1
3、λ噬菌体载体的优缺点：
•
优点：包装的λ噬菌体感染大肠杆菌要比
质粒转化细菌的效率高。
•缺点：λ噬菌体载体的克隆操作要比质粒
载体复杂。
•用途：λ噬菌体载体比质粒载体能插入的
DNA长得多，常用于构建cDNA文库或基因
组文库。
第一章分子克隆的工具酶和载体
•第八节噬菌体载体
•一、λ噬菌体•（一）λ噬菌体
•（二）λ噬菌体载体的改造
•（三）λ噬菌体载体举例
（三）λ噬菌体载体举例
•Lambda gt10
•Lambda gt11
•EMBL3和EMBL4
Lambda gt10概述：
•Lambda gt10是一种插入载体。
•在噬菌体阻遏基因cI内有单一的EcoRⅠ克隆位点。用于插入小的cDNA片段(约6kb)，构
建cDNA文库或基因文库。
•该载体克隆效率很高。
•在构建cDNA文库时，利用Oligo(dT)或随机
引物合成的cDNA经过EcoRⅠadaptors或
Linkers修饰后，就可以和λgt10连接起来。
•克隆到λgt10的噬菌体，可用核酸探针进行筛
选。
Lambda gt10map
宿主：
•建议用C600 and C600hf1作受体菌。
筛选：
•如果有外源DNA插入，cI基因失活，该噬
菌体进入裂解生长途径，在培养皿形成噬
菌斑。反之，若无插入，cI基因表达，噬
菌体进入溶原生长途径，不形成噬菌斑。
•核酸探针杂交。
2
Insertional
cloning
•Insertionalcloninginto the cIgeneof the
lambda-gt10 cDNAcloning vector (DNA inserts
of ~1-5 kb) can be selected in hfl(high
frequency of lysogeny) mutant strains of E. coli.
In hflAstrains of E. coli, expression of the
lambda
cIIgene is elevated, resulting in transcriptional induction of the lambda cIrepressor gene which promotes lysogeny. Disruption of the lambda cIcoding
第八讲 单链噬菌体载体及噬菌粒载体
吴 乃 虎
中国科学院遗传与发育生物学研究所 第八讲 单链噬菌体载体及噬菌粒载体
一、单链噬菌体的一般生物学
1． 单链噬菌体的优越性
2． M13噬菌体的生物学特性
二、M13克隆体系
1． M13克隆体系
2． M13克隆体系-半乳糖苷酶的显色反应原理
3． M13载体系列的发展
4． M13载体系列的优点
三、噬菌体展示载体
1． 噬菌体展示载体的构建原理
2． 噬菌体展示载体
3． 噬菌体表面展示文库
4． 应用噬菌体展示载体分离有关蛋白质的实例
四、噬菌粒载体 1． M13噬菌体载体克隆的若干难点
2． 噬菌粒
3． 若干常用的噬菌粒载体
4． pBluescript噬菌粒载体
5． pUC118和pUC119噬菌粒载体 第八讲 单链噬菌体载体
一、单链噬菌体一般生物学
大肠杆菌丝状单链DNA噬菌体有M13噬菌体、f1噬菌体及fd噬菌体，它们均含有分子量约为6400个核苷酸的单链闭环DNA分子。
1．单链DNA phage的优越性
A． 具有双链的复制型DNA(RF DNA)，可如质粒质粒一样进行遗传操作；RF DNA：Replication Form DNA。
B． RF DNA和ssDNA均可感染感受态的寄主细胞——形成phaque或colony。
C． 不受包装的限制。因为单链DNA phage的大小是受其DNA多寡制约的。
D． 可容易地测出外源DNA的插入取向。
E． 可产生大量的含有外源DNA的单链DNA分子，这种单链DNA分子有如下用途(作为模板)：
*1用作双脱氧链终止法进行DNA测序 *2制备单链的放射性标记的杂交用DNA探针
*3利用寡核苷酸进行定点突变
2．M13 phage的生物学特性
A．M13 phage同f1 phage亲缘关系十分密切，例如：
① 基因组组织形式相同；
② 病毒颗粒大小、形状相近；
③ DNA同源性高达98%以上。
DNA重组（DNA recombination）技术：DNA重组的载体-2
二、噬菌体载体
