慢病毒包装、浓缩、纯化、滴度实验步骤

慢病毒包装、滴度测定方案流程一、背景：四质粒的包装体系1.含有目的基因的转染质粒2.VSV-G：pMD2.G（包膜质粒）3.Rev：pRSV-Rev4.Gag/Pol：pMDLg/pRRE二、包装细胞：293T293T细胞由293细胞通过基因技术派生出的细胞系，是经过腺病毒E1A基因的转染，能表达SV40大T抗原，含有SV40复制起始点与启动子区。

该细胞贴壁松散，操作时请尽量轻柔；换液时需预热培养基。

培养条件：DMEM ＋10% FBS＋1% P/S三、主要试剂1.93T培养基：高糖DMEM（含丙酮酸钠、谷氨酰胺）+ 10% FBS + GlutaMAX2.病毒收获培养基：取50 ml 293T培养基，加入0.5 g BSA（Sigma A9418）和终浓度为10-15 mM的HEPES，0.22 µm过滤。

3.无内毒素质粒抽提试剂盒4.Polybrene (10 mg/ml)：促转染试剂，提高转染效率。

四、包装步骤1.Day1:汇合度90%的10cm dishs HEK293T细胞（~ 6×107/dish）按1：1比例传代至15cm dishs，第二天细胞汇合度达到90%-95%（~1.5×108/dish），培养基为Gibico高糖DMEM培养基（含10%FBS）。

2.Day2:1)转染前2-3个小时更换培养基（含10%FBS)；2)按照以下比例配制转染试剂：Mix 1体积μlMix 2量DMEM（无FBS）1000μlDMEM（无FBS）1000μl目的基因质粒25μgVGF190μl（1μg/μl）PMD2G7.5μgPSPAX215μgMix 1和Mix 2分别混合后，室温5-10min, 后将Mix 1和Mix 2混合，室温30min，加入至15cm dish中。

（细胞达到汇合度90%，细胞过少会影响转染效率）。

3.Day36h-24h内更换新鲜培养基（含10%FBS），观察转染效率并拍照。

慢病毒生产及使用操作手册一、实验流程制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 更换为完全培养基，培养48和72h后，分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，病毒上清液通过超离心浓缩病毒。

以下内容由汉恒生物科技（上海）有限公司精心整理总结。

二、实验材料（一）慢病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为三质粒系统，组成为pspax2, pMD2G,pHBLV TM系列质粒。

1、载体信息（见附录）2、细胞株 293T，慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM(含10% FBS)。

贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。

3、菌株大肠杆菌菌株DH5α。

用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。

三、包装细胞293T细胞的培养（一） 293T细胞的冻存随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降、突变等。

为了防止此类现象的出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。

在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。

1、去掉上清液，加入PBS洗去残留的培养基；2、加入0.25%的胰酶，消化1～2min后，镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，去除胰酶，加入新鲜培养基吹打混匀，移入离心管中。

3、细胞计数，将细胞全部晃下，加入 3mL 37 ℃预热的 10％ DMEM，用 10mL 移液管进行吹打，较大力吹打 6～8 次即可，不留死角，之后，将所有细胞吸出，置于15mL 离心管中，取 50ul 混匀后的细胞于 1.5mL eppendorf 管中，加入 450ul 10％ DMEM，即为 10 倍稀释，混匀，取 10ul 细胞于计数板中计数。

计数板上共 4 大格，每大格 16 小格。

计数时，4 大格均计数，总数除以 4（得每大格细胞数），再乘以 10（10 倍稀释），即为实际 n万/mL 细胞浓度。

4、细胞离心，1000rpm，5min。

慢病毒载体构建及包装操作手册目录慢病毒收到后的注意事项一、整体实验流程二、实验材料三、慢病毒包装和浓缩四、感染目的细胞附1. 汉恒生物慢病毒质粒列表附2. 慢病毒滴度测定方法简介附3. 慢病毒MOI感染参数附4. 汉恒生物各病毒载体感染目的细胞比较附5. 实验室病毒操作应急预案慢病毒安全使用和注意事项➢慢病毒安全使用注意事项（*非常重要！！！*）1)慢病毒相关实验请在生物安全柜（BL-2级别）内操作。

2)操作病毒时请穿实验服，佩戴口罩和手套，尽量不要裸露双手及手臂的皮肤。

3)操作病毒时特别小心病毒溅出。

如果操作时超净工作台有病毒污染，请立即用70%乙醇加1%的SDS溶液擦拭干净。

接触过病毒的枪头、离心管、培养板、培养液请于84消毒液浸泡后统一处理。

4)如需要离心，应使用密封性好的离心管，如有必要请用封口膜封口后离心。

5)病毒相关的废弃物需要特殊收集，统一经高温灭菌处理。

6)实验完毕用香皂清洗双手。

➢慢病毒收到后的注意事项1)慢病毒的储存用户收到病毒液后如在短期内使用慢病毒进行实验，可以将病毒暂时放置于4 ℃保存（尽量一周内用完）；如需长期保存请分装后放置于-80℃。

