肠道黏膜中病原体定植,包括竞争黏附位点和营养物质以及产生抗菌化合物[１Ｇ２].研究表明,乳酸杆菌能够在肠道定植,调节肠道菌群,促进肠道优势菌群数量,改善肠道健康,有效防止病原菌的感染.采用鼠李糖乳杆菌(L G G )A T C C ５３１０３饲喂无菌猪,高通量测序分析表明,L G G 能够维持肠道平衡,增加肠道的优势菌群,特别是能够保持肠球菌的基础水平,有效抵抗轮状病毒的感染[３].乳酸菌发酵产生的代谢产物生物活性分子,如有机酸(乳酸㊁甲酸㊁乙酸㊁丙酸㊁丁酸等)和抗菌肽等,能够抑制肠道中病原微生物的生长,还能分解毒素,起到解毒作用[４Ｇ５].乳酸菌具有宿主特异性,研究表明,当乳酸菌回归本属动物消化道时,可对肠道生态系统产生更好的效果[６Ｇ７].粪肠球菌是人类及动物肠道内乳酸类肠球菌的原生菌种,一般栖居在肠腔,属于常居益生菌.本试验从仔猪新鲜粪便样品中分离粪肠球菌菌株,并评价其益生特性,以期为研发猪用微生态制剂,实现健康养殖奠定理论基础.１㊀材料与方法１．１㊀材料１．１．１㊀试验样品与菌株㊀试验样品为长春市双阳地区某猪场２８日龄健康仔猪新鲜粪便.产肠毒素大肠埃希菌K ８８菌株(E ．c o l i K ８８)和鼠伤寒沙门菌均由吉林农业大学吉林省动物微生态制剂工程研究中心保存.１．１．２㊀主要试剂㊀M R S 液体培养基㊁L B 培养基㊁猪胆盐(G ５３１０)㊁浓盐酸溶液㊁P B S 磷酸盐缓冲液㊁结晶紫溶液㊁卢戈氏碘液㊁番红染色液(G １０６７)均为北京索莱宝科技有限公司产品.１．１．３㊀主要仪器㊀台式高速离心机(５４２７R )为德国E p p e n d o r f 公司产品;紫外分光光度计(L ５S )为上海精科公司产品;C O ２培养箱(H E R A c e l l ２４０i )为美国T h e r m oF i s h e r 公司产品;电子天平(M E ４０３)为梅特勒Ｇ托利多(常州)称重设备系统有限公司产品;全自动高压灭菌锅(G I ５４D S )为致微(厦门)仪器有限公司产品.１．２㊀方法１．２．１㊀样品采集和菌株培养㊁纯化及分离㊀用酒精棉球消毒不锈钢药勺取健康仔猪新鲜的粪便,取自长春市双阳区某养殖场,低温保存,称取２g新鲜粪便加入９m L灭菌生理盐水,振荡混匀,离心后取上清液１００μL加入９００μLP B S缓冲液,对上清液１０倍比稀释(梯度稀释为１０１~１０８),各稀释梯度取１００μL用玻璃棒均匀涂于M R S固体琼脂培养基平皿,３７ħ温箱培养１２h,选择适宜稀释梯度挑取单菌落于M R S液体培养基中活化２代后甘油保菌备用.１．２．２㊀候选菌株形态观察㊀筛选出的菌株革兰染色,步骤依次为涂片㊁火焰固定㊁结晶紫溶液染色１m i n㊁水洗㊁碘液媒染１m i n㊁水洗㊁９５０m L/L乙醇脱色３０s㊁水洗㊁番红染色液复染３m i n㊁水洗,光学显微镜下观察颜色和形态.１．２．３㊀候选菌株耐胃酸性能测定㊀用浓盐酸将M R S液体培养基初始p H调至２．０㊁３．０㊁４．０㊁５．０㊁６．０进行接种培养.将上述备用的乳酸菌活化２代后,使培养基中乳酸菌浓度为１ˑ１０９C F U/m L.取１００μL菌液接种于９．９m L用盐酸酸化至p H２．０㊁３．０和４．０的液体培养基和初始培养基中(对照培养基),３７ħ温箱生长２h后,各取１００μL上述培养液加入到９００μL无菌生理盐水中,依次按１０－１㊁１０－２㊁１０－３㊁１０－４㊁１０－５㊁１０－６做倍比稀释后,分别取１００μL 稀释度为１０－３㊁１０－４㊁１０－５和１０－６的稀释液涂布于M R S固体培养基上(对照培养基).每个稀释度做３个重复,３７ħ恒温培养４h记录结果,设置３次重复,计算存活率.１．２．４㊀耐胆盐菌株的筛选㊀将活化３代后的乳酸菌１００μL分别接种于１㊁２㊁３㊁４g/L的胆盐液体培养基,同时在不含猪胆盐的培养基中接种将１００μL乳酸菌作为对照,作用２h后进行活菌计数并计算菌株存活率.１．２．５㊀菌株抑菌能力筛选㊀将已灭菌的L B琼脂培养基在完全融化时倒入培养皿内,凝固,稀释至１０６C F U/m L的E．c o l i K８８和鼠伤寒沙门菌分别取０．１m L均匀涂布在L B培养基上,并在培养基上用打孔器打孔,琼脂培养基封底.取对数生长期的筛选菌株４８００r/m i n离心１０m i n,取上清液,用０．２２μm 滤膜过滤,收集过滤之后的上清液.在孔中加入０．２m L筛选菌株上清液,操作迅速防止上清液外漏,待完全扩散后,置于３７ħ温箱培养１２h,测量抑菌圈.１．２．６㊀候选菌株１６S r D N A鉴定㊀选取筛选出的菌株,取５m L新鲜菌液,低速离心获得菌体,按细菌基因组D N A提取试剂盒说明书步骤,提取候选菌株总D N A.合成细菌１６Sr D N A保守性通用引物(２７F:５ᶄＧA G A G T T T G A T C C T G G C T C A GＧ３ᶄ,１４９２R:５ᶄＧG G T T A C C T T G T T A C G A C T TＧ３ᶄ),引物由苏州金维智公司合成.P C R扩增产物回收后送长春库美公司测序,测序结果在N C B I网站B l a s t分析比对.