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慢病毒生产及使用操作手册

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慢病毒使用操作指南

慢病毒使用操作指南

慢使用操作指南慢使用操作指南1.慢简介1.1 定义：慢是一种特殊的，能够在细胞中长期存活并进行复制。

1.2 用途：慢广泛应用于基因转导、基因敲除和基因表达等实验研究中。

2.慢使用前准备工作2.1 实验室准备工作2.1.1 实验室空间准备：确保实验室内有足够的操作空间和合适的消毒设备。

2.1.2 材料准备：准备好所需的培养基、细胞培养物、慢载体等。

2.1.3 设备准备：确保离心机、冰箱等设备正常工作，并准备好相关的仪器和器材。

2.2 人员准备工作2.2.1 人员培训：对参与慢操作的人员进行培训，了解操作步骤和安全风险。

2.2.2 个人防护：提供必要的防护装备，如实验服、手套、面罩等。

3.慢操作步骤3.1 细胞培养3.1.1 细胞培养物准备：根据实验需求选择合适的细胞培养物，并进行细胞的预处理和培养。

3.1.2 细胞密度调整：根据实验要求，调整细胞培养物的密度，以保证细胞的正常生长。

3.2 慢感染3.2.1 慢载体注射：将慢载体注射到培养好的细胞中。

3.2.2 感染条件控制：根据实验需求，控制慢感染的时间、浓度和温度等条件。

3.3 细胞培养和检测3.3.1 细胞培养：将感染好的细胞进行培养，并观察细胞的生长状态。

3.3.2 细胞检测：使用相关实验方法，对感染细胞进行检测和分析。

4.实验安全措施4.1 操作环境控制：确保实验室内通风良好，避免慢的扩散和污染。

4.2 废液处理：将产生的废液经过正确处理，避免对环境和人体造成污染和伤害。

4.3 事故应急处理：在发生事故或意外情况时，立即采取应急措施，并及时报告相关人员。

5.附件本文档所涉及的附件，包括但不限于实验记录表格、实验数据文件等。

6.法律名词及注释6.1 慢：指一种具有长周期和潜伏期的。

7.结束语感谢您阅读本文档，如有任何疑问或意见，请随时与我们联系。

慢病毒感染细胞 操作手册

慢病毒感染细胞 操作手册

慢病毒感染细胞实验方法一、实验概述培养生长状态良好的目的细胞，根据慢病毒感染预实验结果设计各组实验条件，进行正式感染。

若为荧光标记的慢病毒感染，参照预实验确定的感染时间点，于荧光显微镜下观察GFP表达情况，荧光率达70-80％左右，细胞汇合度达80%左右，收集细胞进入下游实验。

若为抗性基因（如Puromycin）标记的慢病毒感染，感染48 h-72h后，使用抗生素筛选48h，收集细胞汇合度70%-80%左右的生长状态良好的细胞进行下游实验。

二、实验材料1.主要试剂试剂名称试剂来源cat.No.胎牛血清Ausbian VS500TDMEM Corning 10-013-CVR胰酶生工生物工程（上海）股份有限公司T0458-50G Puromycin Clontech 631305D-Hanks 上海吉凯基因技术有限公司配制2.主要仪器仪器名称仪器来源cat.No.荧光显微镜奥林帕斯IX71CO2培养箱日本三洋SANYO MCO-175倒置显微镜上海蔡康光学仪器有限公司XDS-100离心机赛默飞世尔科技(中国)有限公司Fresco 21生物安全柜上海振样创空气净化设备有限公司Bio 1200-Ⅱ-A2三、实验步骤1．准备目的细胞（1）从液氮罐中取出细胞冻存管，迅速放入37℃水浴中，并不时摇动使其尽快解冻。

（2）完全解冻后，1300 rpm，离心3 min，75%酒精擦拭冻存管消毒后，移至生物安全柜。

（3）吸去冻存液上清，加入1 mL新鲜的完全培养基重悬细胞，将细胞悬液接种至含有3 mL完全培养基的6-cm dish 中，轻轻晃匀后置于37℃、5% CO2培养箱。

