人外周血树突状细胞体外诱导培养及表型鉴定

人外周血单核巨噬细胞诱导、培养及鉴定杨志梅;符州;王莉佳;陈艳【期刊名称】《生物学杂志》【年(卷),期】2008(25)5【摘要】在重组人粒.巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)作用下体外诱导培养人外周血单核巨噬细胞,并进行鉴定和功能检测.Ficoll密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞(PBMc),含10%胎牛血清的RPMll640培养基和rhGM-CSF培养7d.光镜、扫描电镜及透射电镜观察细胞形态,鸡红细胞吞噬试验检测吞噬功能,流式细胞术检测单核巨噬细胞表面特征性标志CDl4等生物学技术鉴定贴壁细胞性质.获得的贴壁细胞具备巨噬细胞的形态学特征及免疫表型.有吞噬功能,纯度较高.人外周血单核细胞在rhGM-CSF诱导下向巨噬细胞分化,具有生物学活性,纯度较高.是一种简单易行的体外诱导培养巨噬细胞的方法.【总页数】3页(P66-68)【作者】杨志梅;符州;王莉佳;陈艳【作者单位】重庆医科大学附属儿童医院,重庆,400014;重庆医科大学附属儿童医院,重庆,400014;重庆医科大学附属儿童医院,重庆,400014;重庆医科大学附属儿童医院,重庆,400014【正文语种】中文【中图分类】R329.2+8【相关文献】1.体外诱导培养健康成人外周血单核细胞源树突状细胞及鉴定 [J], 叶双樱;陈礼平;武蓉珍2.人外周血树突状细胞体外诱导培养及表型鉴定 [J], 颜汝平;周海滨;李翀;王剑松;王伟;赵献3.健康人外周血树突状细胞诱导培养及鉴定 [J], 林东军;方志刚;华佳叶;刘相富;黄仁魏4.人外周血树突状细胞的诱导、培养及其表面标记的鉴定 [J], 张云飞;范清宇5.人外周血来源树突状细胞诱导培养及鉴定的实验研究 [J], 孙梯业;颜伟;孙冬丽;刘全达;段伟宏;周宁新因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

体外活性试验相关知识以健康人外周血单核细胞为前体细胞，体外诱导其为树突状细胞（DC ），分别负载多肽抗原，产生特异性细胞毒性T 淋巴细胞（CTL ），以探讨其对靶细胞的杀伤作用。

抗原肽诱导CTL 制备：① 外周血单核细胞（PBMC ）的分离：分别选取（经BCG 免疫，PPD 阳性）HLA-A2.1+、HLA-A3+ 人抗凝外周全血，通过淋巴细胞分离液分离获得PBMC 。

② 树突状细胞的诱导：将PBMC 在24孔板中贴壁培养，分离贴壁的单核细胞，每孔加含FBS 、GM-CSF 和IL-4的1640培养基，于37℃、5%CO2孵箱中，培养至第5天加LPS 诱导成熟，用相差显微镜观察DC 诱导培养过程中的细胞形态学变化。

通过流式细胞术检测CD1a 、CD83、CD80、HLA-DR 的表达。

③ 细胞毒T 淋巴细胞（CTL ）的体外诱导：DC 诱导至第5天，加入待测肽，第7天收获DC 。

于24孔板中加入用免疫磁珠分选的CD8+ T 淋巴细胞作为反应细胞，DC 作为刺激细胞，第2天加IL-2，置37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养。

用肽负载的DC 按前述方法再重复刺激3次。

收获CTL 用于检测。

细胞毒性分析：④细胞毒活性检测：CTL杀伤实验用MTT法和4小时51Cr释放法。

以抗原肽诱导CTL为效应细胞(E)，负载抗原肽的T2细胞作为靶细胞(T)。

MTT法按效靶比20:1加入96孔板中，靶细胞每孔1×103个，设单独靶细胞孔和单独CTL孔，每组3复孔，每孔200 μL。

37 ℃、5 %CO2孵育48 h后,加入MTT 0.2 mg/孔，继续培养4-6 h，去上清，加入DMSO 100 μL/孔，显色，酶标仪于波长570 nm下读数。

按以下公式计算杀伤率。

同时以不相关肽诱导的CTL作为阴性对照。

杀伤率=[1－（试验孔A值-效应细胞孔A值）/靶细胞孔A值]×100% 4h51Cr释放法MTT 实验中与阴性对照比较杀伤作用存在显著性差异的候选肽使用更精确的4h51Cr 释放法来验证。

