逆转录病毒载体介导DNA转染

AP转染实验步骤转染是指将外源基因导入细胞内的一种生物学技术。

转染可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。

物理介导方法有电穿孔法、显微注射和基因枪法,化学介导方法很多,如磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导技术,生物介导方法,有较为原始的原生质体转染,和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。

病毒载体是以病毒为基础进行改造而获得的载体,已经成为目前最常用的转染方式之一。

通过对病毒基因组进行改造,能够使其携带外源的目的基因。

将其包装成病毒颗粒后,通过侵染宿主细胞,能够将外源目的基因一并带入宿主细胞中。

与传统方法相比,病毒转染在真核细胞中的效率更高,尤其是在传统方法难以发挥作用的哺乳动物实验中,病毒转染法发挥着重要的作用。

病毒转染系统的分类:目前常用的病毒载体包括慢病毒载体、腺病毒载体和逆转录病毒载体。

慢病毒载体:慢病毒载体是以HIV-1(人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体。

和普通逆转录病毒载体不同的是,它对分裂细胞和非分裂细胞均都具有感染能力。

慢病毒载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上,从而达到持久性表达。

腺病毒载体:腺病毒载体是以腺病毒发展出的一类载体。

和慢病毒载体不同的是,腺病毒载体不会将外源目的基因或自身的病毒基因整合到宿主细胞的基因组中,而是游离在宿主基因组外独立的表达。

基于这一特性,腺病毒载体能够实现外源基因的瞬时表达,同样也由于不对宿主基因组进行整合而避免了潜在的基因突变,具有更好的可控性。

逆转录病毒表达载体:逆转录病毒是一种单链RNA病毒,它是能够在逆转录酶的作用下将RNA转变成cDNA,再在DNA复制、转录、翻译等蛋白酶作用下扩增的一类病毒。

根据逆转录病毒的一些特性设计出的一种复制缺陷性病毒,使其成为能够携带某种特异目的基因的表达载体,即逆转录病毒载体。

病毒转染细胞的方法(以慢病毒为例):慢病毒转染贴壁细胞实验方法1、慢病毒转染前18-24小时,将贴壁细胞以1×105/孔铺到24孔板中。

转化：将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内使之获得新的遗传特性。

转染（transfection）:将含有目的gene的载体转到真核cell内
转导：指以噬菌体为载体，在细菌之间转移DNA的过程。

有时也指在真核cell之间通过逆转录病毒转移和获得cellDNA的过程。

1.质粒转染（transfection）
6-well-plate 每well 60-70%时transfection
接种时×105个/ml/well
质粒DNA 转染液优化培养基opti-MEM
步骤：质粒DNA + 200ul opti-MEM + 6ul转染液混匀室温静置15min 待转染cell换优化培养基，切记要轻轻加培养基，勿冲起cell 把transfection complex(200ul)轻轻均匀滴入cell培养基中，十字形摇晃plate,混匀
37℃，CO2培养箱培养
2.
转化：外源DNA(质粒作为载体)导入受体细胞（大肠杆菌感受态cell）步骤：
50ul感受态cell（一管）加入12ul质粒DNA→轻柔混合
↓
冰浴30min
↓
42℃热激90s
↓
迅速冰浴2min
↓
向管中加入培养基，混匀后37℃震荡培养（﹤225rpm）1h,使细菌恢复正常生长状态
↓
涂板正培1h后，倒培过夜。

转染和转化的区别转染的定义是“将具生物功能的核酸转移或运送到细胞内并使核酸在细胞内维持其生物功能”。

其中，核酸包括DNA（质粒和线性双链DNA），反义寡核苷酸及RNAi（RNA interference）。

基因转染技术已广泛应用于基因组功能研究（基因表达调控，基因功能，信号转导和药物筛选研究）和基因治疗研究。

基因转染需要一定的转染试剂将带有目的基因的载体运送到细胞内。

早期的磷酸钙转染法转染效率很低，且对很多细胞株无效，因此不能满足很多科研工作的需要。

目前，最常用的转染试剂是阳离子脂质体和阳离子聚合物，它们在克服细胞屏障方面跟病毒有很相象的特征，容易透过细胞膜。

其中，阳离子脂质体在体外基因转染中有很高的效率，然而在体内，它迅速被血清清除，在肺组织内累积，诱发强烈的抗炎反应，这将导致高水平的毒性，因此，在很大程度上限制了其应用。

