大鼠创伤性脑损伤后Numbl的表达变化

・４２８・　南通大学学报（医学版）　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｎａｎｔｏｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）２０１　ｌ：３　１（６　

大鼠创伤性脑损伤后Ｎｕｍｂｌ的表达变化　葛　胜　ｆ江苏省启东市人民医院神经内科．启东２２６２００）　［摘要】　目的：观察大鼠创伤性脑损伤后Ｎｕｍｂｌ的表达变化及其与脑损伤的关系。方法：构建大鼠创伤性脑损伤　模型．收集蛋白并做冰冻切片，采用Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔ及免疫组化分析Ｎｕｍｂｌ的表达变化及分布。免疫荧光双标分析Ｎｕｍｂｌ　的细胞定位。结果：大鼠创伤性脑损伤后Ｎｕｍｂｌ的表达降低，其主要分布在损伤区域的皮质中，免疫荧光显示Ｎｕｍｂｌ主　要定位于皮质的神经元中。结论：Ｎｕｍｂｌ在大鼠创伤性脑损伤后表达减少，其主要定位于损伤区域的神经元中，有可能　参与损伤诱导的神经元的凋亡及再生。　［关键词】创伤性脑损伤；Ｎｕｍｂｌ；神经元；大鼠　［中图分类号】Ｒ６４１　［文献标志码］Ａ　［文章编号】１６７４—７８８７（２０１１）０６—０４２８—０３　Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｃｈａｎｇｅｓ　ｏｆ　Ｎｕｍｂｌ　ｉｎ　ｒａｔ　ｂｒａｉｎ　ｃｏｒｔｅｘ　ａｆｔｅｒ　ｔｒａｕｍａｔｉｃ　ｂｒａｉｎ　ｉｎｊｕｒｙ　ＧＥ　Ｓｈｅｎｆ’　（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｑｉｄｏｎｇ　Ｐｅｏｐｌｅ’Ｓ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｑｉｄｏｎｇ　２２６２００）　【Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｉｏｎ　ｃｈａｎｇｅ　ｏｆ　Ｎｕｍｂｌ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｒａｔ　ｂｒａｉｎ　ｃｏｄｅｘ　ａｆｔｅｒ　ｔｒａｕｍａｔｉｃ　ｉｎｊｕｒｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：　Ｔｒａｕｍａｔｉｃ　ｂｒａｉｎ　ｉｎｊｕｒｙ（ＴＢＩ）ｍｏｄｅｌ　ｉｎ　ａｄｕｌｔ　ｒａｔｓ　ｗｅｒｅ　ｍａｄｅ　ａｎｄ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ　ａｎｄ　ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｗｅｒｅ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｄｙｎａｍｉｃ　ｃｈａｎｇｅｓ　ｏｆ　Ｎｕｍｂｌ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｂｒａｉｎ　ｃｏｒｔｅｘ．Ａｎｄ　ｔｈｅｎ　ｄｏｕｂｌｅ　ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｎｕｍｂ１．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｎｕｍｂｌ　ｗａｓ　ｐｒｅｓｅｎｔ　ｉｎ　ｎｏｒｍａｌ　ｂｒａｉｎ．Ｉｔ　ｄｅｃｒｅａｓｅｄ　ｇｒａｄｕａｌｌｙ，ｒｅａｃｈｅｄ　ｔｈｅ　ｌｏｗｅｓｔ　ｐｏｉｎｔ　ａｔ　ｄａｙ　３　ａｆｔｅｒ　ＴＢＩ，ａｎｄ　ｔｈｅｎ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｄｕｒｉｎｇ　ｔｈｅ　ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ　ｄａｙｓ．