注：a．反复冻融会降低病毒滴度（每次冻融会降低病毒滴度10%-50%）；在病毒使用过程中应尽量避免反复冻融，所以我们前期对病毒进行了分装（200 l/tube），收到后直接放置-80℃保存即可。

b．如果病毒储存时间超过6个月，我们建议在使用前重新测定病毒滴度。

2)慢病毒的稀释用户需要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用培养目的细胞用PBS或无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)混匀分装后置于4℃保存(请尽量一周内用完)。

一、整体实验流程二、实验材料（一）慢病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为三质粒系统，组成为psPAX2, pMD2.G, pHBLV TM系列质粒。

1、载体信息（见附表1）2、细胞株：我们采用293T作为慢病毒的包装细胞。

一、包装细胞293T细胞的培养一、293T细胞的冻存1. 随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降，出现突变等。

所以要在细胞购进时就进行冻存。

2. 在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。

3. 倒去细胞上清液，加入D-Hank's液洗去残留的培养基。

4. 加入0.25%的胰酶，消化10-20s后倒去。

5. 镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，加入新鲜培养基吹打混匀。

6. 细胞计数。

7.将细胞离心，1000rpm，2min。

8. 根据计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基+20%FBS+10% DMSO）重悬细胞，密度为3×106个/ml。

10. 第二天将细胞放入液氮灌，并记录。

二、293T细胞的传代1. 当细胞生长至汇合率达到80~90%需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。

2. 消化细胞，方法同上。

3. 细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。

密度为3×105个/ml。

4. 分到10cm培养皿中，10ml/皿。

三、293T细胞的复苏1. 当细胞传代次数过多（超过50代），细胞状态变差时或细胞出现污染事故时，需要丢弃并对开始冻存的细胞进行复苏。

2. 打开水浴锅，设置温度为40℃。

3. 查看细胞库记录，根据记录从液氮灌中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，在1~2 min内使细胞溶液完全溶解。

4. 将1ml细胞溶液加入9 ml完全培养基中并混匀后转入10cm培养皿。

5. 放回37℃、3%CO2和95%相对湿度的培养箱中培养。

6. 第二天观察细胞存活率。

倒掉旧的培养基，加入10ml新鲜培养基。

二、慢病毒的包装、浓缩和滴度测定1. 所用病毒检测引物为WPRE特异引物，序列如下5'-CCTTTCCGGGACTTTCGCTTT-3' (forward primer),5'-GCAGAATCCAGGTGGCAACA-3' (reverse primer) and5'-FAM-ACTCATCGCCGCCTGCCTTGCC-TAMRA-3' (probe)2. TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems， cat. no. 4304437)3. TaqMan DNA Template Reagent Kit (Applied Biosystems， cat. no. 401970)4. TaqMan RNaseP control reagent (Applied Biosystems， cat. no. 4316844)用于包装的293T细胞的培养用于包装的293T细胞(ATCC No. CRL-11268)必需选择处于生长旺盛期，细胞状态较佳，存活率90%以上，细胞边缘清晰，传代次数较低。

v1.0 可编辑可修改慢病毒包装操作流程一、材料1 细胞培养试剂试剂名称终浓度试剂品牌DMEM/High glucose基础培养基90%Invitrogen胎牛血清10%Invitrogen/Gibco丙酮酸钠1mM InvitrogenDMSO（冻存用）10%2 慢病毒包装试剂试剂名称浓度试剂品牌Lipofectamine 2000InvitrogenOpti-MEM基础培养基InvitrogenPEG6000溶液50%WakoNaCl溶液40 mMHBSS溶液Invitrogen3 耗材50 mL离心管15 mL离心管10 cm细胞培养皿μm过滤器2 mL EP管二、操作流程1细胞培养1.1293T/293FT细胞的复苏1)将完全培养液从4°C中取出放置到室温预热30 min左右。

在超净台内，用吸管吸取6~7mL完全培养液至15 mL离心管中；2)快速将冻存的细胞从液氮中取出，并迅速用镊子夹住盖子放入37°C水浴中快速晃动（水不要没到盖子），使其在1~2分钟内完全融化；3)在超净台内，用酒精棉球擦拭冻存管外壁消毒，用吸管吸取所有融化的细胞悬液至装准备好的完全培养液中，轻轻吹打混匀，使冻存液分散开（目的是让DMSO分散，降低恢复室温的DMSO对细胞造成的毒性作用）。