由于阳离子脂质体的局限性，阳离子聚合物转染试剂日益受到重视。

转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。

它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。

受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2等化学试剂法）处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。

进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。

由外来DNA引起生物体遗传性状改变的过程称为转化(transformation)。

噬菌体常常可感染细菌并将其DNA注入细菌体内，也可引起细菌遗传性状的改变。

通过感染方式将外来DNA 引入宿主细胞，并导致宿主细胞遗传性状改变的过程称为转染(transfection)。

转染是转化的一种特殊形式。

基因工程:有目的的通过分子克隆技术，人为的操作改造基因，改变生物遗传性状的系列过程。

载体:能在连接酶的作用下和外源DNA片段连接并运送DNA分子进入受体细胞的DNA分子。

生物技术制药1.大分子和小分子药物的区别大分子：多肽蛋白，来源于生物体，不容易提纯；小分子：为化学小分子，来源于化学合成，容易提纯。

2.有哪些方法合成第二链cDNA。

1）selfpriming；2）Replacementsynthesis。

3.有哪些引物用来合成cDNA第一链1）oligodT(n=12~18)，它引导的cDNA合成必须从3’开始；2）随机引物（n=6），随机合成6~10寡核苷酸片段作为引物；3）基因特异性引物（n=18~25），当RNA序列或部分序列已知时。

4.与RT—PCR相比，建立的cDNA文库有什么好处。

1）cDNA文库是以mRNA为材料，排除了真核基因组内含子的干扰，而且对于一些RNA 病毒来说，cDNA文库是研究它们的唯一可行的方法；2）cDNA基因文库的筛选简单易行；3）由于每一个cDNA克隆都代表一种mRNA序列，这样在选择中出现假阳性的几率比较低；4）cDNA是双链可以克隆到载体上，能无限扩增，可以随时满足需要，RT—PCR的产物第一链cDNA为单链，不能扩增，一旦用完就没有了。

5.在哺乳动物细胞中表达常用的启动子。

SV40、CMV、MLP6.逆转录病毒载体的主要结构。

1）2个LTR（长末端重复序列）（其插入宿主基因组作用，5’还有启动子作用）；2）φ（装配信号，指导结构蛋白表达）；3）MCS（多克隆位点）；4）backbone（大肠杆菌中增殖必备部分）。

7.哺乳动物细胞表达载体的主要表达元件。

启动子、载体的转录终止信号和高效多聚腺苷酸（ploy(A)）加尾信号、选择标记基因。

8.什么是转染？在完成基因克隆之后，大多数的研究人员希望重新把这个基因的自然体和突变体导入到各种细胞来分析它的功能特点，这个过程称之为转染。

9.有哪些转染哺乳动物细胞的方法？（一)非病毒介导转染法：1）钙转染法（沉淀）；2）脂质体转染法（形成双层质膜包埋DNA）；3）DEAE—葡聚糖转染技术促进哺乳动物细胞捕获外源DNA）；4）电转染（在高压电脉冲作用下使细胞膜上出现微小孔洞，促使细胞吸收）；5）压缩DNA转染法（将DNA压缩成为小颗粒）；6）利用细胞周期转染法（利用G2/M周期细胞分裂时细胞膜的空隙增大）；7）显微注射法（直接将目的基因通过注射器注入受体细胞中）；8）提高转染率（提高细胞内的激酶的pH）；（二）病毒介导转染法：逆转录病毒介导法，病毒介导法（通过感染宿主细胞将外源基因整合到染色体中）。