作为细菌寄生物的噬菌体，大多数具有编码多种蛋白质的基因，能利用宿主细胞的蛋白质合成体系，进行生长和增殖。构建的噬菌体载体，以λ噬菌体、M13和粘粒最为常用。
㈠ λ噬菌体载体
野生型λDNA是一种基因组为4.8 kb的线性双链DNA，全部序列已知，共编码50多个基因。其中约一半基因参与了噬菌体的生命周期活动，称为必需基因；另一部分基因，当被外源基因取代后，并不影响噬菌体的生命功能。另外，在分子两端各有12个碱基的互补单链，是天然的粘性末端，称cos位点。
野生型的λ噬菌体是一种中等大小的温和噬菌体，即既能进入溶菌性生命周期又能进入溶源性生命周期。λ噬菌体感染细菌后，λDNA通过粘性末端而环化。既可溶菌性生长（裂解），即λDNA在宿主中多次复制并合成大量基因产物，装配成噬菌体颗粒，最后裂解宿主菌；又可以溶源性生长，即λDNA整合到宿主染色体基因组DNA中，与之一起复制并遗传给子代，但宿主细胞不被裂解。裂解途径和溶源途径的选择取决于宿主与噬菌体之间的许多因素的相互作用，以及噬菌体基因组的精确调控。
λ噬菌体具有二个重要特征，使之成为一类重要的、很有价值的基因克隆载体。①除必需基因外的功能相关（溶源生长和重组）基因成簇排列在一起位于中间部分，约占全基因组的30%，不是溶菌生长所必需的。因此，该区可缺失或作外源DNA的插入区。②噬菌体颗粒成熟的包装过程（外壳蛋白包装DNA），只要重组DNA不小于野生型λDNA全长75%和大于105%，均可被包装成具有噬菌体活性的成熟颗粒。因此大约可插入长达15kb的外源DNA。
当外源DNA片段克隆到插入型载体上，噬菌体便丧失某些生物学功能，即插入失活效应。又可分为免疫功能失活的和β-半乳糖苷酶失活的两种亚型。①免疫功能失活的插入型载体。插入位点位于基因组中的免疫编码区，外源DNA片段插入后，就会使载体合成阻遏蛋白的能力被破坏，导致不能进入溶源生长周期。因此凡有外源DNA插入的λ重组体都会形成清晰的噬菌斑，而未有外源DNA插入空载体则形成混浊的噬菌斑。这种形态上的差别，为分离阳性重组体提供了方便的选择标记。②大肠杆菌β-半乳糖苷酶失活型载体。插入位点位于基因组中的β-半乳糖苷酶（LaZ）编码区，因此可通过蓝白斑实验筛选。对于替换型载体，当外源DNA插入时，一对克隆位点间的基因组DNA被替换（取代），从而丧失某些生物学功能，造成重组体与空载体形成噬菌斑形态（清晰和混浊）或颜色（蓝白斑实验）差别，这种差别即可作为筛选标记。
基因工程的载体
载体的特征：
在寄主细胞中能够自主复制；
有一种或多种限制酶的单一切割位点，并在此位点插入外源基因片段；
在基因组中有遗传标记，为寄主细胞提供易于检测的表型特征；
载体分子较小，以便体外基因操作；
对于表达型载体还应具有与宿主细胞相适应的启动子、增强子、加尾信号等基因表达元件；
载体的类型
质粒
噬菌体
其他载体(如:酵母人工染色体、细菌人工染色体、植物Ti质粒、动物病毒)
质粒 (plasmid): 多数情况下,质粒是存在于细菌染色体外的小的双链闭合环状DNA分子，能自主复制，并在细胞分裂时遗传给子代细胞
并不是所有的质粒都是环状分子, 在多种细菌中都发现有线性质粒
质粒广泛存在于原核生物中, 其大小从相对分子量小于 1X106 到大于 200X106
质粒的形态
1) cccDNA—双链闭合环状DNA
2) ocDNA—开环DNA
3) cDNA—线形DNA（L型）
在DNA促旋酶（gyrase）作用下成负超螺旋构型, 在拓扑异构酶I的作用下解旋。溴化乙锭（ethidium bromide，EtBr）也有解旋作用
溴化乙锭插入DNA超螺旋的作用
随着插入的溴化乙锭数目增加,双螺旋解旋,导致超螺旋减少直至产生环状分子的开放形式. 进一步的插入在双螺旋中引入了过多的螺旋,导致反义的超螺旋(注意B和D处的螺旋方向). 为了清楚起见,只表示了双螺旋的一条单链
质粒DNA的复制类型
严紧型质粒
这些质粒的复制是在寄主细胞严格控制之下的，与寄主细胞的复制偶联同步。所以，往往在一个细胞中只有一份或几份拷贝
松弛型质粒
这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下的，每个细胞中含有10-200份拷贝，如果用一定的药物处理抑制寄主蛋白质的合成才会使质粒拷贝数增至几千份。
如较早的质粒pBR322即属于严紧型质粒，要经过氯霉素处理才能达到更高拷贝数