１．２．７㊀候选菌株生长曲线测定㊀候选菌株活化后,按１％的接种量接种于M R S培养基,３７ħ温箱培养,于接种后２４h内每隔１h取样,测定O D６００n m 值,分别以时间和吸光值为横纵坐标绘出生长曲线.１．２．８㊀药敏试验㊀将对数生长期(１０８C F U/m L)的菌株通过均匀涂布于M R S固体培养基上,选取１４种常见的兽用药物圆盘纸片(执行标准W S/T１２５－１９９９)接种在培养基上,３７ħ温箱培养２４h.以药敏纸片为中心测定抑菌直径,统计抑菌结果:敏感(直径ȡ２０mm),中等敏感(１９mmɤ直径ɤ１５mm),耐受(直径ɤ１４mm).重复３次.１．２．９㊀数据分析㊀试验所得数据使用O f f i c eE x c e l 整理并计算,整理后的数据由S P S S１９．０统计分析(P＜０．０５为差异显著),所得数据以平均值ʃ标准差( xʃS D)表示.２㊀结果２．１㊀粪便样品中菌株的分离纯化与形态学鉴定将粪便样品稀释后取各梯度稀释液涂布于M R S固体培养基平皿上,在３７ħ温箱培养１２h后,观察到１０４稀释倍数菌落密度和大小适中,共挑取１６５株单菌落,将菌株编号(S１ＧS１６５),活化２代后,进行划线纯化培养,挑取单菌落,活化２代后并用甘油冷冻保菌(－８０ħ).２．２㊀形态学观察结果对分离纯化出的１６５株疑似乳酸菌的菌株进行菌落形态特征和革兰染色光学显微镜观察,结果统计发现１２２株菌株镜下观察均为紫色,形状多呈双球对称相联或四球对称相联,初步判断为革兰阳性球菌(图１).图１㊀革兰染色镜检结果F i g．１㊀G r a ms t a i n i n g a n dm i c r o s c o p i c o b s e r v a t i o n ２．３㊀候选菌株的耐酸性能将活化好的菌液按１０％接种不同p H的M R S４２１动物医学进展㊀２０２０年㊀第４１卷㊀第９期(总第３２７期)培养基中,培养２h,检测O D６００n m值,采用平板计数法计算活菌数,重复３次.分离纯化的１２２株菌株中,６２株菌在p H为３．０环境下存活率在９０％以上,活菌数在p H２．０中有不同程度降低,其余p H梯度下几乎同对照组活菌数变化一致,表明这６２菌株在p H２．０环境下均有一定耐受性,其中菌株SＧ５０和SＧ４株在p H２．０环境下存活率仍可高达８２．３４％和７８．８５％.由此可见,菌株SＧ５０和SＧ４是比较理想的耐受酸性环境的菌株.２．４㊀侯选菌株的耐胆盐溶液性能称取猪胆盐,加适量的P B S缓冲液,倒入烧杯后搅拌混匀,０．２２μm滤膜过滤后得到无菌人工胆盐溶液,菌液经离心弃上清液后加入人工胆盐溶液１m L,２h后计算存活率.耐酸性能较好的６２株菌株,经过３g/L胆盐培养处理后,SＧ５０和SＧ４这２株菌的耐胆盐性较好,存活率分别为５７．０６％和５４．４２％,其余菌株对胆盐较为敏感(表１).表１㊀筛选出的２株菌对酸和胆盐的耐受性T a b l e１㊀T h e t o l e r a n c e o f２i s o l a t e d s t r a i n s t o a c i da n db i l e s a l t菌株S t r a i n s 酸处理存活率/％S u r v i v a l r a t ew i t h p H２猪胆盐处理存活率/％S u r v i v a l r a t ew i t hb i l e s a l tSＧ５０８２．３４５７．０６SＧ４７８．８５５４．４２２．５㊀侯选菌株的抑菌试验上述得到耐受性较好的２株菌为试验菌株,以大肠埃希菌K８８㊁鼠伤寒沙门菌为指示菌,取其候选菌株上清液进行抑菌能力验证,发现SＧ５０和SＧ４菌株对指示菌E．c o l i K８８和鼠伤寒沙门菌均具有较为明显的抑菌效果(表２).其中SＧ５０菌株抑菌圈的直径最大,表明其对E．c o l i K８８和鼠伤寒沙门菌抑菌作用最强.表２㊀筛选出的２株菌对E．c o l i K８８和S a l m o n e l l a的抑菌性能T a b l e２㊀T h e i n h i b i t i o na b i l i t i e s o f t h e２i s o l a t e d s t r a i n s t oE．c o l i K８８a n d S a l m o n e l l a菌株S t r a i n sE．c o l i K８８抑菌圈直径I n h i b i t i o n z o n e d i a m e t e rS a l m o n e l l a抑菌圈直径I n h i b i t i o n z o n e d i a m e t e rSＧ５０１８．３３１３．２５SＧ４１６．９５１０．５８２．６㊀候选菌株１６S r D N A鉴定结果将２株候选菌株１６Sr D N A序列测序后,提交N C B I进行B L A S T比对结果显示,SＧ５０和SＧ４分别与E n t e r o c o c c u s f a e c a l i s s t r a i nD L１５０５和E n t e r oＧc o c c u s f a e c a l i s s t r a i nA３Ｇ１序列同源性均达到９９％(表３).