各种转染方法比较不同的实验室转染方法选择会依赖于多个相关因素，如目标细胞类型、转染效率、细胞毒性、需求的表达时间、实验的规模和预算等。

以下是一些常见的转染方法的比较：1. 离子交换法（Calcium phosphate transfection）离子交换法是最早开发和使用的转染方法之一、它使用磷酸钙和DNA或RNA的复合物在细胞表面形成凝析沉淀物。

该方法简单、经济且较为普遍，适用于许多细胞类型。

然而，它的转染效率较低，存在较多的细胞毒性。

2. 迷走转染法（Lipofection）迷走转染法是当前最常用的转染技术之一，通过磷脂体（例如Lipofectamine）与质粒DNA形成复合物。

该方法转染效率高，而且适用于许多类型的细胞，包括哺乳动物和非哺乳动物。

然而，迷走转染法存在一些限制，如细胞毒性、稳定性较差，和细胞特异性。

3. 电穿孔法（Electroporation）电穿孔法是通过应用电场使细胞膜暂时性孔化来实现转染效果。

它可以用于转染各种类型的细胞，包括哺乳动物、鸟类和植物。

电穿孔法的转染效率高，但存在一定的细胞毒性和细胞损伤风险。

此外，电穿孔设备的成本较高，需要专门训练的技术人员来操作。

4. 病毒载体转染法（Viral vector transfection）病毒载体转染法使用经修饰的病毒作为转染载体，可实现高效的基因传递和表达。

常用的病毒载体包括腺病毒、衣壳病毒和逆转录病毒。

这些病毒对于不同类型的细胞具有不同的亲和力和转染效率。

然而，病毒载体转染法的主要限制是细胞对病毒的感染能力，以及在临床应用中可能引发的安全性问题。

5. 直接注射法（Direct microinjection）直接注射法是一种机械刺伤细胞膜直接将DNA注入细胞的方法。

这种方法对于特定的细胞类型具有高效转染的能力，如哺乳动物受精卵和干细胞。

它可以实现精确控制和单细胞水平的转染，但需要昂贵的设备和专业技能。

总结起来，转染方法的选择应根据实验的具体需求来进行。

逆转录病毒介导系统感染原代培养人皮肤成纤维细胞张清华艾民1蒋知新沙杭高毅2卢海2（中国人民解放军三零五医院，北京100017）〔摘要〕目的利用包装生产逆转录病毒感染原代培养人皮肤成纤维细胞，为细胞重编程提供技术保证。

方法利用组织块贴壁法体外原代培养人皮肤成纤维细胞。

包装生产携带绿色荧光蛋白GFP 基因的逆转录病毒上清液。

收集逆转录病毒上清液感染原代培养人皮肤成纤维细胞，利用荧光显微镜观察逆转录病毒感染成纤维细胞。

结果体外成功原代培养出人皮肤成纤维细胞。

293T 细胞包装生产携带GFP 基因的逆转录病毒上清液。

包装生产后逆转录病毒成功地感染原代培养人皮肤成纤维细胞。

结论逆转录病毒介导系统是人皮肤成纤维细胞重编程的有效基因转移载体。

〔关键词〕逆转录病毒；人皮肤成纤维细胞；细胞重编程；诱导多潜能干细胞〔中图分类号〕R34〔文献标识码〕A〔文章编号〕1005-9202（2012）11-2297-02；doi ：10.3969/j.issn.1005-9202.2012.11.039基金项目：全军医药卫生科研基金项目（No.08Z017）；科学技术部867计划项目（No.2006AA02A141）1南方医科大学研究生院2南方医科大学再生医学研究所通讯作者：蒋知新（1963-），男，副主任医师，硕士，硕士生导师，主要从事心血管病研究。

