慢病毒包装实验流程介绍

病毒感染细胞实验整体流程及原理目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。

1、病毒的种类病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒1.1慢病毒1.1.1原理慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种。

构建的siRNA / miRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA 和基于瞬时表达载体构建的普通siRNA 载体相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。

1.1.2特点1）直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合RNAi 研究和体内实验中难以转染的细胞(比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。

2）可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。

3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。

4）无需任何转染试剂，操作简便。

5）可以根据客户需要制备多种标记。

1.1.3慢病毒包装简要流程：1）含有目的基因的慢病毒RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。

2）慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。

3）培养48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。

4）病毒的纯化和浓缩。

5）分装、- 80 ℃保存。

6）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。

1.2、腺病毒1.2.1原理腺病毒(Adenovirus，Ad)是一种无包膜的线状双链DNA病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。

有近50个血清型，大多数Ad载体都是基于血清型2和5，通过转基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的复制能力。

这些重组病毒仅在高水平表达E1和E3基因的细胞中复制，因此是一种适用于治疗的高效控制系统。

1.2.2特点1）几乎可以感染所有类型的细胞2）可以获得复制缺陷型(E1 和E3 缺失) 的腺病毒3）病毒滴度高，产生病毒经过浓缩后可以达到1012 PFU/mL，能有效的进行增殖。

慢病毒（过表达）包装步骤秦超1.转染复苏293T细胞,传2-3代进行转染，转染推荐使用合元公司的慢病毒转染试剂。

转染步骤：（以10cm培养皿为例）⑴最好在铺细胞后20h左右进行转染，控制转染前细胞密度70%—90%，保证细胞处于良好的状态,转染前一小时把一半培养基（约5ml）换成新的（含血清，因为此转染试剂不需换液）。

⑵加psin 10ug，pspax2 10ug，pmd2.g 5ug于800ul opti—mem，混匀⑶加40ul慢病毒转染试剂于800ul opti—mem，混匀，室温静置5min⑷将⑶所得的转染试剂稀释液滴加到⑵所得到的质粒稀释液中，边加边轻轻混匀，室温放置20min⑸取出细胞培养皿，将⑷得到的质粒转染试剂复合体加入到细胞培养基中，前后轻轻推摇使混合均匀，放回培养箱。

2.收毒(36—48h)收毒前如果质粒带有荧光标签可先看一下转染效率，一般达到60%即可.⑴将培养皿中的病毒上清液吸出到15cm离心管中，然后2000rpm离心10min,以沉淀细胞碎片。

⑵取上清用0.22um滤清过滤到浓缩管(用蛋白质浓缩管即可）中。

4000rpm离心至所需体积。

⑶浓缩完毕后，吸出浓缩后的病毒液,按每次的接毒量分装，-80℃冻存。

由于反复冻融会降低慢病毒滴度，因此避免反复冻融。

3.接毒接毒前12-20h铺细胞，使接毒时细胞密度约为40％—50%，务必使用生长状态良好的细胞。

将分装好的慢病毒滴加到细胞中，加polybrene使其终浓度为8ug/ml细胞密度60%—70%时可以再接毒一次。

4.检测及培养细胞系（48h)如果带有荧光标签可直接显微镜看一下感染效率，如需用药杀用puromycin杀三天（对照组完全杀死），剩下的即为基因整合进去的细胞。

如需培养成细胞系,可继续培养。

如果剩下的细胞较少可用高浓度血清，待细胞聚团时用胰酶消化一下，使细胞铺匀。

慢病毒包装经验在做慢病毒包装实验中，有科研工作者常遇到：用同样的病毒载体系统进行病毒包装实验，为什么有人做的很好，次次成功，有人却是时常做不出来，稳定性很差，不是滴度低就是根本不出毒?首先我们来简要介绍下慢病毒包装的流程：影响病毒包装是否成功的因素有很多，例如：细胞因素、载体系统、质粒抽提纯化情况、包装转染控制、目的基因对病毒包装影响等。

今天汉恒就把10年的病毒包装经验总结给大家。

1、实验材料的选择我们进行慢病毒包装实验时要重视包装材料——建议使用商品化的成熟毒载体系统，汉恒生物慢病毒包装体系为三质粒系统：组成为psPAX2, pMD2.G, pHBLV TM系列质粒。