（4）24 h后更换一次培养液继续培养，待细胞汇合度达80%左右传代培养，保持细胞良好的生长状态。

2．目的细胞慢病毒感染（1）贴壁细胞：a.处于对数生长期的细胞胰酶消化，完全培养基制成3-5×104个/mL细胞悬液，并根据表1接种相应的细胞数到培养板中，继续培养保证感染时铺板量达到15-30%左右。

慢病毒感染细胞 操作手册

慢病毒感染细胞 操作手册

实验步骤：
1．准备目的细胞
1.1 细胞复苏 1) 从液氮罐中取出细胞冻存管 2) 迅速放入37℃水浴中，并不时摇动使其尽快解冻 3) 完全解冻后，1000rpm，离心2min 4) 70%酒精擦拭冻存管消毒后，移至超净台 5) 吸去冻存液上清，加入1ml 新鲜的完全培养基重悬细胞，将细胞悬液接种至含有3 ml 含 完全培养基的6-cm dish 中，轻轻晃匀后置于37℃、5%CO2 培养箱培养 6) 次日更换一次培养液后再继续培养 1.2 细胞传代 1) 将生长90%汇合的细胞进行传代 2) 弃去旧培养液，加入2 ml 灭菌的D-Hank’s 溶液，洗涤细胞生长面，然后弃去该溶液 3) 加入1 ml 胰酶消化液，37℃消化约1-2 min，直到细胞完全消化下来 4) 加入完全培养基2ml，用刻度吸管吹打数次，将壁上的细胞冲洗下来 5) 混匀细胞后分至两个新的6-cm dish 中，补足完全培养基至4ml，继续培养
慢病毒感染细胞 操作手册
实验流程描述
培养生长状态良好的目的细胞，病毒感染前一天将目的细胞分入6-well 培养板培养，感染 当天按实验设计的组别加入慢病毒颗粒进行目的细胞的感染实验。感染3 天后荧光显微镜下 观察GFP 表达情况，荧光率达80％以上，待细胞长满培养板收集细胞检测。
实验材料：
试剂
试剂名称 胎牛血清 FBS DMSO DMEM 胰酶 Opti-MEM
2． 目的细胞慢病毒感染
1) 处于对数生长期的目的细胞进行胰酶消化，制成细胞悬液 2) 将细胞悬液（细胞数约为5×104）接种于6-well 中，37℃ 5%CO2 培养箱培养待细胞融 合度达到约30% 3) 根据细胞MOI 值，加入适宜量的病毒 4) 12h 后观察细胞状态：如果没有明显的细胞毒性作用，继续培养24h 后更换培养基；如 果有明显的细胞毒性作用，立即更换培养基 5) 感染3 天后观察慢病毒上报告基因GFP 的表达情况，荧光率大于80%者，将细胞分成两 分，一份分于12孔培养板中待长满后收集细胞用于RNA提取，一份分于6孔板中待长满后收集 细胞用于蛋白提取；感染效率低于80%的实验组，重新进行感染实验 6) 以上的操作是针对贴壁细胞设计的。悬浮细胞的区别主要在细胞分盘上，它不需要提前 一天分盘。操作时将细胞离心后悬浮在不同的培养基中，计数分盘后，就可以加入病毒。 操作时污染了病毒的管子和枪头以及培养基和最后的细胞都CO2 培养箱 生物安全柜