依据１６S r D N A测序结果推断,SＧ５０和SＧ４均为粪肠球菌.２．７㊀候选菌株的生长性能以发酵时间为横轴,以O D６００n m值为纵轴,绘制生长曲线图.试验结果表明菌株接种培养基后延迟期约为３h,培养４h后进入对数生长期;培养１２h后,生长速度降低,但仍缓慢生长;１５h到达稳定生长(图２).表３㊀筛选出的２株乳酸菌１６S r D N A序列同源性比对T a b l e３㊀H o m o l o g y a n a l y s i s o f１６S r D N As e q u e n c e so f t h e２i s o l a t e d s t r a i n s菌株S t r a i n s菌种S p e c i e s登录号A c c e s s i o nɴ同源性/％H o m o l o g ySＧ５０E n t e r o c o c c u s f a e c aＧl i s s t r a i nD L１５０５MG７３６０６１．１９９．０SＧ４E n t e r o c o c c u s f a e c aＧl i s s t r a i nA３Ｇ１MH３８５３５１．１９９．０图２㊀筛选出的２株粪肠球菌的生长曲线F i g．２㊀G r o w t h c u r v e s o f t h e２E n t e r o c o c c u s f a e c a l i s i s o l a t e s ２．８㊀药敏试验结果２株菌对羧苄西林㊁哌拉西林㊁四环素㊁头孢唑林㊁氧氟沙星㊁头孢拉定㊁万古霉素㊁头孢呋辛㊁头孢哌酮㊁氯霉素㊁头孢他啶和头孢曲松表现出敏感和中等敏感(表４).而对青霉素㊁苯唑西林和红霉素表现为耐受.因此在抗生素与这２株粪肠球菌搭配使用过程中,应考虑抗生素种类及浓度的合理选择,以便更好的发挥菌株的作用.３㊀讨论微生态制剂应用广泛,而开发微生态活菌制剂的关键是优良菌种的选择.现有开发出的微生态制剂菌种大多数来自水㊁土壤等环境,这些环境与动物体内环境差异较大,所以,从这些环境筛选出的菌株应用于动物时,效果不明显.益生菌定植宿主的特异性将直接影响微生态益生菌制剂的临床应用效果,所以菌种的选择需要注意宿主的特异性,因而微生态制剂菌种最好的选择方式是采用分离自同源动物肠道的优良菌种.因此,本研究以健康仔猪的粪便为样本,５２１石春卫等:猪源粪肠球菌的分离与鉴定筛选性状优良的乳酸菌,可为开发猪用微生态制剂,实现健康生态养殖提供理论依据及可靠菌种.表４㊀药敏试验结果T a b l e４㊀T e s t r e s u l t o f d r u g s e n s i t i v i t y药物D r u g s菌株S t r a i n s SＧ５０SＧ４苯唑西林O x a c i l l i n R R氨苄青霉素A m p i c i l l i n R R羧苄西林c a r b e n i c i l l i n S S哌拉西林P i p e r a c i l l i n S S头孢唑林C e f a z o l i n S S头孢拉定C e f r a d i n e S S头孢呋辛C e f u r o x i m S S头孢他啶C e f t a z i d i m e M M头孢曲松C e f t r i a x o n eS o d i u m S S头孢哌酮C e f o p e r a z o n e s o d i u m S S四环素M i n o c y c l i n e M M红霉素E r y t h r o m y c i n R R氧氟沙星O f l o x a c i n S M万古霉素V a n c o m y c i n M M氯霉素C h l o r a m p h e n i c o l M M 注: R 耐药(直径ɤ１４mm); S 对药物敏感(直径ȡ２０mm); M 对药物中度敏感(１９mmɤ直径ɤ１５mm).N o t e:＂R＂I n d i c a t e sd r u g r e s i s t a n c e(d i a m e t e rɤ１４mm);＂S＂I n d iＧc a t e sd r u g se n s i t i v i t y(d i a m e t e rȡ２０mm);＂M＂I n d i c a t e sm o d e r a t ed r u g se n s i t i v i t y(１９mmɤd i a m e t e rɤ１５mm)．本试验从健康仔猪新鲜粪便中筛选分离到１２２株候选菌株.动物胃部的p H相对比较低,胃酸导致大多数微生物不能存活.所以,益生菌能在肠道中定植并发挥其益生作用就要求必须具有较好的耐酸性[８].本试验中,分离纯化的１２２株菌株中,６２株菌在p H３．０环境下存活率在９０％以上,其中p H２．０环境下菌株SＧ５０的存活率仍可高达５２．３４％, SＧ４０为３８．８５％.