4)在室温条件下，250 g离心4分钟。

5)离心后，在超净台内小心倒去上清，用吸管吸取 2 mL新鲜完全培养液重悬细胞至单细胞悬液，再转移已经加好培养基的培养瓶/培养皿中，写上细胞名称、日期，放置 37°C、5% CO2饱和湿度培养箱内培养。

（首次复苏细胞时，离心重悬后需取样计数，根据细胞数选择面积合适的培养容器。

）6)复苏翌日，给复苏的293T细胞更换新鲜的完全培养基。

1.2293T/293FT细胞传代1)待细胞长至60%-70%融合度即可传代。

将培养瓶里的所有培养液全部移去，用1×PBS洗涤细胞两次（洗涤速度要快，避免细胞干涸时间过长），以去除残余的培养液和血清（血清含有胰酶的抑制因子）；2)加入适当的胰酶溶液，能使其完全浸过细胞即可，室温孵育1-2分钟。

慢病毒载体构建及包装流程
（一）实验流程（1和2为并列步骤）
1.慢病毒过表达质粒载体的构建
设计上下游特异性扩增引物，同时引入酶切位点，PCR(采用高保真KOD酶，3K内突变率为0%)从模板中（CDNA质粒或者文库）调取目的基因CDS区（coding sequence）连入T载体。

将CDS区从T载体上切下，装入慢病毒过表达质粒载体。

2.慢病毒干扰质粒载体的构建
合成siRNA对应的DNA颈环结构，退火后连入慢病毒干扰质粒载体
3. 慢病毒载体的包装与浓缩纯化
制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 更换为完全培养基，培养24和48h后，分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，病毒上清液通过超离心浓缩病毒。

(二) 实验材料
2.1慢病毒载体、包装细胞和菌株
该病毒包装系统为三质粒系统，组成为pspax2, pMD2G, pLVX-IRES-ZsGreen1/pLVX-shRNA2。

其中质粒上的ZsGreen1表达框能表达绿色荧光蛋白（GFP）。

载体信息
1) 慢病毒克隆载体图谱如下：
2） 包装质粒信息如下：
PMD2G 载体图谱和序列信息
PSPAX2载体图谱和序列信息：
细胞株293T，慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM(含10% FBS)。

贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。

菌株大肠杆菌菌株DH5α。

用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。

(三)流程图。

慢病毒包装实验流程、原理与步骤慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种，它需要相对较长的孵育时间，所以称之为“慢”病毒，Lenti在拉丁文中就是慢的意思。

它包括人免疫缺陷病毒（HIV）、猫免疫缺陷病毒（FIV）、猿免疫缺陷病毒（SIV）、牛免疫缺陷病毒等。

其中研究最多的是HIV-1慢病毒。

慢病毒载体（Lentivirus vector）是以慢病毒基因组为基础，由所需的目的基因取代部分基因构建而成。

目前使用的慢病毒载体多采用HIV-1基因组改造而来。

与一般的逆转录病毒载体相比，慢病毒载体对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力而具有更广的宿主范围。

慢病毒载体还可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而实现持久表达。

在感染能力方面可以有效感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，又很少引发机体免疫反应，能达到良好的基因治疗效果，具有广阔的应用前景。

慢病毒包装实验流程如下：1.根据目的基因相关信息（序列，基因序列号等）获取目的基因；2.根据客户要求选择对应载体；3. 将目的基因构建到慢病毒载体获得含有目的基因的重组载体；4. 测序鉴定重组质粒，高纯化（不含内毒素）提取的重组质粒；5. 使用高纯提重组载体和慢病毒包装质粒共转染 293FT 细胞，进行病毒包装并收集上清液；6. 通过超滤和超速离心浓缩和纯化病毒；7. 使用病毒液感染 293T 细胞，药物筛选细胞，构建稳定表达细胞系。