慢病毒使用手册

慢病毒使用手册

慢病毒使用手册慢病毒（Lentivirus）是一类非常常见的病毒，它属于逆转录病毒家族。

与其他病毒相比，慢病毒具有一些特殊的特征，使其在生物研究领域和基因治疗等应用中变得非常重要。

本文将介绍慢病毒的基本特征、制备和使用方法，以及慢病毒在基因转染、基因表达和基因治疗中的应用。

一、慢病毒的基本特征慢病毒是一类具有外包膜的病毒，其基因组由一条单链正义RNA组成。

慢病毒具有较大的基因载量能力，可携带长达9kb的外源DNA序列。

另外，慢病毒具有高度的细胞性选择性，能够感染多种哺乳动物细胞，并将外源基因稳定地集成到细胞基因组中。

二、慢病毒的制备方法慢病毒的制备包括构建慢病毒载体和包装慢病毒。

构建慢病毒载体通常采用三元质粒系统，其中包括基因载体、包装载体和包衣载体。

基因载体负责携带外源基因序列，而包装载体负责表达与慢病毒复制有关的基因，如gag、pol和env等。

包衣载体则负责表达包衣蛋白，使慢病毒能够正常装配和释放。

包装慢病毒的方法通常采用转染细胞的方式。

将构建好的慢病毒载体与包装载体和包衣载体一同转染到特定的细胞中，通过包装载体表达的基因来启动慢病毒的复制和包装过程。

经过适当的培养和处理后，可以获得高效包装的慢病毒颗粒。

三、慢病毒的使用方法慢病毒主要通过基因转染、基因表达和基因治疗等方式应用于生物研究和医学领域。

1. 基因转染：慢病毒可以用于将外源基因导入到细胞中，实现基因转染。

通过选择性的感染特定细胞或细胞系，可以研究和探索特定基因的功能和调控机制。

2. 基因表达：慢病毒可以被用作基因表达工具。

外源基因在细胞内被稳定地整合到基因组中，从而实现长期稳定的基因表达。

慢病毒可以用于产生稳定的细胞株，并通过基因敲入或敲除等方法研究基因功能。

3. 基因治疗：慢病毒在基因治疗中的应用非常广泛。

通过将修正后的基因导入到患者体内的细胞中，可以实现对某些慢病毒引起的遗传疾病的基因治疗。

此外，慢病毒载体还可以用于制备疫苗和用于癌症免疫治疗等领域。

慢病毒使用操作指南

慢病毒使用操作指南

慢使用操作指南操作指南：慢使用1、简介1.1 背景介绍1.2 慢的定义1.3 慢的应用领域2、仪器与材料2.1 实验室安全设备2.2 实验室试剂和材料2.3 慢载体和质粒3、慢的生产3.1 慢生产细胞系的选择3.2 质粒构建与筛选3.3 慢包装细胞的构建与筛选3.4 慢的生产与扩增4、慢的感染4.1 细胞培养与准备4.2 慢感染的条件优化4.3 慢感染的时间和浓度控制5、慢的转染5.1 细胞转染前的处理5.2 转染的操作条件5.3 考虑的转染效率和细胞毒性问题6、实验细胞系的维护6.1 细胞的培养和传代6.2 细胞的冻存与恢复6.3 实验细胞系的检测和验证7、实验数据记录与分析7.1 实验数据的记录和整理7.2 数据分析方法与软件使用7.3 结果的展示和解释8、安全注意事项8.1 实验操作安全措施8.2 废液处理及废弃物管理8.3 慢实验室传播的预防措施9、附件9.1 相关实验记录表格9.2 质粒和慢载体序列信息法律名词及注释：1、载体：在基因工程中，指用来携带或传递目标基因的DNA或RNA分子。

2、质粒：指自主复制的独立DNA分子，可被插入或移除目标基因，用于基因克隆、表达和操控等实验。

3、细胞培养：通过体外培养细胞的技术，提供实验所需的可控环境和条件。

4、转染：将外源DNA或RNA导入细胞内，使其表达或转录的过程。

5、传代：将细胞从一个培养器转移到另一个培养器，以维持细胞系的生长。

6、冻存：将细胞以特定的方法冷冻保存，以备将来使用。

7、废液处理：对实验过程中产生的含有有害或感染性物质的废液进行妥善处理，避免对环境和人体造成危害。

8、废弃物管理：对实验中产生的废弃物进行分类、包装和处理，符合相关法规和标准。

本文档涉及附件：1、慢生产记录表2、慢感染实验记录表3、细胞培养和传代记录表4、实验数据分析表格本文所涉及的法律名词及注释：载体、质粒、细胞培养、转染、传代、冻存、废液处理、废弃物管理。