研究表明,断奶仔猪胃内p H一般为２．５左右[９],由此可见,菌株SＧ５０和SＧ４是比较理想的耐受酸性环境的菌株,能够成功经过胃进入肠道,为其发挥益生功能提供先决条件.胆盐(B i l e s a l t)是由肝细胞分泌的胆汁酸与甘氨酸或牛磺酸结合而形成的钠盐或钾盐,益生菌进入机体肠道内必须耐受胆盐形成的高压环境,才能够定植于肠道中发挥自身作用[１０].一般仔猪肠道内胆盐浓度为０．３g/L~３g/L,通过耐胆盐溶液性能试验,筛选出SＧ５０和SＧ４候选菌株,最高能耐受３g/L的胆盐.表明这２株菌具有较好的耐受肠道胆盐的能力.益生菌主要在肠道中发挥作用,因此本试验针对抗猪肠道中主要致病菌的能力进行筛选.通过琼脂扩散法进行抑菌活性试验,筛选出的SＧ５０和SＧ４候选菌株对大肠埃希菌K８８和鼠伤寒沙门菌具有较强的抑菌能力.结果显示,候选菌株SＧ５０抑菌圈的直径最大,发挥抑菌作用最大,抑菌能力达到中等标准[１１].与李雪莉等[１２]筛选的乳酸菌菌株相比,本试验分离得到的２株益生菌对大肠埃希菌表现出更优的抑菌效果.通过１６Sr D N A测序分析,确定２株候选菌株均为粪肠球菌.粪肠球菌作为益生菌的一类,是人和动物消化道内重要菌群.粪肠球菌在动物生产实践中的应用越来越广泛,能够改善肠道微环境,调节肠道菌群平衡,增强机体免疫力,提高饲料转化率等益生功能[１３].生长曲线能够体现细菌的数量变化㊁生长与代谢状况.在本试验中,２株粪肠球菌在接种培养基后延迟期约为３h,培养４h后进入对数生长期;培养１２h后,生长速度降低,但仍缓慢生长;１５h生长到达稳定状态,表明筛选出的２株粪肠球菌可在营养充足的环境下快速生长,满足优良益生菌的特性.作为猪用优良微生态制剂菌种资源,生物安全性必须要得到充分的重视[１４].因此本试验研究了粪肠球菌SＧ５０和SＧ４株对１５种抗生素的敏感性,结果表明２株菌对羧苄西林㊁哌拉西林㊁四环素㊁头孢唑林㊁氧氟沙星㊁头孢拉定㊁万古霉素㊁头孢呋辛㊁头孢哌酮㊁氯霉素㊁头孢他啶和头孢曲松表现出敏感和中等敏感;而对青霉素㊁苯唑西林和红霉素表现为耐受.肠球菌对青霉素结合蛋白(P B P s)产物的低亲合力,以及肠球菌几乎不产生βＧ内酰胺酶的特性,从而导致对青霉素和氨苄西林具有耐药性[１５].因此,在抗生素与这２株粪肠球菌搭配使用过程中,应考虑抗生素种类及浓度的合理选择,以更好的发挥菌株的作用.本试验结果表明分离得到的２株粪肠球菌具有优良益生菌的益生特性,作为猪源益生菌具有较好的应用前景.下一步将进行该菌株抗仔猪细菌性腹泻作用研究,为研发猪用微生态制剂提供优良菌种资源,为实现健康生态养殖提供依据.参考文献:[１]㊀I C H I K A W A H,K U R O I W A T,I N A G A K I A,e t a l．P r o b i o t i c b a c t eＧr i a s t i m u l a t e g u t e p i t h e l i a l c e l l p r o l i f e r a t i o n i n r a t[J]．D i g e s t D i s S c i,１９９９,４４(１０):２１１９Ｇ２１２３．[２]㊀I N D U P A L K,K A NWA L J I T C,AMA R P R E E TS．P r o b i o t i c s: p o t e n t i a l p h a r m a c e u t i c a l a p p l i c a t i o n s[J]．E u r JP h a r m a c e uS c i,２００２,１５(１):１Ｇ９．[３]㊀Z H A N G H,WA N G H,S H E P H E R D M,e ta l．P r o b i o t i c sa n d v i r u l e n t h u m a n r o t a v i r u sm o d u l a t e t h e t r a n s p l a n t e dh u m a n g u tm i c r o b i o t a i n g n o t o b i o t i c p i g s[J]．G u tP a t h o g e n s,２０１４,６(１):３９．[４]㊀S A L M I N E N S,I S O L A U R IE,S A L M I N E N E．C l i n i c a l u s e so f６２１动物医学进展㊀２０２０年㊀第４１卷㊀第９期(总第３２７期)p r o b i o t i c sf o rs t a b i l i z i n g th e g u t m u c o s a lb a r r i e r :s u c c e s s f u l s t r a i n s a n df u t u r ec h a l l e n g e s [J ]．A n t o n i e V a n L e e u w e n h o e k ,１９９６,７０(２Ｇ４):３４７Ｇ３５８．