包装细胞293T细胞培养时要让它培养时让它“白白胖胖、活力充沛“。

并且要定期纯化包装细胞、测序验证表达质粒。

2、目的基因对慢病毒包装的影响目的基因的大小、序列情况、该目的蛋白的功能毒性等都有可能导致无法包装成功。

一般慢病毒包装的目的片段大小在2.5k以内较为合适，大于2.5k会降低病毒包装滴度或超过载体容量无法包装。

并且，可能存在一些基因表达翻译后对包装细胞产生毒性，导致细胞状态异常，无法完成病毒包装，这种情况我们可以尝试更换病毒包装系统，例如选择包装腺病毒。

3、载体构建和抽提纯化环节我们要注意是否构建时导致质粒载体重组或某个部件缺失，或污染别的质粒、杂物?中抽纯化是否污染?要养成同时做阴性对照的习惯：建议目的基因载体和阴性对照GFP 载体是同一批，且建议每次包装都如此操作，要保证目的基因的表达载体构建纯化良好，质粒间比例得当。

建议三质粒包装系统质粒转染时的摩尔比为1：1：1。

4、细胞转染及病毒搜集阶段细胞产毒出毒期间过程中的细胞活力是包装成功及病毒滴度高低的一个重要环节，包装或转染感染前一定要重视细胞干净细微污染与否、饱满立体感是否好、铺板均匀，细胞密度在50-60%时进行包装比较合适。

在24、48 小时的要观察细胞及荧光状态，判断是否正常，转染后48h和72h分别两次收集病毒上清(48h收集后置换新鲜培液)。

Cas9蛋白过表达慢病毒包装构建步骤概述：以下采用Polyfect-V转染试剂为例说明慢病毒包装过程。

您也可以采用其它品牌转染试剂进行慢病毒包装。

转染试剂和质粒用量请参考生产厂家的说明书，也可以通过预实验决定。

无论采用哪种转染试剂，3种载体的相对比例应保持不变。

本例中病毒包装采用10cm培养皿。

如需用其它规格细胞培养器皿进行转染和病毒包装，请根据细胞相对生长面积对培养液体积和转染试剂用量进行相应调整。

1、转染前24小时，将293V细胞以4-5×106/10cm平皿密度接种，加入10ml 293V培养基37℃，5% CO2培养。

细胞转染前密度应达到80-90%。

2、漩涡震荡混匀Polyfect-V转染试剂。

3、准备2个离心管，按以下顺序分别制备质粒和转染试剂稀释液。

离心管1（质粒DNA）离心管2（转染试剂）Cas9慢病毒载体5μgPolyfect-V转染试剂20 μlpH1载体3.75μgDMEM无血清培养基480 μlpH2载体1.25μg-DMEM无血清培养基X μl-总体积500μl总体积500μl4、充分混匀。

5、将转染试剂稀释液（离心管2）加入质粒DNA溶液（离心管1）中，立刻充分混匀。

注意加入顺序非常重要。

6、室温孵育转染混合液15分钟。

7、将1ml转染混合液逐滴加入步骤1准备的细胞培养皿，前后晃动培养皿，充分混匀。

8、37℃培养。

9、4-6小时后，用10ml新鲜的293V培养基换液。

转染后24小时，用10ml病毒培养基换液。

10、转染后48小时收集细胞培养上清。

11、病毒上清可以直接用于感染目的细胞或者浓缩纯化后感染目的细胞。

推荐通过超速离心纯化、PEG6000浓缩纯化或者超滤法浓缩后再感染目的细胞。

12、病毒纯化后可以冻存在-80℃以备以后使用。

注意：1、Cas9蛋白的基因长4kb，Cas9表达慢病毒的包装效率和感染力比一般慢病毒低，推荐经过浓缩纯化再用于感染目的细胞。

2、Cas9基因较大，包装时产生的空壳病毒（即有病毒外壳，但没有组装进目的基因的病毒）比较多。

广州英思特生物科技有限公司为您提供高效快速的病毒包装实验外包服务，病毒感染细胞实验整体流程及原理目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。

1、病毒的种类1.11.1.1体，一方面1.1.21）研。

? 2）可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。

3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。

4）无需任何转染试剂，操作简便。

5）可以根据客户需要制备多种标记。

1.1.3慢病毒包装简要流程：1）含有目的基因的慢病毒 RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。

2）慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。

3）培养 48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。

4）病毒的纯化和浓缩。

5）分装、- 80 ℃保存。

6）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。

1.21.2.1达E11.2.21）2）3）4）5）1.2.3腺病毒包装简要流程1）构建表达 siRNA/miRNA 的腺病毒载体2）采用 PacI 消化纯化的质粒。

