黑米中花青素的抗氧化性质研究

黑米中花青素的抗氧化性质研究摘要：将粗提出的黑米花青素分别采用Fenton反应体系、邻苯三酚自氧化体系、普鲁士蓝法来测定其对OH·和O2－·的清除作用及其还原能力进行评价，并以维生素C和异抗坏血酸钠作为实验对照。

得出黑米花青素是一种潜在的具有抗氧化活性的天然药物。

关键词：黑米；花青素；自由基；抗氧化性；前言千百年来，亿万中国人民通过自身实践总结出一句俗语“逢黑必补”。

祖国中医理论认为，黑色归肾，肾为先天之本，乃生命之源。

据《神农本草经》和《本草纲目》记载，黑米具有滋阴补肾、健脾暖肝、明目活血的功效，又有“补血米”、“长寿米”、“神仙米”的美称。

黑米含有丰富的蛋白质、人体所必需的氨基酸、不饱和脂肪酸、维生素C及钙、铁、锌等矿物营养元素，还含有药用价值很高的黑米花青素［１］。

近20年来，陆续有研究者开展了黑米的功能评价研究，徐飞［2］、黄玉等［3］先后证实了黑糯米具有防治缺铁性贫血，提高耐缺氧能力和保护白细胞等作用；顾德法［4］证实黑米具有抗应激反应和免疫调节作用。

花青素为黑米中的主要黄酮类物质(anthocyanidin)，这是一种广泛存在于自然界植物中的水溶性天然色素，在自然状态下常与各种单糖形成糖苷，称为花色苷。

花青素作为一种天然食用色素，安全、无毒、资源丰富，而且具有一定营养和药理作用，在食品、化妆品、医药、保健等方面有着巨大的应用潜力［５］。

20世纪80年代人们逐渐认识到清除自由基和抗氧化是营养保健的重要前提和基础，而花青素作为清除自由基能力最强的、其他抗氧化剂所无可比拟的抗氧化剂。

大量研究表明，花青素具有很强的抗氧化作用，有助于清除体内的自由基、降低氧化酶的活性、抗衰老、抑制胆固醇吸收、降低低密度脂蛋白胆固醇含量、预防癌症、增强血管弹性、保护胃粘膜、防止心血管疾病等多种生理功能［６］。

在黑米抗氧化功能评价方面：孙玲和张名位等［７］证实黑米水提液和60%醇提液对氧自由基都具有不同的清除效果，且在所用的浓度范围内清除率与供试液的浓度呈明显的量效关系，相关系数达显著或极显著水平，提示黑米具有较强的抗氧化性。

陈文等［８－９］应用黑粘米酶解液进行小鼠灌胃试验，表明黑米具有抗氧化作用。

因而研究和开发利用黑米花青素有着良好的前景。

异V C钠和V C是食品加工过程中常用的两种抗氧化剂。

本实验对黑米中花青素与异V C钠和V C的抗氧化性进行了比较，结果显示，黑米花青素具有较强的抗氧化性能。

1 材料1.1 供试材料实验室粗提的黑米花青素1.2 主要仪器设备紫外-可见分光光度计、电子天平、恒温水浴锅、离心机、电炉、石棉网、容量瓶、三角瓶、烧杯、试管、量筒、玻璃棒、移液管等。

1.3 主要试剂V C、异V C钠、蒸馏水、邻菲罗啉、硫酸亚铁、双氧水、Tris、邻苯三酚、盐酸、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁、甲醇等。

2 方法2.1 黑米花青素对OH·清除率的测定利用H2O2／Fe2＋通过Fenton反应［１０］产生OH·，邻二氮菲一Fe2＋溶液被OH·氧化成邻二氮菲一Fe3＋。

邻二氮菲一Fe2＋(橙红色)的褪色程度可用来衡量OH·的清除量［１１］。

取2.0ml磷酸缓冲液、1.5ml浓度为5.0mmol/L邻二氮菲、1.0ml浓度为7.5mmol/L的FeSO4和5.5ml蒸馏水放入试管中，加上述各组样品摇匀后置于恒温水槽中，37℃保温60min，置于波长510nm处测吸光值为A未损。

按上述方法，以1ml体积分数为0.001的H2O2代替1ml蒸馏水，测出的吸光值为A损伤；以1ml 样品液和1mlH2O2代替2ml蒸馏水，测出的吸光值为As［１２］。

按下式计算羟自由基清除率：OH·清除率(％)=［(As－A损伤)/(A未损－A损伤)］×100［１３］为表示几种抗氧化剂清除OH·能力，采用IC50值表示。

将黑米花青素、异V C钠和V C配制成系列溶液，测定提取液浓度与OH·清除率，并绘制OH·清除率对提取液浓度曲线，用方程式计算出OH·清除率为50％时所需提取液浓度(IC50)。

IC50值越低，抗氧化剂的OH·清除能力越强，抗氧化性越好。

2.2 黑米花青素对O2－·清除率的测定邻苯三酚在碱性条件下自动氧化，不断释放出O2－·，O2－·又可进一步促进自氧化。

中间产物的积累在滞后30～45s与时间呈良好的线性关系，一般维持4min 左右，随后减慢。

有色产物在320nm有强烈的光吸收。

由于自氧化速率依赖于O2－·的浓度，清除O2－·则抑制自氧化反应，阻止中间产物的积累，从而评价受试物清除O2－·的能力［１３］。

取25℃预热pH为8.2、浓度为50mmol/L的Tris-HCl缓冲液2.25ml，置于10ml试管中，依次加入不同浓度样品溶液各2ml，接着加入25℃预热过的45mmol/L的邻苯三酚75μl，迅速混匀，反应4min后加入20μl浓度为10mol/L的HCl终止反应，在320nm波长处检测吸光度As。