Ｄｏｕｂｌｅ　ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｅｅ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　Ｎｕｍｂｌ　ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ（ＩＲ）ｗａｓ　ｆｏｕｎｄ　ｉｎ　ｎｅｕｒｏｎｓ，ｂｕｔ　ｎｏｔ　ｉｎ　ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ　ａｎｄ　ｍｉｃｒｏｇｌｉａ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｎｕｍｂｌ　ｍａｙ　ｂｅ　ｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ＴＢＩ　ａｎｄ　ｆｕｒｔｈｅｒ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｉｓ　ｎｅｅｄｅｄ　ｔｏ　ｈａｖｅ　ａ　ｇｏｏｄ　ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ　ｏｆ　ｉｔｓ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．　【Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ】ｔｒａｕｍａｔｉｃ　ｂｒａｉｎ　ｉｎｊｕｒｙ；Ｎｕｍｂｌ；ｎｅｕｒｏｎ；ｒａｔ　创伤性脑损伤ｆｔｒａｕｍａｔｉｃ　ｂｒａｉｎ　ｉｎｊｕｒｙ．ＴＢＩ）是常　见的损伤性疾病．损伤后的病理改变是一个复杂的　过程．其包括神经元的损伤、祖细胞的迁移及修复、　胶质细胞的激活及吞噬病变组织等　Ｎｕｍｂｌ是Ｎｕｍｂ　的同系物．主要参与神经元前体的存活【１］．但是对其　在脑损伤后的作用尚不清楚　本研究拟通过构建大　鼠脑创伤模型．探讨Ｎｕｍｂｌ的表达变化及其作用。　１材料与方法　１．１　试剂　兔抗Ｎｕｍｂｌ多克隆抗体（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ公　司）；兔抗ＧＡＰＤＨ多克隆抗体（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ公司）；鼠　抗Ｎｅｕｎ单克隆抗体（Ｓｉｇｍａ公司）：ＨＲＰ标记山羊抗　兔ＩｇＧｆＳａｎｔａ　Ｃｒｕｚ公司）；Ｂｉｏ标记山羊抗兔ＩｇＧ　ｆＳａｎｔａ　Ｃｒｕｚ公司）：ＴＲＩＴＣ或ＦＩＴＣ标记的山羊抗鼠、　山羊抗兔的二抗（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂ公司）　１．２　实验动物ＳＤ大￣（２２０　２５０　ｇ）由南通大学实　验动物中心提供，在安静的环境饲养．随机分组，每　组６只，其中３只用于蛋白分析．３只用于组织切片。　１．３动物模型构建　大鼠用复合麻醉剂腹腔麻醉　后，俯卧固定于手术台上．矢状切开头皮暴露颅骨　在颅骨中线右侧旁约３　ｍｍ。前囟后方３．５　ｍｍ处．用　牙科钻钻开颅骨。扩大骨窗为５　ｍｉｎｘ５　ｍｍ　保持硬　脑膜完好无损。小心用显微刀片损伤此处．造成右侧　大脑创伤性脑损伤。止血后用骨蜡封闭骨窗．缝合头　皮，放回笼中３７℃保温饲养　假手术￣Ｆｌ（ｓｈａｍ）仅切开　头皮．打开骨窗。　１．４　Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔ将各组大鼠脑组织冰浴匀浆．取　上清液，用紫外分光光度仪测定蛋白质的含量　利用　ＳＤＳ～ＰＡＧＥ凝胶电泳，分别予８０　Ｖ、１２０　Ｖ分离蛋白　质　转移蛋白至ＰＶＤＦ膜上后予１０％脱脂奶粉的　ＴＢＳＴ封闭，分别加Ｎｕｍｂｌ、ＧＡＰＤＨ抗体４ｃＩ＝过夜．孵　育ＨＲＰ偶联的二抗后Ｌｕｍｉｎｏｌ　Ｅｃｌ　Ｒｅａｇｅｎｔ显影　所　得的图像进行灰度扫描．并进行量化统计分析　实验　在相同条件下重复３次　１．５免疫荧光切片复温后用０．０１　Ｍ的ＰＢＳ漂洗　１０　ｍｉｎ，用适量抗体封闭液封闭．４℃过夜　加入一抗　混合液：Ｎｕｍｂｌ（１：１００）、Ｎｅｕｎ（１：２００）。４　ｏＣ孵育４８　ｈ。　此后，加入二抗混合液４℃孵育２　ｈ　荧光封片剂封　片后，荧光显微镜下观察。每批实验均同时设阴性　对照　【基金项目】国家自然科学基金资助项目（３１０７０７２３）　【作者简介］葛胜，男，汉族，生于１９６６年６月，江苏省启东市人，硕士，副主任医师，研究方向：脑血管疾病。