第一作者：张清华（1950-），男，主任医师，教授，博士生导师，主要从事冠心病干细胞治疗研究。

胚胎干细胞（ESCs ）是具有无限增殖，自我更新和多向分化潜能的一种未分化细胞，在体外可被诱导分化为神经细胞〔1〕、平滑肌细胞、心肌细胞〔2〕、造血细胞〔3〕而用于多种疾病的治疗，具有广阔的研究和临床应用前景。

目前，ESCs 研究也存在着一些问题，如免疫排斥反应和伦理学问题的争论。

诱导多潜能干细胞技术是将多能性基因转染到已分化的体细胞，将其重编程为类似于ESCs 的多潜能干细胞，并被命名为“诱导多潜能干细胞”（iPSCs ），简称“iPS 细胞”〔4〕。

慢病毒转染增强剂说明书产品描述:Polybre ne （聚凝胺）是一种多聚阳离子聚合物，常用于哺乳动物细胞的DNA专染实验以增强脂质体的转染效率。

Polybrene目前广泛用于逆转录病毒介导的基因转染，慢病毒介导的基因转染，作用机理可能是通过中和细胞表面唾液酸与病毒颗粒之间的静电排斥从而促进吸附作用。

Polybrene也是一种有名的抗肝素剂（肝素拮抗剂）, 常用来生产非特异性凝集的红细胞。

另外Polybrene也多用于蛋白测序，因为小剂量的Polybrene在自动测序分析可明显改善多肽的降解现象。

PVDF膜加入polybrene还能提高膜的亲和性。

注：Polybrene对某些细胞（如末端分化的神经元，DC细胞）毒性较大，初次应用建议先做毒性测试［1］。

基本属性：另U 名：1,5-dimethyl-1,5-diaza un decamethyle ne polymethobromideCAS No.: 28728-55-4纯度：》94% （titration）溶解方法：溶于水，溶解能力高达10% 0.9%Nacl溶液配制1mg/mL的储存液，可以滤膜除菌或高压灭菌。

保存与稳定性：粉末2-8 C保存，避免潮湿。

1mg/mL储存液2-8 C, 至少一年保持稳定。

操作步骤(仅作参考)：实验1逆转录病毒感染(Retroviral Infection )(1)重组逆转录病毒原液的制备：取5ml生长培养基(5%血清) 加入约含单层转染逆转录包装细胞的100mm培养盘内。

