逆转录病毒操作资料说明

汉恒逆转录病毒操作手册一、逆转录病毒的试用装分装与储存1.收到汉恒生物逆转录病毒产品后，请先对逆转录病毒产品进行分装处理，建议20-50μl/管。

如1-2天内使用，则留足够量病毒4℃保存，余下逆转录病毒置于-80℃长期保存。

2.病毒可以存放于-80℃ 6个月以上；但如果病毒储存时间超过6个月，建议在使用前重新测定病毒滴度。

3.反复冻融会降低逆转录病毒滴度：逆转录病毒滴度越低，冻融对滴度的影响越大，108IU/ml的逆转录病毒冻融2次滴度没有显著性差异，第3次冻融开始，每冻融一次滴度降低约10%；滴度107IU/ml滴度逆转录病毒，从第2次冻融开始，每次冻融病毒滴度下降10%-15%。

二、逆转录病毒试用装实验策略与关键知识点1.逆转录病毒感染策略：逆转录病毒本身的病毒滴度不高，感染细胞时病毒消耗量较大，试用装体积较小，建议使用96孔板进行MOI梯度感染测试。

逆转录病毒感染细胞后会反转录并插入基因组形成稳转，因此逆转录病毒感染一般采用感染少量细胞，然后将细胞放大化培养。

而不是直接大量感染。

注意：对于一些传代能力较差的原代细胞，比如BMSC等，建议采用腺病毒感染。

2.逆转录病毒感染关键知识点1）细胞准备：由于试用装体积有限，请使用96孔板准备细胞，逆转录病毒感染细胞前，请确保目的细胞状态良好、无支原体污染。

逆转录病毒感染的时候细胞汇合率为40%～60%间为宜。

2）感染细胞最佳MOI的测定：MOI（感染复数）是指每个细胞感染的病毒数。

逆转录病毒对于不同种类不同来源的细胞，其最适MOI各有差别，原则上最适MOI是感染效率较好的最低MOI。

MOI一般以3：10：30：100的比例递增进行梯度摸索，一般的细胞基础逆转录病毒感染MOI 可从3为开始，即设立4个常规的MOI摸索，即3，10，30，100。

3)助转剂polybrene的选择：实验证明，polybrene可提高逆转录病毒对大部分细胞的感染效率，但polybrene 有一定的细胞毒性，不同细胞对polybrene的敏感度不同，polybrene最常用的工作浓度为5～8μg/ml。

医学微生物学课件第30章：逆转录病毒一、引言逆转录病毒（Retroviruses）是一种RNA病毒，具有逆转录酶（reversetranscriptase，RT）活性，能够将病毒RNA转录成DNA，并插入宿主细胞的基因组中。