关于慢病毒感染的相关知识总结讲解

关于慢病毒感染的相关知识总结讲解

慢病毒使用操作手册一、慢病毒的储存与稀释:1. 病毒的储存：收到病毒液后在很短时间内即使用慢病毒进行实验，可以将病毒暂时放置于4 ℃保存；如需长期保存请放置于-80℃（病毒置于冻存管，并使用封口膜封口）①病毒可以存放于-80℃6个月以上；但如果病毒储存时间超过6个月，建议在使用前需要重新滴定病毒滴度②反复冻融会降低病毒滴度：每次冻融会降低病毒滴度10%；因此在病毒使用过程中应仅尽量避免反复冻融，为避免反复冻融,建议收到病毒后按照每次的使用量进行分装。

2. 病毒的稀释：如果需要稀释病毒，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用培养目的细胞用PBS或无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)。

混匀分装后4℃保存(请尽量在三天内用完) 分装后使用。

二、慢病毒用于体外（In Vitro）实验：感染培养原代细胞和建系细胞。

慢病毒对各种细胞和组织的亲嗜性不同，在使用慢病毒之前可以通过查阅相关文献，了解慢病毒对您的目的细胞的亲嗜性，感染复数（MOI 值）以及在体（In Vivo）注射所需要的病毒量。

如果没有相关文献支持，可以通过感染预实验得到合适的感染复数（MOI 值）（使用24孔板检测病毒对目的细胞的亲嗜性）。

慢病毒感染目的细胞预实验1. 慢病毒感染目的细胞预实验注意事项：①测定慢病毒对目的细胞的亲嗜性时，需要同时设置对慢病毒亲嗜性较高的细胞(HEK293T，Hela）作为平行实验的对照细胞。

②在进行慢病毒感染实验时，可以用完全培养基（培养目的细胞用）稀释；理论上，含有血清，双抗或者其他营养因子的完全培养基不影响慢病毒的感染效率。

③一般慢病毒单位为TU/ml，即每毫升中含有具有生物活性的病毒颗粒数。

如：病毒滴度为>1X108 TU/ml 即每毫升病毒液中至少含有1X108个具有生物活性的慢病毒颗粒。

2. 以24孔培养板为例，进行目的细胞和HEK293T 细胞的感染预实验实验前按照不同的MOI设置不同的感染孔，并根据MOI和细胞数量计算所需要的病毒量，如有必要可以使用PBS溶液或者无血清培养基稀释病毒原液。

关于慢病毒感染的相关知识总结

慢病毒使用操作手册一、慢病毒的储存与稀释:1. 病毒的储存：收到病毒液后在很短时间即使用慢病毒进行实验，可以将病毒暂时放置于4 ℃保存；如需长期保存请放置于-80℃（病毒置于冻存管，并使用封口膜封口）①病毒可以存放于-80℃6个月以上；但如果病毒储存时间超过6个月，建议在使用前需要重新滴定病毒滴度②反复冻融会降低病毒滴度：每次冻融会降低病毒滴度10%；因此在病毒使用过程中应仅尽量避免反复冻融，为避免反复冻融,建议收到病毒后按照每次的使用量进行分装。

2. 病毒的稀释：如果需要稀释病毒，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用培养目的细胞用PBS或无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)。

混匀分装后4℃保存(请尽量在三天用完) 分装后使用。

二、慢病毒用于体外（In Vitro）实验：感染培养原代细胞和建系细胞。

慢病毒对各种细胞和组织的亲嗜性不同，在使用慢病毒之前可以通过查阅相关文献，了解慢病毒对您的目的细胞的亲嗜性，感染复数（MOI 值）以及在体（In Vivo）注射所需要的病毒量。