3）消化好的腺病毒表达载体转染 293A 细胞，收获细胞以制备病毒粗提液。

4）将病毒粗提液感染 293A 细胞以扩增病毒。

5）分装，-80℃保存。

1.3、慢病毒和腺病毒的比较2、构建目的基因到载体2.1构建手段一般是根据原始质粒信息确定克隆方案，有以下两种手段。

1）如果原始质粒与载体有匹配酶切位点，采用相应的内切酶切下相应片段，回收并连接到载体，酶切，并测序鉴定DNA分子。

质粒在宿主细胞体内外都可复制。

通过个些特性，人们可以把一些目的DNA片断构建在质粒中，通过转化入大肠杆菌中，利用选择培养基来筛选从而不断的复制，来得到目的产物。

3、质粒DNA在大肠杆菌里转化连接上目的基因的质粒转化大肠杆菌是为了让目的基因在大肠杆菌里扩增，然后提取质粒，以下是质粒DNA在大肠杆菌里转化的三步骤。

3.1大肠杆菌感受态细胞的制备30min2）离心管放到42℃保温90s3）冰浴2min4）每管加800ulLB液体培养基，37℃培养1h（150r/min）5）取适当体积（100ul）的复苏细胞，涂布在选择性培养基上，正置6）倒置平皿37℃，12~16h，出现菌落3.3质粒提取步骤1）取1~4ml在LB培养基中培养过夜的菌液，12000转离心1min，弃上清一次。

慢病毒包装步骤及经验总结慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的⼀种，它能够将靶基因导⼊到⼀些较难转染的细胞，如原代细胞等，并且将靶基因随机整合到宿主的基因组中，从⽽⼤⼤增加了转染效率，并且能够在细胞系中稳定表达若⼲代，可以进⾏稳转细胞株的筛选。

因为是随机整合，也有不确定因素，有些公司还能提供定点整合技术，将靶基因定点整合到基因组特定的部位，从⽽保证其⾼效表达并且对细胞不产⽣随机整合可能产⽣的伤害。

慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。

慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋⽩。

为产⽣⾼滴度的病毒颗粒，需要利⽤表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进⾏病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离⼼取得上清液后，可以直接⽤于宿主细胞的感染。

慢病毒载体基因组是正链RNA，其基因组进⼊细胞后，在细胞浆中被其⾃⾝携带的逆转录酶逆转录为DNA，形成DNA整合前复合体，进⼊细胞核后，DNA整合到细胞基因组中。

整合后的DNA转录mRNA，回到细胞浆中，表达⽬的蛋⽩或产⽣RNAi⼲扰。

慢病毒包装系统由⼀个包装质粒混合物（Mix）和⼀个慢病毒载体质粒（LentiviralVector）组成，如下图（图⽚来⾃MIT）：载体中含有HIV的基本元件5’LTR和3’LTR以及其他辅助元件等。

不同系统包装质粒混合物也不⼀样，以本实验室的三质粒系统为例，包装质粒混合物中含pMDL，VSVG，pRSV-Rev，⽐例为5:3:2；其中pMDL含有编码HIV病毒主要结构蛋⽩的gag基因和编码病毒特异性酶的pol基因，pRSV-Rev含编码调节gag和pol基因表达的调节因⼦rev基因，VSVG含有提供病毒包装所需要的单纯疱疹病毒来源的VSVG基因。

以下介绍⽤293T细胞在六孔板（35mm）中包装病毒，其他孔板相应增加或减少体积。

准备试剂篇? 核⼼质粒；? 指数⽣长的293T细胞；? 病毒包装质粒Mix:1 µg/µl（Mix=pMDL: VSV-G : REV=5:3:2），不同载体系统所⽤的包装病毒质粒也不⼀样，此系统可⽤于包装PBOBi，PLKO， Plv等载体质粒。

实验室用慢病毒包装与感染细胞实验方案实验室用慢病毒包装与感染细胞实验方案1.实验材料：细胞株：293细胞质粒：pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro（简称CDHv）pMDL-gag/pol RRE（简称RRE）pVSV-G（简称VSVG）pRSV-Rev（简称REV）转染试剂：聚乙烯亚胺（Polyethyleneimine，PEI），贮存液浓度为1mg/ml。