这种独特的复制方式使得逆转录病毒在生物医学领域具有广泛的应用价值，如基因治疗、基因工程等。

本章将详细介绍逆转录病毒的生物学特性、分类、生命周期、致病机制以及防治策略。

二、逆转录病毒的生物学特性1.结构特征逆转录病毒颗粒呈球形，直径约为100-120纳米。

病毒颗粒由核心、衣壳和包膜三部分组成。

核心含有病毒RNA、逆转录酶、病毒蛋白等；衣壳呈二十面体对称，由病毒蛋白组成；包膜来源于宿主细胞，含有病毒糖蛋白。

2.基因组结构逆转录病毒的基因组为单链正链RNA，长度约为9-11千碱基对（kb）。

基因组包含5'和3'非翻译区（UTR）、Gag、Pol、Env和辅助蛋白基因。

其中，Gag编码衣壳蛋白，Pol编码逆转录酶和整合酶，Env编码病毒包膜糖蛋白，辅助蛋白基因参与病毒复制、装配和释放等过程。

3.逆转录酶活性逆转录酶是逆转录病毒复制的关键酶，具有DNA聚合酶、RNA 聚合酶和DNA内切酶活性。

在病毒复制过程中，逆转录酶将病毒RNA转录成单链DNA，然后合成双链DNA，将双链DNA整合入宿主细胞基因组。

三、逆转录病毒的分类逆转录病毒可分为两大类：简单逆转录病毒和复杂逆转录病毒。

1.简单逆转录病毒简单逆转录病毒包括HIV、SIV、FIV等，它们的基因组结构较为简单，仅含有Gag、Pol、Env和辅助蛋白基因。

这类病毒主要感染哺乳动物，如人类免疫缺陷病毒（HIV）感染人类，导致艾滋病。

2.复杂逆转录病毒复杂逆转录病毒的基因组结构较为复杂，含有多个基因家族，如长末端重复序列（LTR）、整合酶、病毒蛋白等。

这类病毒主要感染鸟类、哺乳动物和昆虫，如劳斯肉瘤病毒（RSV）感染鸟类，诱发肉瘤。

医学微生物学课件第30章逆转录病毒contents •逆转录病毒概述•逆转录病毒基因组结构•逆转录病毒感染过程•逆转录病毒与疾病关系•逆转录病毒检测方法•逆转录病毒防治策略目录01逆转录病毒概述定义与特点定义逆转录病毒是一种RNA病毒，其复制过程需要通过逆转录酶将RNA转录为DNA，再整合到宿主细胞基因组中进行复制。

特点逆转录病毒具有独特的复制方式，其基因组为单股正链RNA，病毒颗粒内含有逆转录酶和整合酶等关键酶类，对宿主细胞具有高度的寄生性和致病性。

致癌病毒亚科如人类T 淋巴细胞白血病病毒（HTLV ）、禽白血病病毒（ALV ）等，与多种肿瘤的发生密切相关。

慢病毒亚科包括人类免疫缺陷病毒（HIV ）、猴免疫缺陷病毒（SIV ）等，主要引起免疫系统损伤和获得性免疫缺陷综合征（AIDS ）。

泡沫病毒亚科如人类泡沫病毒（HFV ）、猴泡沫病毒（SFV ）等，主要感染灵长类动物，与某些疾病的发生有关，但致病机制尚不完全清楚。

逆转录病毒分类致病机制逆转录病毒通过整合到宿主细胞基因组中，干扰宿主细胞的正常生理功能，导致细胞增殖失控、凋亡异常等病理变化，进而引发疾病。

基因组结构逆转录病毒的基因组为单股正链RNA ，长度从几千到上万核苷酸不等，具有多个开放阅读框（ORF ），编码病毒的结构蛋白、酶类和调节蛋白等。

复制周期逆转录病毒的复制周期包括吸附、穿入、脱壳、逆转录、整合、转录、翻译、装配和释放等阶段，其中逆转录和整合是逆转录病毒复制的关键步骤。

宿主范围逆转录病毒可以感染多种细胞类型，包括淋巴细胞、巨噬细胞、造血干细胞等，不同病毒对宿主细胞的偏好性不同。

生物学特性02逆转录病毒基因组结构核心基因逆转录酶基因包膜蛋白基因附属基因基因组组成编码病毒的核心蛋白，这些蛋白是构成病毒核衣壳的主要成分，对病毒粒子的组装和稳定性至关重要。

编码病毒包膜蛋白，这些蛋白参与病毒粒子的组装、释放以及病毒进入宿主细胞的过程。

编码逆转录酶，该酶是逆转录病毒复制周期中的关键酶，负责将病毒RNA逆转录为DNA。

逆转录病毒详细介绍逆转录病毒科是含有逆转录酶的RNA病毒。

人类免疫缺陷病毒（HIV）所致疾病称为获得性免疫缺陷综合征（AIDS）。

HIV包括HIV-1和HIV-2两个型别。

病毒核衣壳外侧包有两层膜结构，内层是内膜蛋白，最外层是脂质双层包膜，包膜表面有由糖蛋白gpl20和gp41组成的刺突。

（二）病毒的复制HIV的靶细胞主要是CD4+细胞。

CD4+细胞表面的CD4分子是HIV的主要受体，一些趋化受体是HIV的辅助受体，主要是CXCR4和CCR5。

二、致病性（一）传染源和传播途径AIDS的传染源是HIV携带者及AIDS患者。

主要传播途径有三种：1.性传播：2.血液传播：3.垂直传播：（二）感染过程包括原发感染急性期、无症状潜伏期、AIDS相关综合征及典型AIDS四个阶段。

三、微生物学检查法（一）检测抗体主要用于筛查（如供血者）和确认HIV感染。

我国规定，对供血者筛查时必须检查HIV抗体。

常用ELISA试验筛查HIV抗体（初筛试验），阳性者必须进行确认试验。

确认试验常用特异性高的蛋白印迹（Western blot）试验检测两种HIV抗原的抗体（如p24和gpl20抗体），方可确定诊断。

目前主要用于临床的药物有抑制病毒复制的核苷类及非核苷类反转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂。