如果没有相关文献支持，可以通过感染预实验得到合适的感染复数（MOI 值）（使用24孔板检测病毒对目的细胞的亲嗜性）。

慢病毒感染目的细胞预实验1. 慢病毒感染目的细胞预实验注意事项：①测定慢病毒对目的细胞的亲嗜性时，需要同时设置对慢病毒亲嗜性较高的细胞(HEK293T，Hela）作为平行实验的对照细胞。

②在进行慢病毒感染实验时，可以用完全培养基（培养目的细胞用）稀释；理论上，含有血清，双抗或者其他营养因子的完全培养基不影响慢病毒的感染效率。

③一般慢病毒单位为TU/ml，即每毫升中含有具有生物活性的病毒颗粒数。

如：病毒滴度为>1X108 TU/ml 即每毫升病毒液中至少含有1X108个具有生物活性的慢病毒颗粒。

2. 以24孔培养板为例，进行目的细胞和HEK293T 细胞的感染预实验实验前按照不同的MOI设置不同的感染孔，并根据MOI和细胞数量计算所需要的病毒量，如有必要可以使用PBS溶液或者无血清培养基稀释病毒原液。

汉恒生物-慢病毒生产及使用操作手册第二版


2. 感染细胞最佳 MOI 的测定 MOI（Multiplicity of Infection，感染复数）是指每个细胞感染的病毒
数，通常 MOI 越高，病毒整合到染色体的数量以及目的蛋白的表达量越高。 对于分裂活跃的细胞，比如 Hela、293 细胞，MOI=1～3 时，80%以上的细胞均表 达目的基因。而对于非分裂细胞，比如原代细胞，感染效率较低。需要进行 MOI 梯度摸索实验，选择适合的 MOI 进行实验。
四、慢病毒包装和浓缩 （一）质粒扩增
构建好的慢病毒载体和辅助质粒需经过大量抽提，浓度大于 1ug/ul,A260/280 在 1.7-1.8 间方可用以包毒。推荐使用 Qiagen 大抽试剂盒进 行质粒的大量去内毒素抽提。 （二）传 293T 细胞
将培养 293T 细胞 T75 瓶中的培养基吸净，加入 2mL 4 度冰箱取出的 0.25% 胰酶，使其均匀覆盖瓶底，置于 37 度培养箱中 3-5min，取出，摇晃可发现细胞 于底部脱离，将其全部晃下，加入 3mL 37 度水浴中预热的 10％ DMEM，移液枪 用 10mL 移液管进行吹打，较大力吹打 6-8 次即可，不留死角，瓶口处较难吹打 可将移液管对准培口，小力将培养基打出即可覆盖到接近瓶口的细胞。之后，将 所有细胞吸出，置于 15mL 离心管中，取 50ul 混匀后的细胞于 1.5mL eppendorf
当细胞传代次数过多，细胞状态变差时，或者细胞出现污染事故时，需要丢 弃并对最初冻存的细胞进行复苏。
1、设置温度为 37~42℃的水浴。 2、查看细胞库记录，根据记录从液氮罐中取出冻存的细胞（需戴上棉手套， 防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，尽量在 1~2min 内使细胞溶液完全 溶解。 3、将细胞溶液转移到 15ml 离心管中，并在其中加上 1ml 新鲜的完全培养 基，混匀后离心，1000rpm，5min。 4、去掉上清，加入 5ml 新鲜的完全培养基，混匀沉淀后，转入 6cm 培养皿。 5、将培养皿平稳放入 37℃、5%CO2 和 95%相对湿度的培养箱中培养。 6、第二天观察细胞存活率。给细胞换一下培养基。以后每天观察细胞生长 情况。