Sigma公司产品，Cat No. 408727-100ML感染增强剂：polybrene(hexadimethrine bromide)，中文名称为：凝聚胺或海地美溴铵其它：一次性注射器、0.45um针头滤器等2. 实验程序：1. 首先将目的基因克隆至CDHv的多克隆位点区获得CDHv-Gene，而后制备包括CDHv、RRE、VSVG和REV在内的5种质粒；2. 培养293细胞至其生长情况良好，接种至10cm细胞培养皿中，细胞数目以12hr后或第二天转染时细胞覆盖率为70-80%为佳；3. 转染293细胞：分别在两个洁净的1.5ml离心管加入500ul无血清MEM（或DMEM、PBS、saline），其中一只管中混合包装病毒用四种质粒（CDHv或CDHv-Gene、RRE、VSVG和REV），各质粒用量依次比例为4ug:4ug:3ug:2ug(或为4ug:4.2ug:3.2ug:2.1ug)，轻轻吹打3-5次混匀；另一只管中加入PEI 溶液，用量（ul数）与质粒量（ug数）大致保持1:1的关系，即第一只管中加入13ugDNA，此管中即加入13ul 浓度为1mg/ml 的PEI溶液，同样轻轻吹打混匀后，将第一管中的质粒溶液加入至第二管中的PEI溶液中，室温放置孵育15分钟后，直接加入铺有293细胞的培养皿中（此处293细胞转染前可不换液），轻轻晃动培养皿混匀后继续常规培养；4.（可选）大约8hr后，更换新鲜的完全培养基（温育为佳），继续常规培养；5. 培养48-72hr后，培养基变黄，部分293细胞浮起，收集上清至离心管中离心数分钟（目的是除去可能掺杂的293细胞，不至于下一步过滤时阻塞针头滤器），利用一次性注射器和洁净的0.45um针头滤器过滤上清至洁净的离心管中，此上清可直接冻存于-80℃备用，直接感染细胞最佳；6. 感染目的细胞：可直接将过滤后的病毒上清直接加入弃去原有培养基的铺有目的细胞的培养皿中（此时的目的细胞也应生长状态良好，覆盖率不宜过高，个人认为50-60%为宜，过高可能会因为细胞过度生长营养不足且感染效率低，或过低会形成大量病毒攻击少数细胞，两者都可能会引起大量细胞死亡），12hr 后丢弃病毒，更换新鲜培养基。

慢病毒包装步骤慢病毒包装步骤慢病毒包装简要步骤：以六孔板中的1孔为例，每个样品需要1×106个293T细胞。

1、取1.5ml灭菌EP管，加入1.5μg包装混合质粒和0.5μg表达质粒以及250μl的无血清培养基。

轻柔混匀，室温孵育5min。

3、将DNA溶液和脂质体溶液轻柔混匀。

室温孵育20min4、用胰酶消化并记数293T细胞。

用含血清的培养基重悬细胞。

5、在六孔板中每孔，加入1ml含血清的生长培养基，再加入DNA-脂质体复合物。

6、将1ml重悬的293T细胞（1×106个细胞/ml）加入到平板中。

37℃CO2孵箱中孵育过夜。

7、转染后48-72h收获含病毒的上清。

3000 rpm 离心20min，去除沉淀。

8、病毒上清-80°C贮存。

包装出来的慢病毒对NIH/3T3细胞达90%以上感染效率。

注意事项1.在慢病毒感染细胞前，为检测病毒上清培养液内病毒的活性，并确定病毒与转染细胞之间的比率，需要确定病毒2. 在慢病毒转染细胞的过程中最重要的一步是融合，只有一些较小的慢病毒载体才能转导进细胞，因此，病毒颗粒的吸附是慢病毒转染的限速步骤。

质粒转染的步骤1、DNA的量：Lipofectamine 2000=1：2~32、细胞密度大约占培养板的80%左右，转染。

3、转染期间不要加抗生素，否则会导致细胞死亡。

步骤如下：以24孔培养板为例1、转染前一天细胞换新的培养基2、制备DNA-Lipofectamine 2000复合物，如下:a、用50ul无血清培养基稀释DNA（0.8g），轻轻混匀；b、Lipofectamine 2000使用前，轻轻混匀，用48ul无血清培养基稀释2ul Lipofectamine 2000，轻轻混匀，室温孵育5分钟；c、将a+b的液体加在一起，轻轻混匀，室温孵育20分钟，使DNA-Lipofectamine 2000复合物形成；3、将100ul DNA-Lipofectamine 2000复合物加入培养板中，轻轻前后摇匀；4、放入37度孵箱中培养24~48h后，1：10传代，加入G418筛选。

使用Fugene进行慢病毒包埋步骤
注意：所有操作必须在BSL-2实验室环境进行
第一节：制作慢病毒存储液
293FT细胞的培养：细胞每周按照1:4 - 1:6的比例传代3次，保持其融合度在50%以下
第1天293FT铺板
以30%融合度左右进行10cm皿铺板，37°C, 5% CO 2条件下培养24小时
第2天转染
本实验中pcmv△R8.91:PLP-VSVG :DNA=2:2:2, Total DNA:PEI=1:3
2. 试管2：对每管的转染试剂，加入570ul Opti-MEM,将30ul Fugene加入试管正中
心，避免接触任何管壁，轻轻振荡（不能使用移液器），室温下孵育5min.
3. 将加入Opti-MEM- Fugene混合液加入试管1(DNA)，轻轻震荡混匀。

4．短暂离心使管壁液体流下。

5.室温下孵育15分钟
6. 15分钟后，将Optimem/DNA/Fugene加入细胞，摇动培养皿混匀。

7. 37°C, 5% CO 2培养过夜（12-16小时）
第3天换液
第4天。