孵育24h后，吸去培养液并用0.45卩m滤器过滤。

(2)待感染细胞的培养：100mm培养盘内加入10ml完全培养基，细胞密度为5X 105/盘。

(3)病毒感染：细胞培养24h后，吸去完全培养液。

用含polybrene 的2ml病毒上清 (或将病毒原液稀释到2ml)感染细胞，polybrene 的终浓度为5卩g-10卩g/ml。

37° C孵育3-6h。

转染步骤范文转染是指将外源DNA导入到受体细胞中的过程，用于基因工程、基因治疗等研究和应用。

转染步骤是实现转染的关键步骤，包括细胞培养、转染试剂制备、转染试剂处理、细胞培养和分析。

以下是转染步骤的详细描述。

第一步：细胞培养在进行转染实验之前，首先需要培养并扩增所使用的细胞。

细胞的培养基因常见的有DMEM、RPMI等，培养基中会添加适当的酵素抑制剂（如胰酶）和生长因子，以促进细胞的生长和增殖。

第二步：转染试剂制备转染试剂可以是化学试剂，也可以是病毒载体或质粒DNA。

化学试剂常见的有聚乙烯亚胺（PEI）、脂质体、阳离子聚合物等。

病毒载体包括腺病毒、逆转录病毒、腺相关病毒、大肠杆菌之Coli phage等。

质粒DNA则是将外源DNA经过酶切和纯化处理得到的。

第三步：转染试剂处理在这一步中，将转染试剂与细胞一起孵育，以使转染试剂与细胞内部的DNA互相结合。

转染试剂的使用方法根据具体试剂的特点而定，常见的方法有磷酸钙共沉淀、脂质体包裹、病毒载体包装等。

第四步：细胞培养和分析在细胞孵育一定时间后，可以对转染效率进行分析。

常见的分析方法包括荧光显微镜观察、流式细胞术、PCR等。

通过这些分析方法，可以观察到转染后的外源DNA是否成功导入到细胞，并根据实验需要进行下一步操作。

除了以上步骤，还有一些实验时需要注意的要点，例如选择合适的细胞密度和培养时间、优化转染条件、进行有效杀菌等。

同时，也需要仔细阅读相关实验操作手册，并参考先前类似研究的文献，以确保实验的准确性和可重复性。

总结起来，转染步骤是进行基因转染的重要环节，包括细胞培养、转染试剂制备、转染试剂处理、细胞培养和分析。

通过精确执行每个步骤，并结合适当的方法和实验操作要点，可以高效地将外源DNA导入到受体细胞中，实现基因工程和基因治疗等研究和应用的目的。

基因渗入方法
基因渗入方法是指将外源基因或修饰的基因导入到目标生物体中的技术手段。

以下是常见的基因渗入方法：
1. 转染法：将外源基因通过化学方法或物理方法导入目标细胞，使其表达特定蛋白或产生特定表型。

常用的转染方法包括钙磷共沉淀法、电穿孔法、脂质体转染法等。

2. 病毒载体介导的基因传递：利用经过改造的病毒作为基因载体，将目标基因导入到目标细胞中。

常用的病毒载体包括腺病毒、逆转录病毒和腺相关病毒等。

3. 基因枪法：利用高速微粒轰击技术，将外源基因以微粒的形式直接射入目标细胞的核内。

这种方法通常用于植物细胞的基因转化。

4. 转座子介导的基因转移：利用转座子（跳跃基因）的能力，将目标基因插入到目标生物体的基因组中。

转座子可以通过人工合成或自然存在。

5. 电转化法：利用高电压脉冲作用于目标细胞，改变细胞膜的通透性，使外源基因能够进入细胞内。

这种方法适用于细菌、酵母等微生物的基因转化。

6. 通过细胞融合实现基因渗入：将目标细胞与带有外源基因的细胞进行融合，使外源基因导入目标细胞中。

不同的基因渗入方法适用于不同的生物体和细胞类型，选择合适的方法需要根据具体的研究目的和条件进行判断。

此外，在进行基因渗入实验时，还需要考虑生物安全性、目标基因的选择和筛选以及表达效率等因素。

逆转录病毒包装系统时间：2009-07-31 13:46:30 来源：生物无忧作者：51atgc点击：1488次一、逆转录病毒概述反转录病毒是RNA病毒，但有反转录酶，可使RNA转录为DNA，再整合到宿主细胞基因组。

逆转录病毒即RNA病毒，需在逆转录酶的作用下首先将RNA 转变为cDNA，再在DNA复制、转录、翻译等蛋白酶作用下扩增的一类病毒。

逆转录病毒是RNA病毒，它有三个基因：gag-编码病毒的核心蛋白；pol-编码逆转录酶；env-编码病毒的被膜糖蛋白。

二、逆转录病毒的许多特点便于其发展成为动物基因克隆载体。

①就目前所知，在大多数情况下，逆转录病毒的肿瘤基因（oncogene，ONC）都能够在细胞中转录。

这种特性说明逆转录病毒有可能是一种天然的转录因子，同时根据这种特性，可以在正常细胞中进行操作，将它改建为有用的动物基因转移载体。

②逆转录病毒的寄主范围相当广泛，包括无脊椎动物，其中有的还能够在人体细胞中生长；③逆转录病毒不但感染效率高，而且通常不会导致寄主细胞的死亡，被它感染的或转化的动物细胞能够持续许多世代，保持正常生长和保持病毒感染性的能力。