[５]㊀Z U C C O T T IG V ,M E N E G H I N F ,R A I MO N D IC ,e t a l ．P r o b i Ｇo t i c s i n c l i n i c a l p r a c t i c e :a no v e r v i e w [J ]．J I n tM e dR e s ,２００８,３６(１s u p p l ):１A Ｇ５３A．[６]㊀S A A R E L A M ,MO G E N S E N G ,F O N D ÉN R ,e ta l ．P r o b i o t i cb ac t e r i a :s a f e t y ,f u n c t i o n a la n dt e c h n o l o g i c a l p r o p e r t i e s [J ]．J B i o t e c h n o l ,２０００,８４(３):１９７Ｇ２１５．[７]㊀R I P AMO N T IB ,A G A Z Z IA ,B E R S A N IC ,e ta l ．S c r e e n i n g of s p e c i e s Ｇs p e c i f i c l a c t i ca c i db a c t e r i af o rv e a l c a l v e s m u l t i Ｇs t r a i n p r o b i o t i c a d ju n c t s [J ]．A n a e r o b e ,２０１１,１７(３):９７Ｇ１０５．[８]㊀K UMA R B A J A J B ,A N D R A B I T ,J J C L A E SI ,e ta l ．B i o Ｇp r o s p e c t i n g f o r f u n c t i o n a l l y Ｇpr o f i c i e n t p o t e n t i a l p r o b i o t i c s [J ]．C u r rN u t r i F o o dS c i ,２０１４,１０(４):２５１Ｇ２６３．[９]㊀崔艳红,韩庆功,崔艺佳,等．益生菌复合发酵料对断奶仔猪消化环境㊁血清生化指标和代谢激素水平的影响[J ]．西北农业学报,２０１８(１)．[１０]㊀D E V I S M ,A R C H E R AC ,H A L AM IP M．S c r e e n i n g,c h a r a c Ｇt e r i z a t i o na n d i nv i t r o e v a l u a t i o no f p r o b i o t i c p r o p e r t i e sa Ｇm o n g l a c t i ca c i db a c t e r i at h r o u g hc o m p a r a t i v ea n a l ys i s [J ]．P r o b i o t i c sA n t i m i c r o b i a l P r o t e i n s ,２０１５,７(３):１８１Ｇ１９２．[１１]㊀R AMM E L S B E R G M ,R A D L E R F ．A n t i b a c t e r i a l p o l y p e pt i d e s o f L a c t o b a c i l l u s s p e c i e s [J ]．J A p pl M i c r o b i o l ,２０１０,６９(２):１７７Ｇ１８４．[１２]㊀李雪莉,王㊀超,虞德夫,等．猪源乳酸菌的分离㊁鉴定及其生物学特性[J ]．微生物学报,２０１７,５７(１２):１８７９Ｇ１８８７．[１３]㊀许光胜,王喜亮,吴㊀涛,等．猪源粪肠球菌的分离㊁鉴定及应用[J ]．中国兽医学报,２０１２,３２(１１):１６４５Ｇ１６５０．[１４]㊀G U P T A M ,K UMA RB A J A JB ．S e l e c t i o nc r i t e r i a f o r p r o b i o t Ｇi c s a n d p o t e n t i a l o f c e r e a l b a s e d f o o d p r o d u c t s a s n o v e l p r o b i Ｇo t i c Ｇc a r r i e r s [J ]．C u r rN u t r i F o o dS c i ,２０１６,１２(３):１５７Ｇ１７４．[１５]㊀顾㊀欣,商㊀军,张文刚,等．猪源分离粪肠球菌的耐药性及基因型分析[J ]．中国抗生素杂志,２０１７,４２(３):２２５Ｇ２２９．