慢病毒包装及质粒转染手册

使用Fugene进行慢病毒包埋步骤
注意：所有操作必须在BSL-2实验室环境进行
第一节：制作慢病毒存储液
293FT细胞的培养：细胞每周按照1:4 - 1:6的比例传代3次，保持其融合度在50%以下
第1天293FT铺板
以30%融合度左右进行10cm皿铺板，37°C, 5% CO 2条件下培养24小时
第2天转染
本实验中pcmv△R8.91:PLP-VSVG :DNA=2:2:2, Total DNA:PEI=1:3
2. 试管2：对每管的转染试剂，加入570ul Opti-MEM,将30ul Fugene加入试管正中
心，避免接触任何管壁，轻轻振荡（不能使用移液器），室温下孵育5min.
3. 将加入Opti-MEM- Fugene混合液加入试管1(DNA)，轻轻震荡混匀。

4．短暂离心使管壁液体流下。

5.室温下孵育15分钟
6. 15分钟后，将Optimem/DNA/Fugene加入细胞，摇动培养皿混匀。

7. 37°C, 5% CO 2培养过夜（12-16小时）
第3天换液
第4天。

慢病毒载体构建及包装操作手册

慢病毒载体构建及包装操作手册目录慢病毒收到后的注意事项一、整体实验流程二、实验材料三、慢病毒包装和浓缩四、感染目的细胞附1. 汉恒生物慢病毒质粒列表附2. 慢病毒滴度测定方法简介附3. 慢病毒MOI感染参数附4. 汉恒生物各病毒载体感染目的细胞比较慢病毒安全使用和注意事项➢慢病毒安全使用注意事项（*非常重要！！！*）1)慢病毒相关实验请在生物安全柜（BL-2级别）内操作。

2)操作病毒时请穿实验服，佩戴口罩和手套，尽量不要裸露双手及手臂的皮肤。

3)操作病毒时特别小心病毒溅出。

如果操作时超净工作台有病毒污染，请立即用70%乙醇加1%的SDS溶液擦拭干净。

接触过病毒的枪头，离心管，培养板，培养液请于84消毒液浸泡后统一处理。

4)如需要离心，应使用密封性好的离心管，如有必要请用封口膜封口后离心。

5)病毒相关的废弃物需要特殊收集，统一经高温灭菌处理。

6)实验完毕用香皂清洗双手。

➢慢病毒收到后的注意事项1)慢病毒的储存用户收到病毒液后在短期内即使用慢病毒进行实验，可以将病毒暂时放置于4 ℃保存（尽量一周内用完）；如需长期保存请分装后放置于-80℃。

注：a．反复冻融会降低病毒滴度（每次冻融会降低病毒滴度10%-50%）；在病毒使用过程中应尽量避免反复冻融，所以我们前期对病毒进行了分装（200 l/tube），收到后直接放置-80℃保存即可。

b．如果病毒储存时间超过6个月，我们建议在使用前重新测定病毒滴度。

2)慢病毒的稀释用户需要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用培养目的细胞用PBS或无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)混匀分装后置于4℃保存(请尽量一周内用完)。

一、整体实验流程二、实验材料（一）慢病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为三质粒系统，组成为psPAX2, pMD2.G, pHBLV TM系列质粒。