DC在机体免疫监视机制中起着哨兵作用，它能对肿瘤抗原进行识别、处理和提呈，从而启动机体对肿瘤的特异性免疫应答。

目前制备的以DC为基础的肿瘤疫苗就是利用DC这一特性，因此有效地在体外扩增培养DC是制备DC肿瘤疫苗的重要前提。

以下我们将就DC前体细胞选择以及DC培养所需细胞因子进行介绍。

一、DC前体细胞的选择1.直接分离骨髓、脐带血或外周血中DC：DC在组织中含量甚微，在血液中仅占单个核细胞总数的0.5％～1.0％，难以分离、纯化，且呈高度分化状，体外不易长期培养，更难建系。

因此该分离方法目前仅用于DC免疫活性，表面标志及DC亚型功能差异的研究；2.从人骨髓或脐带血的CD34+造血干细胞诱导DC：我们通常所指的DC均为髓系DC，其来源于人CD34+造血干细胞。

CD34+造血干细胞是具有多向分化潜能和大量增生能力的细胞，其可从人骨髓或脐带血中分离，在体外通过联合GM—CSF、SCF、IL—6、IL—3等多种细胞因子培养，诱导扩增生成大量的DC，但其缺点在于取材不方便，不利于广泛使用；3.分离外周血中CDl4+单核细胞：此方法为目前最常选用的分离获取DC前体细胞的途径。

通过淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，利用免疫磁珠分选出CDl4+单核细胞，采用GM—CSF与IL—4(或IL—13，其与IL—4具有相似性质)联合培养体系，经7～10天即可诱导出大量的典型的DC；4.由高度纯化的中性粒细胞前体细胞诱导DC：利用高度纯化乳铁蛋白阳性的中性粒细胞前体细胞，在培养体系中加入6MCSF，IL—4和TNF—d，可得到DC样形态及具有DC相关表面分子的细胞。

从功能上比较，这些中性粒细胞诱生的DC特征与经典DC的群体相似；5.从人外周血或脐血CD34+前体细胞诱导DC：由于CD34+造血干细胞含量非常少，因此应用受到限制。

为克服这一难点，有人即采取分离外周血或脐血中含量较高的CD34+前体细胞联合细胞因子大量培养扩增，诱导生成DC；6.由白血病细胞诱导分化生成DC：目前的研究发现，可将白血病细胞诱导分化为功能成熟的DC，且这些白血病细胞来源的DC可提供大量的白血病相关抗原并进行肿瘤抗原呈递，而无需体外预激过程，从而减少了污染的机会，这种体外扩增的方法在临床治疗应用上极具吸引力。

尤文肉瘤细胞总RNA修饰的树突状细胞的体外培养及其鉴定王剑;桑宏勋;王臻;郭征【期刊名称】《第四军医大学学报》【年(卷),期】2006(027)012【摘要】目的:探讨树突状细胞(DC)经尤文肉瘤细胞总RNA加载后的体外RNA表达情况. 方法:采用分离尤文肉瘤患者外周血单核细胞体外诱导DC,用流式细胞仪检测DC成熟后的表面标志,Trizol法提取患者尤文肉瘤组织总RNA,用总RNA转染DC,用RT-PCR方法检测肿瘤总RNA加载的DC的表达. 结果:经尤文肉瘤总RNA 加载的DC表面标记发生明显变化,DC的特异性表面标志如CD40由32.24%增高至72.32%,CD83由17.39%增高至30.97%,而代表单核细胞的CD14则由26.37%下降至10.46%,标志其抗原呈递功能显著增强. RT-PCR测定显示尤文肉瘤中的特异性序列EWS-FLI1可以和引物特异性结合,并且最佳结合温度为54℃. 结论:尤文肉瘤细胞总RNA转染的DC可以呈递肿瘤特异性抗原,并特异性的表达其特有序列EWS-FLI1.【总页数】3页(P1116-1118)【作者】王剑;桑宏勋;王臻;郭征【作者单位】第四军医大学西京医院骨科研究所,陕西,西安,710033;第四军医大学西京医院骨科研究所,陕西,西安,710033;第四军医大学西京医院骨科研究所,陕西,西安,710033;第四军医大学西京医院骨科研究所,陕西,西安,710033【正文语种】中文【中图分类】R392.12【相关文献】1.少量人外周血体外培养鉴定单核细胞来源树突状细胞方法初探 [J], 陈静思;王华;罗晓燕2.小鼠肝癌总RNA转染的树突状细胞体外诱导特异性细胞毒T淋巴细胞的研究[J], 王国强;钟翠平;傅继东;范强;张新华;吴超群;顾云娣3.人肝癌细胞总RNA电转染树突状细胞对T细胞的激活效应 [J], 单铁英;苏安英;唐军民4.转染肿瘤细胞总RNA的树突状细胞联合CIK细胞抗小鼠肝癌作用的实验研究[J], 罗善超;刘剑勇;赵荫农;张志明;崔英;张春燕;张力图5.尤文肉瘤细胞总RNA转染的DC疫苗体外诱导尤文肉瘤患者特异性抗肿瘤免疫的实验研究 [J], 王剑;桑宏勋;王臻;郭征因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