I s o l a t i o na n d I d e n t i f i c a t i o no f E n t e r o c o c c u s f a e c a l i s f r o mS w i n eS H IC h u n Ｇw e i ,X I EJ i n g ,Y A N G G u i Ｇl i a n ,WA N GC h u n Ｇf e n g(C o l l e g e o f A n i m a l S c i e n c e a n dT e c h n o l o g y J i l i nP r o v i n c i a lE n g i n e e r i n g R e s e a r c hC e n t e r o f An i m a lP r o b i o t i c s ,J i l i nA g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y ,C h a n gc h u n ,J i l i n ,１３０１１８,C h i n a )A b s t r a c t :T h e p r o b i o t i c b a c t e r i aw e r e i s o l a t ed f r o mt hef r e s h p ig l e t f e c e s ,a n d th e p o t e n ti a l pr o b i o t i c s t r a i n s a d a p t e d t o s w i n e p r o d u c t i o nw e r e s c r e e n e d t o l a y t h e f o u n d a t i o n f o r f u r t h e r d e v e l o p m e n t o fm i c r o Ｇe c o l o g i Ｇc a l p r e p a r a t i o n s f o r s w i n e ．T h e f r e s h p i g l e t f e c e s i nS h u a n g y a n g we r ec o l l e c t e da n d E n t e r o c o c c u sf a e c a l i s w e r e p u r i f i e d ．T h e n ,e x c e l l e n t p r o b i o t i cb a c t e r i as t r a i n sw e r es e l e c t e db y a c i da n db i l es a l t r e s i s t a n c e ,a n d a n t i m i c r o b i a l a c t i v i t y e x p e r i m e n t s ,a n d１６Sr D N As e q u e n c eh o m o l og y a n a l y s i sw a s p e r f o r m e dt oa n a l yz e t h e s p e c i e s ．T h e g r o w t h o f c a n d i d a t e b a c t e r i aw a s e v a l u a t e d ．T h e s e n s i t i v i t y t o f i f t e e n c o mm o n l y us e d a n t i b i Ｇo t i c sw a s f u r t h e rt e s t e d ．T w os t r a i n so f E n t e r o c o c c u s f a e c a l i s (S Ｇ５０,S Ｇ４)w e r e i s o l a t e d ．F u r t h e rs t u d i e s s h o w e d t h a t t h e t w o s t r a i n s h a d g o o d g r o w t h p e r f o r m a n c e ,a c i d a n d a n d b i l e s a l t r e s i s t a n c e ,a n dw e r e s e n s i Ｇt i v e t om o s t a n t i b i o t i c s ．T h e t w o s t r a i n s o f E n t e r o c o c c u s f a e c a l i s o b t a i n e dw o u l d p r o v i d e a t h e o r e t i c a l b a s i s f o r t h e d e v e l o p m e n t o f a n i m a l p r o b i o t i c s p r e pa r a t i o n s ．K e y wo r d s :p i g l e t ;E n t e r o c o c c u s f a e c a l i s ;i s o l a t i o n ;i d e n t i f i c a t i o n ７２１石春卫等:猪源粪肠球菌的分离与鉴定。