逆转录病毒载体最大优点是(1) 转染范围广，可以感染各种细胞类型，如淋巴细胞或肝细胞、肌细胞等;(2) 转入的外源基因可完全整合(3) 对细胞感染率高，达到100 %(4) 感染细胞不产生病变，可建立细胞系长期持续表达外源基因三、逆转录病毒载体的包装原理逆转录病毒载体系统共由两部分组成：包装细胞系和缺陷病毒本身。

在逆转录病毒载体中，去除了正常的蛋白编码序列而保留了复制和包装信号，通过分子克隆技术将目的基因插入此载体上，而包装细胞系能提供病毒载体包装成病毒粒子所需的结构蛋白。

当重组病毒载体导入包装细胞后，缺陷病毒载体和包装细胞的互补作用共同完成病毒装配,该病毒颗粒可感染其他宿主细胞，此时目的基因进入该细胞并整合到细胞基因组中，导致插入序列在宿主细胞中表达，产生目的蛋白。

哺乳动物基因表达慢病毒载体
慢病毒载体系统是一种能非常高效的把外源基因稳定整合到哺乳动物细胞中的载体工具。

除了常规质粒转染外，目前该系统也是把外源基因转入哺乳动物细胞的最常用方法之一。

由于具有目的基因和启动子选择的灵活性以及转染细胞类型的广泛性两大特点，使得慢病毒载体系统成为倍受欢迎的外源基因表达系统。

慢病毒载体来源于人类免疫缺陷病毒HIV，属于逆转录病毒家族。

野生型慢病毒基因组是线性双正链RNA。

慢病毒重组载体构建完成后与辅助质粒一起转染进入包装细胞。

在包装细胞中，位于两个长末端重复序列（LTR）之间的DNA片段会被转录成RNA，由辅助质粒表达的病毒蛋白将其包装形成病毒颗粒。

包装后的活体病毒将会被释放到上清液中，可以直接收集或进一步浓缩病毒转染靶细胞。

当病毒转导靶细胞时，释放到宿主细胞中的病毒RNA借助逆转录酶逆转录成双链DNA，然后随机整合进宿主细胞的基因组中。

在病毒载体中，位于两个LTR的DNA片段和病毒基因组都会稳定整合到靶细胞的基因组中。

慢病毒转染原理
慢病毒转染是一种常用的基因传递技术，它利用慢病毒病毒粒子作为载体将目标基因导入靶细胞。

慢病毒是一类特殊的病毒，具有较高的感染效率和稳定的基因表达能力，因此被广泛应用于基因转染领域。

慢病毒转染的基本原理可以分为以下几个步骤：
1. 构建慢病毒载体：首先，将目标基因插入到慢病毒载体的适当位点上。

慢病毒载体通常包括了病毒的基因组结构，例如表达型蛋白、包装型蛋白等。

2. 包装慢病毒：将构建好的慢病毒载体导入特定细胞系，并通过培养和传代扩增病毒。

这些细胞会产生足够多的慢病毒病毒颗粒。

3. 收集病毒颗粒：从培养基中收集慢病毒病毒颗粒。

通常，病毒颗粒可以通过浓缩和超速离心等方法获得。

4. 转染靶细胞：将收集到的病毒颗粒加入待转染的靶细胞培养基中。

病毒颗粒会与细胞表面的受体结合，进入细胞。

5. 病毒基因组整合到靶细胞基因组：一旦进入细胞内，慢病毒会释放出自己的遗传物质，包括病毒基因组RNA和逆转录酶。

逆转录酶能够将病毒基因组的RNA逆转录成DNA，并将其整合到宿主细胞的染色体上。

从而实现病毒基因的稳定表达。

综上所述，慢病毒转染是一种利用慢病毒病毒粒子作为载体将基因导入到靶细胞的技术。

通过包装慢病毒病毒颗粒，并与靶细胞进行转染，实现了基因的稳定表达。

这种技术在基因治疗、基因功能研究等领域具有重要的应用价值。