　葛胜．大鼠创伤性脑损伤后Ｎｕｍｂｌ的表达变化　・４２９・　１．６统计学方法采用Ｓｔａｔａ　７．０软件统计．成组数　据以　＋ｊ表示．组问比较用方差分析Ｏｎｅ　ｗａｙＡＮＯ．　ＶＡ），Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。　２结　果　２．１　脑损伤后损伤皮质中Ｎｕｍｂｌ的表达变化Ｗｅｓｔ．　ｅｒｎ　Ｂｌｏｔ显示在正常的脑皮质中，Ｎｕｍｂｌ有表达，脑　损伤后Ｎｕｍｂｌ的表达出现变化．在损伤后１２　ｈ开始　减少，至３　ｄ达到最低点．然后逐渐增加，至损伤后　２８　ｄ恢复正常ｆ图１）。　Ａ　ｓｈａｍ　１２　ｈ　１　ｄ　３　ｄ　５　ｄ　７　ｄ　１４　ｄ　２８　ｄ　Ｎ１ｍ１ｈ１嘲＿　＿　嘲　嘲　ＧＡＰＤＨ　Ｂ　器　０．６　０．５　０．４　’景０．３　０．２　０．１　０　术后时Ｉ司　注：Ａ：免疫印迹显示Ｎｕｍｂｌ蛋白表达变化。Ｂ：Ｎｕｍｂ１蛋白表　达定量图。与假手术组比较．　０．０５。　图１　脑损伤后Ｎｕｍｂｌ在大脑皮层中的表达变化　２．２脑损伤后损伤皮质中Ｎｕｍｂｌ的表达分布　免　疫组化显示在正常的脑皮质中Ｎｕｍｂｌ表达较多．其阳　性的信号主要位于神经元样细胞的细胞质中。脑损伤后　损伤皮质中的Ｎｕｍｂｌ的表达减少ｆ图２，见第５１５页１。　２．３　脑损伤后损伤皮质中Ｎｕｍｂｌ的细胞定位　免　疫荧光双标显示在正常的脑皮质及损伤后的脑皮质　中，Ｎｕｍｂｌ与Ｎｅｕｎ（￣ｔ经元的标记）阳性的神经元有　共定位．分别计数正常及损伤３　ｄ的大鼠皮质中　２００个Ｎｅｕｎ阳性的神经元细胞．发现在损伤３　ｄ　后Ｎｕｍｂｌ表达阳性的神经元的数量显著降低ｆ图３．　见第５１５页１　３讨　论　Ｎｕｍｂｌ是Ｎｕｍｂ的同系物．最早发现其参与出　生后神经元前体的分化及不对称分裂［２１　在成年的动　物中，Ｎｕｍｂｌ主要表达血细胞［３１、骨髓组织［４１、淋巴组　织、脑组织及胰腺组织。在脑中，Ｎｕｍｂｌ主要表达与　脑中的神经元及其前体细胞．尤其是在海马ＳＶＡ区　的神经元中Ｎｕｍｂｌ高表达　研究［５１发现．Ｎｕｍｂｌ主要　参与淋巴细胞ｆ包括Ｔ／Ｂ细胞）的分化、ＳＶＺ区神经　元存活的维持及分化的过程。我们发现在脑损伤后．　Ｎｕｍｂｌ的表达下调。并且其主要表达在损伤皮质神　经元的胞浆中。这些表明在脑损伤后．Ｎｕｍｂｌ在损伤　后神经元的生物学作用更改中发挥作用　先前的研究［６］已经发现Ｎｕｍｂｌ通过负性调节　Ｎｏｔｃｈ通路抑制神经元的前体细胞向成熟神经元的　分化。也有研究［７１发现．Ｎｕｍｂｌ除了调节Ｎｏｔｃｈ通路　以外还能调节ＮＦ—ＫＢ通路的活性。在脑损伤后．神　经元经历复杂的生物学事件．主要表现为损伤后的　凋亡及存活神经元前体细胞的再生及修复［８１　我们发　现在脑损伤后．Ｎｕｍｂｌ主要表达于损伤区域神经元　的胞浆中．这提示Ｎｕｍｂｌ可能通过调节Ｎｏｔｃｈ及　ＮＦ—ＫＢ的激活参与神经元的凋亡及前体细胞的分　化修复的过程　本文对脑损伤后Ｎｕｍｂｌ的表达及其在神经元　损伤及修复中的作用展开研究　研究的结果为寻找　脑损伤后治疗的新方法提供理论及实验基础　【参考文献】　［１１　Ｎｉｉｋｕｒａ　Ｙ，Ｔａｂａｔａ　Ｙ，Ｔａｊｉｍａ　Ａ，ｅｔ　ａ１．Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ　Ｎｕｍｂ　ｈｏ—　ｍｏｌｏｇｕｅ：ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ　ｉｎ　ｒｅｇｕ—　ｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｌｅｆｔ—ｆｉｇｈｔ　ａｓｙｍｍｅｔｒｙ［Ｊ］．Ｍｅｃｈ　Ｄｅｖ，２００６，１２３（５）：　４０７—４１４．　【２】Ｚｈｏｎｇ　Ｗ，Ｊｉａｎｇ　ＭＭ，Ｗｅｉｎｍａｓｔｅｒ　Ｇ，ｅｔ　ａ１．