牛源粪肠球菌的分离鉴定及药敏试验作者：彬彬郭继文来源：《农民致富之友》2010年第20期肠球菌属(Enterococcus)细菌为兼性厌氧的革兰氏阳性球菌，是人、犬、禽、猪、马等动物胃肠道正常菌群之一，也广泛分布于土壤、水和食物中。

长期以来被认为致病力较低而未引起重视，但近年来，肠球菌属条件致病菌所致感染的发生率持续升高，尤其在原有严重基础疾病及机体免疫力降低时，极易侵入体内或易位，导致局部或全身重症感染，给临床治疗带来困难。

１材料与方法１.1材料１.1.1粪样选自黑龙江垦区某农场的40头健康荷斯坦泌乳牛，采集其新鲜粪便作为试验材料。

１.1.2培养基血平板、胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）、普通营养琼脂、麦康凯琼脂、SS琼脂、葡萄糖肉汤、营养肉汤、生化鉴定管等均购自广东环凯生物科技有限公司。

１.1.3试验动物18～26 g健康的小白鼠。

１.2方法１.2.1粪样的采集肛门式采集。

用无菌橡胶手套直接从试验牛的肛门采集新鲜粪样，分别装入无菌蓝盖试剂瓶中，立即送实验室4 ℃保存备用。

１.2.2细菌的分离鉴定１.2.2.1细菌的分离纯化培养将新鲜粪样接种于葡萄糖肉汤中，置37℃，18～24h，进行增菌培养。

再将肉汤培养物接种到KF链球菌琼脂上，置37℃，培养24h。

将可疑菌落进行涂片、革兰氏染色、镜检。

并接种于胰蛋白胨大豆琼脂、营养琼脂、血平板、麦康凯琼脂和葡萄糖肉汤、营养肉汤培养基中，置37℃培养18～24h，观察菌落生长状况。

观察细菌生长状况以及菌落形态特征，并将其进一步纯化培养。

将所得纯培养物置胰蛋白胨大豆琼脂斜面保存备用。

１.2.2.2触酶试验从固体培养基上挑取1接种环待检菌,置于洁净玻片上，再滴加3%过氧化氢一大滴，立即观察结果。

在30s内产生大量气泡者为阳性，不产生气泡者为阴性。

１.2.2.3溶血试验用平板法测定分离菌的溶血特性，即取分离菌接种于血平板上，于37℃培养24 h后观察菌落周围溶血现象。

粪便中病原菌的分离培养与鉴定[摘要]目的：从粪便中分离、培养和检测病原菌，对于临床治疗及预后调查有一定的价值。

粪便标本中常见的病原菌有志贺氏菌属、致病性大肠杆菌、弧菌属、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等，各种正常菌群含量甚多，仅以染色性和形态无法分辨是否为病原菌。

此次我们主要分离培养并鉴定粪便标本中的大肠埃希菌和痢疾志贺菌[3]。

方法：本文利用伊红美蓝平板培养后的菌落特征，再提纯培养细菌进行革兰染色镜检、动力实验、生化反应。

可鉴定粪便标本中的病原菌。

[关键词]革兰染色大肠埃希菌志贺菌分离培养鉴定1.实验材料与仪器1.1标本：粪便标本1.2培养基：普通琼脂平板、伊红美蓝平板、营养琼脂斜面培养基、营养肉汤液体培养基、半固体琼脂培养基1.3试剂：细菌干粉培养基革兰染色法[1]试剂【结晶紫、碘酒、95%乙醇、稀释复红】、糖发酵管【乳糖、葡萄糖】、褔氏志贺菌诊断血清。

1.4仪器：接种环、接种针、酒精灯、试管架、恒温培养箱、显微镜、蒸馏水、玻片缸、消毒液、1‰新洁尔灭、灭菌平皿、刻度吸管、吸水纸、橡皮筋。

2.实验过程2.1细菌的分离与培养细菌分离培养：伊红美蓝平板分区划线分离（5区）。

无菌操作取粪便标本于固体平板培养基上，采用分区画线分离法培养细菌。

于37℃培养24小时，从而分离出单个菌落。

2.2细菌群体生长特征的观察观察形成菌落的大小、形状、边缘、表面、色素。

粪便标本在伊红美蓝平板上，有紫黑色、淡粉红色两种菌落。

紫黑色菌落具有金属光泽、大而隆起、不透明，菌落直径2～3mm。

淡粉红色菌落，半透明，直径1～2mm。

2.3细菌纯培养粪便标本在伊红蓝平板上，有紫黑色，粉红色两种菌落。

分别挑选这两种菌落在斜面培养基上接种标记，在37℃培养24h。

2.3.1斜面接种法选择平板上相同的菌落数多的、典型的、容易挑取的单菌落在平皿底部玻璃上，画个大圈选择菌落，右手拿接种环通过火焰烧灼灭菌，再用灭菌的接种环套住菌落，轻刮取菌，将其伸入代接斜面试管底部，轻轻向上划线，接接种环退出斜面试管，再用火焰烧管口，并在火焰边将试管塞塞上，观察斜面培养基。