1、载体信息（见附表1）2、细胞株：我们采用293T作为慢病毒的包装细胞。

该细胞系为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM+10% FBS+双抗。

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慢病毒生产及使用操作手册
当细胞生长到汇合率达到 80%~90%时需要对细胞进行传代操作，以扩大细 胞数量，维持细胞良好的生长状态。
（三）做脂转 complex DMEM 需在 37 度水浴中预热，LipFiterTM 转染试剂需恢复至室温方可使用，
使用前需摇匀。
转染每瓶 T75 的 complex 成分如下：
pspax
10μg
PMD2G pHBLVTM 系列载体
10μg 10μg
转染后 6h 换新鲜培液。
注：LipoFiterTM 转染试剂为汉恒生物产品，使用说明参考 LipoFiterTM 说明书。 LipoFiterTM 转染最适的细胞密度为 50%-70%。
慢病毒生产及使用操作手册
慢病毒生产及使用操作手册
一、实验流程 制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体 分别进行高
纯度无内毒素抽提，共转染 293T 细胞，转染后 6 h 更换为完全培养基，培养 48 和 72h 后，分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，病毒上清液通过超离心浓缩 病毒。
2） 包装质粒信息如下： PSPAX2 及 PMD2G 载体图谱和序列信息 (购自 addgene)
2、细胞株 293T，慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养 基为 DMEM(含 10% FBS)。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。 3、菌株 大肠杆菌菌株 DH5α。用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。
（二）传 293T 细胞
将培养 293T 细胞 T75 瓶中的培养基吸净，加入 2mL 4 度冰箱取出的 0.25%
胰酶，使其均匀覆盖瓶底，置于 37 度培养箱中 3-5min，取出，摇晃可发现细胞
于底部脱离，将其全部晃下，加入 3mL 37 度水浴中预热的 10％ DMEM，移液枪
用 10mL 移液管进行吹打，较大力吹打 6-8 次即可，不留死角，瓶口处较难吹打
（得每大格细胞数），再乘以 10（10 倍稀释），即为实际 n 万/mL 细胞浓度。
传代当天记为第一天，若第二天进行转染，铺 900-1000 万/T75；若第三天转染，
铺 350-400 万/T75。每瓶 T75 加 10mL 10％DMEM 培养基。转染当天观察细胞密度，
60％满即可进行转染。转染前无需换培养基。
慢病毒生产及使用操作手册
随着传代的次数增加，293T 细胞会出现生长状态下降、突变等。为了防止 此类现象的出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性 和持续性。在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。
1、去掉上清液，加入 PBS 洗去残留的培养基； 2、加入 0.25%的胰酶，消化 1~2min 后，镜下观察细胞变圆，细胞间间隙 加大时，去除胰酶，加入新鲜培养基吹打混匀，移入离心管中。 3、细胞计数，将细胞全部晃下，加入 3mL 37 ℃ 预热的 10％ DMEM， 用 10mL 移液管进行吹打，较大力吹打 6-8 次即可，不留死角，之后，将所 有细胞吸出，置于 15mL 离心管中，取 50ul 混匀后的细胞于 1.5mL eppendorf 管中，加 入 450ul 10％ DMEM，即为 10 倍稀释，混匀，取 10ul 细胞于计数板 中计数。计数板上共 4 大格，每大格 16 小格。计数时，4 大 格均计 数，总数除以 4（得每大格细胞数），再乘以 10（10 倍稀释），即 为 实际 n 万/mL 细胞浓度。 4、细胞离心，1000rpm，5min。去掉上清。 5、根据细胞计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基 +20%FBS+10%DMSO）,重悬细胞，密度为 3 x 106 个/ml。 6、分装进细胞冻存管，放入冻存盒中，放入-80℃超低温冰箱。 7、第二天将细胞放于液氮罐中长久保存，并作记录。保存过程中，要不时 复苏细胞检测细胞存活率，观察细胞状态等。 （二）293T 细胞的传代
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（一）质粒扩增
构建好的慢病毒载体和辅助质粒需经过大量抽提，浓度大于 1g/l,A260/280 在 1.7-1.8 间方可用以包毒。推荐使用 Qiagen 大抽试剂盒进 行质粒的大量去内毒素抽提。质粒抽提完毕需跑胶确定质粒质量。