2、HIV感染人体后，病毒包膜糖蛋白刺突gp120与靶细胞膜上的特异性受体CD4分子结合。

“120的医生抢了4张CD”3、HIV感染过程中常见机会性感染的真菌病：白色念珠菌鹅口疮、肺孢子菌性肺炎、隐球菌性亚急性脑膜炎等；病毒感染：人疱疹病毒8型——Kaposi肉瘤；EB病毒——Burkit 恶性淋巴瘤；人乳头瘤病毒——宫颈癌4、鸡尾酒疗法：2种逆转录酶抑制剂（AZT和3TC）+一种蛋白酶抑制剂（IDV）。

u6内参逆转录加尾法概述说明以及解释1. 引言1.1 概述本文旨在探讨和说明U6内参逆转录加尾法的原理、实验步骤以及其应用案例。

U6内参逆转录加尾法是一种常用的生物分子研究方法，通过在mRNA反向转录过程中引入特定的尾部序列，可以在后续研究中方便地检测和测量目标RNA 的表达水平。

1.2 文章结构本文分为五个主要部分。

引言部分（第1节）将概述文章背景、结构和目的。

接下来，第2节将详细介绍U6内参逆转录加尾法的原理说明，在第3节中呈现具体的实验步骤，并提供一些典型的应用案例。

第4节将重点解释U6内参逆转录加尾法的优势和局限性，并在最后给出结论（第5节）。

参考文献列表则用于支持所引用资料来源。

1.3 目的本文旨在帮助读者深入了解U6内参逆转录加尾法，并认识到其在生物分子研究领域中的重要意义。

通过对原理、实验步骤和应用案例的详细阐述，本文旨在促进读者对该方法的理解和应用能力的提升。

同时，通过对U6内参逆转录加尾法的优势和局限性的解释，希望读者能够全面评估该方法在自身研究中的适用性，并有意识地避免可能存在的误解或问题。

（以上内容为普通文本格式）2. U6内参逆转录加尾法：2.1 原理说明：U6内参逆转录加尾法是一种通过逆转录反应将RNA转化为cDNA，并在其3'末端添加特定的引物序列的方法。

在该方法中，首先利用酶逆转录酶将RNA作为模板合成相应的cDNA。

然后，在反应体系中添加一组特异性引物，这些引物的序列与U6小核RNA上存在的保守片段互补配对，从而实现引物与cDNA连接。

通过随后的PCR扩增步骤，可以放大目标cDNA并获取所需产物。

2.2 实验步骤：实施U6内参逆转录加尾法通常需要以下步骤：1. 提取待研究细胞或组织中的总RNA。

2. 将提取得到的RNA经过DNaseI处理以去除其中可能存在的基因组DNA污染。

3. 使用逆转录酶和dNTPs将DNaseI处理后的RNA逆转录为单链cDNA。

4. 在反应体系中加入U6特异性引物以进行引物与cDNA之间的连接。

《医学微生物学课件第30章逆转录病毒》xx年xx月xx日•逆转录病毒的基本特征•逆转录病毒的感染和致病机制•逆转录病毒的检测和治疗•逆转录病毒与其它病原微生物的关系目•展望录01逆转录病毒的基本特征逆转录病毒呈球形，具有二十面体对称结构，直径约100～120nm。

形态逆转录病毒的基因组为RNA，被包裹在核心蛋白衣壳中，外层由脂质膜包裹，膜上镶嵌有病毒的糖蛋白。

结构逆转录病毒的形态和结构逆转录病毒的复制过程需要逆转录酶和DNA聚合酶的参与，首先病毒RNA进入细胞，通过逆转录酶的作用合成病毒的DNA，再通过DNA聚合酶的作用将DNA整合到宿主细胞的DNA上。