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ｅｘ．　ｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｎｕｍｂ，Ｎｕｍｂｌｉｋｅ　ａｎｄ　Ｎｏｔｈｃｈ　１　ｓｕｇｇｅｓｔｓ　ｄｉｓｔｉｎｃｔ　ｒｏｌｅｓ　ｄｕｒｉｎｇ　ｍｏｕｓｅ　ｃｏｒｔｉｃａｌ　ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｓｉｓ［Ｊ］．　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１９９７，１２４（１０）：１８８７－１８９７．　【３］　Ｂｅｒｅｃｈｉｄ　ＢＥ，Ｋｉｔｚｍａｎｎ　Ｍ，Ｆｏｌｔｚ　ＤＲ，ｅｔ　ａ１．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ—ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　Ｎｏｔｃｈ　ｓｉｇ－　ｎａｌｉｎｇ［Ｊ］．Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ，２００２，２７７（１０）：８１５４—８１６５．　【４１　Ａｎｄｅｍｏｎ　ＡＣ，Ｋｉｔｃｈｅｎｓ　ＥＡ，Ｃｈａｎ　ＳＷ，ｅｔ　ａ１．Ｔｈｅ　Ｎｏｔｃｈ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒ　Ｎｕｍｂ　ｌｉｎｋｓ　ｔｈｅ　Ｎｏｔｃｈ　ａｎｄ　ＴＣＲ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｐａｔｈ—　ｗａｙｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００５，１７４（２）：８９０—８９７．　［５１　Ｋａｔｏｈ　Ｍ，Ｋａｔｏｈ　Ｍ．ＮＵＭＢ　ｉｓ　ａ　ｂｒｅａｋ　ｏｆ　ＷＮＴ—Ｎｏｔｃｈ　ｓｉｇ—　ｎａｌｉｎｇ　ｃｙｃｌｅ［Ｊ］．Ｉｎｔ　Ｊ　Ｍｏｌ　Ｍｅｄ，２００６，１８（３）：５１７—５２１．　［６１　Ｍａ　Ｑ，Ｚｈｏｕ　Ｌ，Ｓｈｉ　Ｈ，ｅｔ　ａ１．ＮＵＭＢＬ　ｉｎｔｅｒａｃｔｓ　ｗｉｔｈ　ＴＡＢ２　ａｎｄ　ｉｎｈｉｂｉｔｓ　ＴＮＦａｌｐｈａ　ａｎｄ　ＩＬ－ｌｂｅｔａ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ＮＦ－ｋａｐｐａＢ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌ，２００８，２０（６）：１０４４－１０５１．　［７１　Ｑｕａｎ　Ｙ，Ｄｕ　Ｊ，Ｗａｎｇ　Ｘ．Ｈｉｇｈ　ｇｌｕｃｏｓｅ　ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ　ＧＲＯ　ｓｅ—　ｃｒｅｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ　ｒａｔ　ｍｉｃｒｏｇｌｉａ　ｖｉａ　ＲＯＳ，ＰＫＣ，ａｎｄ　ＮＦ－ｋａｐｐａＢ　ｐａｔｈｗａｙｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ　Ｒｅｓ，２００７，８５（１４）：３１５０—３１５９．　［８１　Ｚｈｏｕ　Ｌ，Ｍａ　Ｑ，Ｓｈｉ　Ｈ，ｅｔ　ａ１．ＮＵＭＢＬ　ｉｎｔｅｒａｃｔｓ　ｗｉｔｈ　ＴＲＡＦ６　ａｎｄ　ｐｒｏｍｏｔｅｓ　ｔｈｅ　ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＴＲＡＦ６［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏ—　ｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍｕｎ，２０１０，３９２（３）：４０９—４１４．　『收稿日期１　２０１１－１０—１２　●■■■Ｉ勰　●■■Ｉ　●■一　。Ｉ　ｂ■■■■■Ｌｄ　。Ｉ　＋●●Ｉ¨　●■●－　●■■■ｌ　ｍ