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用途 过表达 干扰
其他载体
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慢病毒载体 pHBLV-CMVIE-IRES-ZsGreen、 pHBLV CMVIE-Puro pHBLV-U6-ZsGreen、 pHBLV-U6puro 还有其他荧光标记和启动子混搭载体，以及 tet-on 系统高表达/干扰系列载体，详情可咨 询公司分子生物学技术工程师。
三、包装细胞 293T 细胞的培养 （一） 293T 细胞的冻存
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详细的细胞数/MOI/病毒体积换算参见附 1 表格；部分细胞 MOI 建议及 polybrene 适用情况参见附 2 表格。
3.感染步骤：4 小时小体积感染法 按实验需要将细胞铺板（比如 12 孔板）。细胞数以第 2 天密度约 50%为宜。
37℃ 培养过夜。 对于 Polybrene 可施加的细胞：准备完全培养基和 Polybrene 混合物，
可将移液管对准培口，小力将培养基打出即可覆盖到接近瓶口的细胞。之后，将
所有细胞吸出，置于 15mL 离心管中，取 50ul 混匀后的细胞于 1.5mL eppendorf
管中，加入 450ul 10％ DMEM，即为 10 倍稀释，混匀，取 10ul 细胞于计数板中
计数。计数板上共 4 大格，每大格 16 小格。计数时，4 大格均计数，பைடு நூலகம்数除以 4
2）Polybrene 预实验请先以对照病毒进行摸索，部分细胞系 MOI 及 Polybrene 的 使用参见附表 2。
2. 感染细胞最佳 MOI 的测定
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MOI 一般以 1：3：5 或者 1:3:10 进行梯度摸索，一般的细胞基础慢病毒感 染 MOI 可以 10 为开始，即 10，30，50 或者 10，30，100。 MOI 对应病毒体积的换算 转染时细胞数（一般以传代计数细胞数×2 计算）×MOI=病毒个数；则加入的病 毒体积数=病毒个数/病毒滴度。 例子：转染细胞数为 105 个，MOI 为 10，则需要病毒的个数为 106 个，病毒如果 滴度为 108 IU/ml,则需要加入的病毒体积为 106/（108 IU/ml）=10-2ml=10ul。同 理，30，50 相应为 30ul，50ul。
1、消化细胞，方法同细胞冻存。 2、细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。 3、根据具体情况，将细胞分到 10cm 培养皿中，每个培养皿补足到 10ml 培养基。 4、将培养皿平稳放回 37℃、5%CO2 和 95%相对湿度的培养箱中培养。 （三）293T 细胞的复苏 当细胞传代次数过多，细胞状态变差时，或者细胞出现 污染事故时，需要丢 弃并对最初冻存的细胞进行复苏。 1、设置温度为 37℃的水浴。 2、查看细胞库记录，根据记录从液氮罐中取出冻存的细胞（需戴上棉手套， 防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，尽量在 1~2min 内使细胞溶液完 全溶解。 3、将细胞溶液转移到 15ml 离心管中，并在其中加上 1ml 新鲜的完全培养 基，混匀后离心，1000rpm，5min。 4、去掉上清，加入 5ml 新鲜的完全培养基，混匀沉淀后，转入 6cm 培养 皿。 5、将培养皿平稳放入 37℃、5%CO2 和 95%相对湿度的培养箱中培养。 6、第二天观察细胞存活率。给细胞换一下培养基。以后每天观察细胞生长 情况。 四、慢病毒包装和浓缩
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慢病毒生产及使用操作手册
MOI（Multiplicity of Infection，感染复数）是指每个细胞感染的病毒 数。通常 MOI 越高，病毒整合到染色体的数量以及目的蛋白的表达量越高。 慢
病毒对于不同种类不同来源的细胞，其最适 MOI 各有差别，原则上最适 MOI 是感染效率较好的最低 MOI。原则上每种细胞对应每种类型的病毒都应该进 行最适 MOI 摸索实验，设置 MOI 梯度摸索实验，选择适合的 MOI 进行实验。
二、实验材料 （一）慢病毒载体、包装细胞和菌株 该病毒包装系统为三质粒系统，组成为 pspax2, pMD2G, pHBLVTM 系列质粒。
1、载体信息 1) 慢病毒克隆载体图谱如下：
各载体用途如下表：
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Polybrene 终浓度为摸索得到的最适终浓度。移去培养基并添加 1/2 体积，即 0.25 ml Polybrene/培养基混合物于每孔中（适用于 24 孔板，其他孔板请相应 调整体积，具体参考《病毒小培养体积感染表》），37℃小体积感染 4 小时，4 小时后补齐含同等浓度 Polybrene 培养基至正常体积，即 0.5ml（24 孔板）。