饲用粪肠球菌检测标准一、饲用粪肠球菌检测标准的重要性咱都知道，在养殖这一块啊，饲用粪肠球菌可重要啦。

它要是没检测好，那可就乱套咯。

就像咱们做饭得知道食材有没有坏一样，检测这个粪肠球菌也是为了保证饲料的质量呢。

要是饲料里这个菌有啥问题，那吃饲料的小动物们可能就会生病，这可不得了。

所以啊，咱们得有个严格又靠谱的检测标准。

二、检测样本的采集这检测的第一步就是采集样本啦。

那从哪采呢？饲料呗。

不过这饲料可不能随便采，得有讲究。

比如说，要从不同的饲料批次采，而且得采那些有代表性的地方。

不能光采表面的，还得往里头挖一挖呢。

这就好比咱们吃西瓜，不能光看西瓜皮好不好，还得尝尝里面甜不甜呢。

而且采集的工具得干净卫生，不能把其他的细菌啥的给带进去了，那就会影响检测结果啦。

三、检测环境的要求检测这个菌啊，环境也很重要。

首先呢，检测的地方得干净，不能脏兮兮的。

温度也要合适，不能太热也不能太冷。

太热的话，可能菌就活跃得不正常了，太冷呢，可能菌就不咋动了，这都会让检测结果不准确。

就像咱们人，在特别热或者特别冷的地方都不舒服，菌也是一样的道理呀。

四、检测的具体方法1. 培养法把采集来的样本放到专门的培养基里。

这个培养基就像是菌的小房子，里面有菌生长需要的营养物质。

然后就等着菌在里面慢慢长啦。

不过这期间得注意观察，看看菌长得咋样，有没有啥异常。

这就像是种小植物一样，得时不时看看它有没有缺水或者长虫啥的。

培养的时间也很关键。

时间短了，菌可能还没长好，时间长了，可能菌就长得太多或者变质了。

所以得按照规定的时间来，这个时间一般是经过很多次试验得出来的，可不能随便改。

2. 基因检测法现在科技发达了，咱们还可以用基因检测的方法。

就是看看菌的基因序列，这样能更准确地知道这个菌到底是不是咱们要检测的粪肠球菌。

这个方法虽然高级，但是对设备和技术人员的要求也高。

设备得是很精密的，技术人员得经过专门的培训，不然很容易出错的。

五、检测结果的判定检测完了，就得看结果了。

第1篇一、实验目的1. 学习肠球菌的分离与培养方法。

2. 掌握肠球菌的形态、培养特性及生化反应。

3. 提高微生物实验技能。

二、实验原理肠球菌是一种革兰氏阳性球菌，广泛分布于自然界、动物体内和人类肠道中。

肠球菌对多种抗生素有抵抗力，是医院感染的重要病原菌之一。

本实验通过分离培养肠球菌，观察其形态、培养特性及生化反应，以鉴定其种类。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 肠道内容物- 生理盐水- 0.1%氯化钠溶液- 1%氢氧化钠溶液- 5%硫酸铜溶液- 10%氯化钠溶液- 2.5%碘酊- 生理盐水- 水浴锅- 培养皿- 移液器- 显微镜- 细菌培养箱- 酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒2. 实验仪器：- 电子天平- 高压蒸汽灭菌器- 离心机- 培养箱- 移液器- 显微镜四、实验方法1. 样品处理：- 取适量肠道内容物，加入生理盐水，充分混匀。

- 将混合液进行10倍稀释，取适量稀释液加入0.1%氯化钠溶液中，制成悬液。

2. 分离培养：- 将悬液涂布于含有0.1%氯化钠溶液的平板上，37℃培养24小时。

- 观察菌落特征，挑取典型菌落进行进一步鉴定。

3. 形态观察：- 将菌落制成涂片，进行革兰氏染色，显微镜下观察菌体形态。

4. 培养特性：- 将挑取的菌落接种于生理盐水、0.1%氯化钠溶液、5%硫酸铜溶液、10%氯化钠溶液、2.5%碘酊等培养基上，37℃培养24小时，观察菌落生长情况。

5. 生化反应：- 对挑取的菌落进行触酶试验、氧化酶试验、葡萄糖发酵试验、乳糖发酵试验等生化反应，以鉴定其种类。

6. 肠球菌鉴定：- 使用ELISA试剂盒对分离得到的菌进行肠球菌检测。

五、实验结果1. 样品处理：肠道内容物悬液呈均匀乳白色。

2. 分离培养：平板上出现圆形、光滑、边缘整齐、白色、直径约为1mm的菌落。

3. 形态观察：菌体呈球形，革兰氏染色呈阳性。

4. 培养特性：在生理盐水、0.1%氯化钠溶液、5%硫酸铜溶液、10%氯化钠溶液、2.5%碘酊等培养基上均能生长。