逆转录病毒的复制过程分为三个阶段：吸附、穿入和脱壳。

吸附是指病毒通过其特异性受体与宿主细胞表面结合，穿入是指病毒进入细胞内，脱壳是指病毒除去外层脂质膜和核心蛋白衣壳，最后释放出病毒的RNA和逆转录酶。

逆转录病毒的复制特性1逆转录病毒的基因组和蛋白23逆转录病毒的基因组分为三个部分：5'端长末端重复序列（LTR）、gag基因、env基因。

gag基因编码病毒的核心蛋白，env基因编码病毒的糖蛋白。

LTR是逆转录病毒基因组的调控区域，具有转录和整合功能。

02逆转录病毒的感染和致病机制03病毒复制逆转录病毒利用细胞的合成机制大量复制病毒基因组，产生子代病毒颗粒。

逆转录病毒的感染过程01病毒吸附逆转录病毒依靠表面蛋白与靶细胞受体结合，实现病毒颗粒进入细胞。

02病毒注入逆转录病毒的遗传物质进入细胞后，病毒通过逆转录酶将遗传物质整合到宿主基因组上。

逆转录病毒刺激机体产生特异性免疫应答，清除病毒抗原，保护机体免受感染。

引发免疫应答逆转录病毒感染细胞可诱导细胞因子产生，引发炎症和组织损伤。

细胞因子产生某些逆转录病毒感染机体后可诱发肿瘤，主要与病毒基因组整合到宿主基因组上有关。

肿瘤形成逆转录病毒的致病性逆转录病毒具有高突变率，可产生多种抗原变异体，使机体免疫应答难以完全清除。

第三十六章逆转录病毒〔Ritroviridae〕知识要点：逆转录病毒种类特点人类免疫缺陷病毒HIV结构基因组及功能病毒复制 AIDS 传播途径致病机制微生物检查法疫苗鸡尾酒疗法人类嗜T细胞病毒成人T细胞白血病 HTLV 致病机制微生物学检查法逆转录病毒科〔Retroviridae〕是一大组含有逆转录酶〔reverse transcriptase〕的RNA 病毒，按其致病作用可分为3个亚科，即RNA肿瘤病毒亚科、慢病毒亚科及泡沫病毒亚科，其中对人致病的主要是人类免疫缺陷病毒〔human immunodeficiency virus，HIV〕和人类嗜T细胞病毒〔human T cell leukemia virus，HTLV〕。

逆转录病毒具有以下共同特性：1．病毒呈球形，有包膜，外表有刺突，其大小100nm左右。

2．病毒核心由两条相同单股RNA组成，在5’端通过局部碱基互补配对形成双体结构，它与内层衣壳构成电子密度强的中央类核。

类核呈圆形的病毒称C型病毒颗粒，如人类嗜T细胞病毒；类核呈圆柱型的病毒称D型病毒颗粒，如人类免疫缺陷病毒。

３．逆转录病毒基因组组成相似，均含有序列及功能相似的 gag、pol和env等3个结构基因及多个调节基因。

４．病毒体内含有逆转录酶、核酸内切酶及RNA酶H等酶类，它们与病毒核酸逆转录、病毒的整合作用有关。

５．病毒增殖的特点是在复制病毒RNA时，在逆转录酶的作用下首先合成cDNA，构成RNA:DNA 中间体。

第一节人类免疫缺陷病毒形态结构HIV为直径100nm～120nm大小的球形颗粒。

电镜下病毒内部有一致密的圆柱状核心，该核心是由两条相同单股RNA构成的双体结构及包裹其外的衣壳蛋白〔p24〕组成，构成病毒核衣壳。

病毒核衣壳外侧包有两层膜结构，内层是内膜蛋白〔p17〕，亦称跨膜蛋白，最外层是脂质双层包膜，包膜外表有刺突并含有gp120和gp41包膜糖蛋白。

<／span >病毒基因组及功能HIV基因组全长约9200bp，其5′端与3′端各有一段相同核苷酸序列，称为长末端重复序列〔long terminal repeat，LTR〕。