按上述方法，以2ml蒸馏水代替样品，测得的邻苯三酚体系吸光度为A，以pH值为8.2的Tris-HCl缓冲液2.25ml，加2ml样品测得的吸光度作为空白吸光度A0［１２］。

按下式计算超氧阴离子清除率:O2－·清除率(％)=［A－(As－A0)/A］×100［１４］为表示几种抗氧化剂清除O2－·能力，采用IC50值表示。

将黑米花青素、异V C钠和V C配制成系列溶液，测定提取液浓度与O2－·清除率，并绘制O2－·清除率对提取液浓度曲线，用方程式计算出O2－·清除率为50％时所需提取液浓度(IC50)。

IC50值越低，抗氧化剂的O2－·清除能力越强，抗氧化性越好。

2.3 黑米花青素还原能力的测定以普鲁士蓝Fe(Fe(CN)6)生成量作为指标，将赤血盐K3Fe(CN)6还原成黄血盐，再利用Fe2＋形成普鲁士蓝。

700nm吸光值反映普鲁士蓝的生成量，吸光值越大，样品还原力值愈强，表示抗氧化效果愈佳［１５］。

取样品液各1ml，分别加2.5ml 磷酸盐缓冲液(0.2M，pH6.6)和2.5ml质量分数为0.010的铁氰化钾，混匀，在50℃水浴锅中保温20min。

然后，加入体积分数为0.100的三氯乙酸2.5ml，将溶液在3000r/min条件下离心15min。

取2.5ml上清液，加入2.5ml蒸馏水和0.5ml质量分数为0.001三氯化铁，混匀。

空白对照以甲醇替代抗氧化剂，在700nm波长下测定混合液的吸光度［１２］。

３结果与分析本实验研究黑米花青素的抗氧化性，为了更好的体现黑米花青素良好的抗氧化性，以及从节省经费方面考虑，故选取食品加工过程中常用的两种抗氧化剂异V C钠、V C进行对照实验，由于三种抗氧化剂抗氧化作用的机理有所不同，因此三种抗氧化剂的抗氧化性也存在差异。

3.1 黑米花青素、异V C 钠、V C 抗氧化作用（即清除自由基）的机理花色苷类化合物的酚羟基结构，特别是邻苯二酚或邻苯三酚的邻位酚羟基很容易被氧化成醌类结构，在有酶、充足的水分以及较高pH 值时，氧化反应进行得更快，从而消耗环境中的氧。

其酚类结构使其对活性氧等自由基具有很强的捕捉能力，如能与氧化反应产生的脂质自由基等结合，将减少或阻止组织中氧化反应过程的进行，这使得它具有较强的抗氧化性以及清除自由基的能力［１６］。

黑米花色苷类化合物清除自由基和抗氧化的作用机理在于它阻止了自由基在体内产生的3个阶段：即与O 2－·反应阻止自由基引发；与金属离子鳌合阻止OH ·生成；与脂质过氧基(ROO ·)反应阻止脂质过氧化过程［１６］。

还原型V C 是氢原子供体，给出一个氢原子，它可成为半脱氢V C ，如再给出一个氢原子，则成为双脱氢V C (即氧化型V C )。

一般认为，当V C 浓度较低时，V C 给出一个电子，形成V C 自由基，可增加机体自由基的生成量；当V C 浓度较高时，则可作为自由基清除剂发挥作用。

V C 可直接消除O 2－·,R ·和OH ·等自由基［１７］。

而异V C 钠是V C 的旋光异构体，同样是氢原子供体，还原能力相较于V C 要强一些［１８］。

3.2 对羟自由基(OH ·)的清除作用图1 黑米花青素、异V C 钠、V C 对羟自由基(OH ·)的清除作用比较OH ·是人体在新陈代谢过程中产生对生物体毒性最大的一种自由基，它可以使机体组织中的糖类、氨基酸、核酸等物质发生氧化，从而导致各种疾病的发生和加速机体的衰老。

由图1可知黑米花青素对Fenton 反应产生的OH ·具有较y = 154.29x - 1.719R 2 = 0.9945y = 134.27x - 2.567R 2 = 0.9915y = 122.88x - 6.578R 2 = 0.9984010203040506070809000.10.20.30.40.50.6浓度（mg/ml）O H ·清除率（%）黑米花青素异VC钠VC 线性 (黑米花青素)线性 (异VC钠)线性 (VC)好的清除作用，而且随着浓度的增加其清除作用越明显，并呈较好的线性关系。

在低浓度范围内，3种样品的清除能力比较接近。

随着浓度的增加，清除能力的差异也越明显。

在相同浓度下，对OH ·清除效果依次为黑米花青素＞异V C 钠＞V C 。

黑米花青素对OH ·清除能力的IC 50为0.335mg/ml ，异V C 钠和V C 的IC 50分别为0.3915mg/ml 和0.4604mg/ml ，表明黑米花青素具有比异V C 钠和V C 更高的清除OH ·的能力。

3.3 对超氧阴离子(O 2－·)的清除作用O 2－·是所有氧自由基中最早产生的自由基，可以经过一系列反应生成其他氧自由基，对机体组织造成氧化损伤，因此清除O 2－·具有特别重要的意义。

由图2可知，黑米花青素、异V C 钠和V C 对邻苯三酚自氧化体系产生的O 2－·都有一定的清除作用。

在10～50μg/ml ，随着3种样品浓度的升高，其清除作用越明显，并具有较好的线性关系，其浓度(x)－清除率(y)曲线见图2。

黑米花青素对O 2－·清除能力的IC 50为34.15μg/ml ，异V C 钠和V C 的IC 50分别为39.76μg/ml 和47.54μg/ml ，表明黑米花青素具有比异V C 钠和V C 更高的清除O 2－·的能力。