流式细胞仪检测外周血树突状细胞分析CD123+（抗IL-3受体α链）和CD11c+树突状细胞亚群概述树突状细胞（DC）的主要功能是吸收抗原，进行加工，并向T淋巴细胞呈递。

其它抗原呈递细胞也有此功能，如B淋巴细胞和单核细胞。

但是，与其它细胞不同的是，DC细胞具有诱导初发免疫反应的独特功能，例如，可以活化处女T细胞（Naive T cell）。

DC细胞存在于外周淋巴组织中，已在血液和非淋巴器官中发现了不同类型的DC细胞，并被认为是淋巴组织中细胞的前体。

由于血液和组织中DC细胞含量少，且缺乏特异的DC标记物，所以DC细胞的研究非常困难。

因此，关于DC细胞的了解主要来自于通过密度梯度离心、培养、和/或阴性选择富集后的DC细胞的研究。

这些过程利用了DC细胞的密度和黏附特征，和在一定细胞因子条件下的选择性生长，或缺乏淋巴细胞、单核细胞和粒细胞的系列标记物的表达。

但是，这些方法中DC细胞的产率和纯度较低，且费时费力。

而且，这些操作可以影响细胞的功能，并且无法做DC细胞含量的定量分析。

最近的报告发现在活化DC细胞和血液或淋巴细胞分离培养的DC细胞表面CD83和CMRF-44高表达。

CD83和CMRF-44可以作为DC细胞的活化标志物，但在体内或未处理的细胞上没有特征性表达，或表达水平很低。

在对新鲜分离的DC细胞的研究中，发现IL-3Rα在淋巴器官的DC细胞上有特异表达。

从人类外周淋巴组织中分离的单个核细胞中主要是此类DC细胞。

IL-3Rα（CD123）抗体可以用来进行免疫磁珠分选，从外周淋巴组织制备的单个核细胞样本中，将CD123+ DC细胞进行200倍富集。

CD123抗体还可以用来做免疫组化分析，特异识别滤泡外T细胞富集区的CD123+ DC。

在外周血中也有CD123+ DC细胞，与以前所说的CD11c- DC细胞和CD33dimCD14-CD16- DC细胞是同一类细胞。

由于缺乏DC特异性标记物，目前仍然不清楚DC是否是自成一系的一类细胞。

黄芪多糖应用于人外周血源性树突状细胞体外培养的实验研究陈朝俊;李志梁;傅强;刘艺;雷霄;吴宏超;刘映峰【期刊名称】《南方医科大学学报》【年(卷),期】2009(29)6【摘要】目的探讨黄芪多糖对人外周血源性树突状细胞(DC)成熟的影响.方法从健康人外周血中分离获得PBMC,体外采用多种细胞因子(TNFα、IL-4、GM-CSF)联合诱导,获得了分化与功能相对成熟的DC.并采用流式细胞仪检测技术,观察了不同浓度黄芪多糖(终浓度为50、100、200 mg/L)对DC表面分子表达以及DC与T细胞在体外混合培养体系中活细胞相互作用过程的干预作用.结果 LPS组、50mg/L组、100mg/L组的细胞呈悬浮生长,可见部分细胞聚集成簇,细胞表面可见数量不等、形态不一的树突样突起,扫描电镜下细胞呈不规则形,表面粗糙,胞体有形态不一的突起,α-萘酸酯酶非特异性酯酶染色呈阴性,200 mg/L组细胞大量凋亡崩解.培养6 d后实验组的DC表面CD86(TCD86*LPS=9.1302、TCD86*50mg/L=6.4024、TCD86*100 mg/L=8.3165,P<0.001)、HLA-DR(THLA-DR*LPS=6.3118、THLA-DR*100mg/L=7.0752,P<0.001;THLA-DR*50mg/L=3.5797,P<0.01)等表型表达上调,与对照组比较差异有显著性意义.LPS组和100mg/L组的CD14等表达下调,与对照组比较差异有显著性意义(TCD14*LPS=8.5709、TCD14*100=8.6103,P<0.001),50mg/L组的CD14表达下调,但与对照组比较差异无显著性意义(TCD14*50 mg/L=1.7918,P>0.05).结论研究初步表明,适当剂量黄芪多糖可以上调DC膜表面与抗原递呈相关的HLA-DR、CD86等共刺激分子的高表达,对促进DC的分化与成熟,有着显著的影响,并增加DC的免疫活性.【总页数】3页(P1192-1194)【作者】陈朝俊;李志梁;傅强;刘艺;雷霄;吴宏超;刘映峰【作者单位】南方医科大学珠江医院心内科,广东,广州,510282;南方医科大学珠江医院心内科,广东,广州,510282;南方医科大学珠江医院心内科,广东,广州,510282;南方医科大学珠江医院心内科,广东,广州,510282;南方医科大学珠江医院心内科,广东,广州,510282;南方医科大学珠江医院心内科,广东,广州,510282;南方医科大学珠江医院心内科,广东,广州,510282【正文语种】中文【中图分类】R392.12【相关文献】1.少量人外周血体外培养鉴定单核细胞来源树突状细胞方法初探 [J], 陈静思;王华;罗晓燕2.胸腺肽α1对80岁以上老年人外周血树突状细胞体外培养及功能的影响 [J], 张兴虎;钱晓明;齐玉琴;万文辉;赵东宝3.老年人外周血树突状细胞的体外培养及功能研究 [J], 张兴虎;黄方;万文辉;范振芳;钱晓明4.健康人外周血树突状细胞体外培养及表型鉴定 [J], 陶晓根;莫宝定;陈剑;张蕾;刘宝;王锦权5.鸡尾酒法体外培养人外周血来源的树突状细胞 [J], 李丽;刘宝瑞;钱晓萍因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

人外周血内皮祖细胞的分离、培养及鉴定乔威;冉峰;刘长建【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2013(000)036【摘要】BACKGROUND:Endothelial progenitor cel s, known as the precursor cel s of mature endothelial cel s, have the function of neovascularization and neoendothelialization. Therefore, endothelial progenitor cel s have potential applicability in many fields. Endothelial progenitor cel s can be isolated and cultured from different resources with different methods, but the biological properties and identification of endothelial progenitor cel s stil have controversies. <br> OBJECTIVE:To explore the methods of isolation and culture of endothelial progenitor cel s from the human peripheral blood and to identify the biological features of endothelial progenitor cel s. <br> METHODS:Mononuclear cel s were isolated from the human peripheral blood using density gradient centrifugation, and the cel s were resuspended in endothelial basal medium-2 supplemented with the EGM-2-MV-SingleQuots. Then, the cel s were inoculated in human fibronectin-coated culture flasks and cultured in EBM-2MV medium. The morphology of endothelial progenitor cel s was observed. The proliferation potential&nbsp;and surface markers of endothelial progenitor cel s were characterized careful y. Furthermore, the functional properties such as nitric oxide release and tube formation onMatrigel were also evaluated. <br> RESULTS AND CONCLUSION:While adherent cel s maintained, spindle-shaped cel s formed a cel cluster after6-7 days. Then, adherent cel s developed to endothelial progenitor cel s with a cobblestone appearance after 2-3 weeks. The endothelial progenitor cel s were confluent with an outgrowth appearance. Endothelial progenitor cel s had a higher proliferation potential compared with human aortic endothelial cel s under the same culture condition. Endothelial progenitor cel s expressed CD31, CD34, CD144 and KDR, displaying an obvious endothelial phenotype. Endothelial progenitor cel s were also found to uptake DiL-acLDL and exhibit lectin binding capability. Furthermore, endothelial progenitor cel s were able to form capil ary tubes on Matrigel and had the ability to release nitric oxide. Therefore, endothelial progenitor cel s can be obtained from the human peripheral blood by density gradient centrifugation and adherent culture. A combining method for the identification of endothelial progenitor cel s should be recommended.%背景：内皮祖细胞是成熟内皮细胞的前体细胞，具有新生血管和新生内皮化作用，在许多方面均有广泛应用前景，但其生物学特征及鉴定方法仍存争议。

人外周血内皮组细胞的培养与鉴定付强，郑昭芬∆，彭建强，何晋，王照飞（湖南师范大学第一附属医院湖南省人民医院心内科湖南省长沙市410005）摘要：从外周血中分离单个核细胞（MNCs），种植在纤维连接蛋白（Fn）包被的六孔板，以EGM-2培养基定向诱导培养。

培养第4天，全量换液后可见梭形或多角形贴壁细胞，镜下可见多个呈“血岛”样生长的细胞集落，集落中间为聚集成簇的圆形细胞，周边环绕放射状梭形细胞。

培养初始2周，梭形细胞首尾相连呈条索样生长或两排细胞平行排列呈管样生长，并可见条索样或管样排列的细胞相互交错成网。

培养至第3周，细胞呈现为铺路石样外观；经传代后具有次级集落形成能力。

流式细胞术显示内皮组细胞（EPCs）表面标志物CD34，KDR呈阳性，而单核、巨噬细胞系表面标志物CD14无表达。

激光共聚焦显微镜下，EPCs具有摄取Dil-acLDL和结合FITC-UEA-1的能力。

关键词：单个核细胞；内皮祖细胞；细胞形态学；细胞表型1. 材料与方法1.1 材料淋巴细胞分离液购自天津灏洋，磷酸缓冲盐溶液(PBS)、胎牛血清（FBS）、青链霉素购自Hyclone，EGM-2购自Lonza，胰蛋白酶购自Amresco，人纤维连接蛋白（HFN）购自merck，DiI-acLDL购自Molecular probes，FITC-UEA-I、Galetin 购自Sigma，PerCP/Cy5.5-KDR、PerCP/Cy5.5-IgG购自BioLegend，PE-CD34、PE-IgG、FITC-CD34、FITC-IgG购自Beckerman。

外周学取自本课题组志愿者。

1.2 方法1.2.1 密度梯度离心法分离人外周血MNCs及其诱导培养1.2.1.1 采集人外周血25ml至含枸橼酸钠的50ml离心管，然后将抗凝血用PBS等倍稀释；将稀释后的抗凝血与人淋巴细胞分离液按1：1的比例沿离心管壁缓慢置于淋巴细胞分离液上，4℃、400g离心30 min；离心后分为4层：上层为血浆、血小板和PBS，中层为淋巴细胞分离液，底层为红细胞和粒细胞，中层与上∆通讯作者。

慢性乙型肝炎患者树突状细胞培养与功能检测方法王麟;赵中夫;卢俊敏【期刊名称】《长治医学院学报》【年(卷),期】2008(22)3【摘要】目的:建立从人外周血分离培养树突状细胞(dendritic cell,DC)及检测其表型与诱导淋巴细胞增殖能力的方法.方法:从未接受抗病毒治疗的CHB患者外周血中分离单个核细胞,在含GM-CSF、IL-4、TNF-α的完全培养基中诱导培养为DC,流式细胞仪检测细胞表型,混合淋巴细胞反应检测DC刺激淋巴细胞增殖的能力.结果:CHB患者外周血单核细胞,在体外可诱导出具有典型形态及生物学活性的DC.患者DC的HLA-DR、CD80、CD86的表达率分别为(44.77±8.127)%、(36.65±6.867)%、(32.16±6.340)%,CHB患者DC刺激淋巴细胞增殖的SI为1.39±0.375.与正常人DC相比明显降低(P<0.01).结论:CHB患者单个核细胞能被诱导培养为DC;通过检测DC表型和刺激淋巴细胞增殖能力可以了解CHB患者抗HBV免疫功能.【总页数】3页(P172-174)【作者】王麟;赵中夫;卢俊敏【作者单位】山西医科大学,030001;长治医学院肝病研究所;山西医科大学,030001【正文语种】中文【中图分类】R446.6【相关文献】1.亚硒酸钠对体外培养的慢性乙型肝炎患者外周树突状细胞功能的影响 [J], 陈显兵;管小琴2.慢性乙型肝炎患者在HBV不同抗原负载下树突状细胞功能的变化 [J], 谢丽平;林涛发;朱玲玲;王少扬3.慢性乙型肝炎患者树突状细胞分离培养及其功能测定 [J], 黄振宇;范学工;颜雪梅4.慢性乙型肝炎患者外周血调节性T细胞对树突状细胞功能的抑制作用 [J], 周培培;颜学兵;徐娟;武桂萍;石银月;赵爽5.慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞的分离培养及功能研究 [J], 闫雪华;邵沂因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。