慢病毒使用安全及注意事项1.慢病毒相关实验请在生物安全柜内操作。

如果使用超净台请不要打开风机。

2.慢病毒感染实验时，请穿实验服，佩戴口罩和手套，尽量不用将身体的任何部位裸露在安全柜内。

3.操作病毒时尽量避免气雾或者飞溅。

如果溅出，请立即用70%乙醇加1%的SDS溶液擦拭干净。

4.如果需要离心，应使用密封性好的离心管，或者用Parafilm膜封口后离心。

5.废弃的含有病毒的培养基或者病毒接触过的枪头、离心管、培养板及培养瓶请用84消毒液（1:20），浸泡一天后丢弃。

慢病毒纯化
慢病毒纯化是指从慢病毒病毒培养物中分离和纯化出慢病毒颗粒的过程。

这个过程通常包括以下步骤：
1.细胞培养：首先，需要将慢病毒所感染的细胞系培养到适
当的细胞密度和病毒扩增时间，以确保足够的病毒产量。

2.细胞裂解：将培养的细胞收集并经过离心等方法分离，然
后使用裂解缓冲液裂解细胞，释放出细胞内的慢病毒。

3.离心和过滤：经过细胞裂解后，样品需要进行离心，以去
除细胞碎片和核酸残余物。

然后，可以使用过滤器对澄清
的上清液进行过滤以去除大颗粒物质。

4.病毒浓缩：慢病毒通常是低浓度的，因此需要进行浓缩。

可以使用超滤、离心和沉淀等方法，将病毒颗粒从大量液
体中浓缩到较小的容量中。

5.梯度离心：为了进一步纯化病毒，可以使用梯度离心技术，
如葡聚糖梯度离心或离心浓缩。

这个过程可将纯化的病毒
与细胞碎片、蛋白质和其他污染物分离开来。

6.病毒沉淀：经过梯度离心后，可以进行病毒的最终沉淀。

使用离心来将病毒沉淀到盘底或在离心管底端形成浓缩的
沉淀。

7.再悬浮：将病毒沉淀用缓冲液再悬浮，以便进行后续实验
应用。

在整个慢病毒纯化的过程中，必须遵守基本的生物安全措施，
并使用无菌操作、合适的缓冲液和处理设备。

每一步之间的温度、离心速度和离心时间等参数也需要根据具体的实验条件和病毒类型进行优化和调整。

慢病毒包装操作流程一、材料1 细胞培养试剂试剂名称终浓度试剂品牌DMEM/High glucose基础培养基90%Invitrogen胎牛血清10%Invitrogen/Gibco丙酮酸钠1mM Invitrogen2 慢病毒包装试剂试剂名称浓度试剂品牌Lipofectamine 2000InvitrogenPEG6000溶液50%WakoHBSS溶液Invitrogen3 耗材50 mL离心管15 mL离心管10 cm细胞培养皿μm过滤器2 mL EP管二、操作流程1细胞培养1.1293T/293FT细胞的复苏1)将完全培养液从4°C中取出放置到室温预热30 min左右。

在超净台内，用吸管吸取6~7mL完全培养液至15 mL离心管中；2)快速将冻存的细胞从液氮中取出，并迅速用镊子夹住盖子放入37°C 水浴中快速晃动（水不要没到盖子），使其在1~2分钟内完全融化；3)在超净台内，用酒精棉球擦拭冻存管外壁消毒，用吸管吸取所有融化的细胞悬液至装准备好的完全培养液中，轻轻吹打混匀，使冻存液分散开（目的是让DMSO分散，降低恢复室温的DMSO对细胞造成的毒性作用）。

4)在室温条件下，250 g离心4分钟。

5)离心后，在超净台内小心倒去上清，用吸管吸取2 mL新鲜完全培养液重悬细胞至单细胞悬液，再转移已经加好培养基的培养瓶/培养皿中，写上细胞名称、日期，放置37°C、5% CO2饱和湿度培养箱内培养。

（首次复苏细胞时，离心重悬后需取样计数，根据细胞数选择面积合适的培养容器。

）6)复苏翌日，给复苏的293T细胞更换新鲜的完全培养基。

1.2293T/293FT细胞传代1)待细胞长至60%-70%融合度即可传代。

将培养瓶里的所有培养液全部移去，用1×PBS洗涤细胞两次（洗涤速度要快，避免细胞干涸时间过长），以去除残余的培养液和血清（血清含有胰酶的抑制因子）；2)加入适当的胰酶溶液，能使其完全浸过细胞即可，室温孵育1-2分钟。

慢病毒包装、浓缩纯化及滴度测定一、试剂、耗材及仪器1.1试剂1.1.1 商品化试剂及试剂盒名称厂家货号Lenti-X 293T Cell Line clontech632180 DMEM Gibco C11995500BTFetal Bovine Serum, Qualified, Australia Origin LifeTechnologies10099-141Lipofectamine™LTX & Plus Reagent invitrogen15338 QIAGEN Plasmid Midi Kit (25)QIAGEN121431.1.2 试剂配制a. 氨苄青霉素储液称取氨苄青霉素10g，加8ml 超纯水，溶解，定容至10 ml，过滤除菌，分装，-20℃保存。

b. LB液体培养基实用文档称取蛋白胨（tryptone）10g、酵母提取物（yeast extract）5g、NaCl 10 g，加800 ml 超纯水，用10M NaOH调节pH至7.0，定容至1, 000 ml，分装，高压灭菌(121℃/20min)，4℃保存。

c. 完全培养基把DEME培养基与血清按照9:1(V/V)进行混合。

d. 50%PEG6000溶液称取125gPEG6000用超纯水溶解，定容到250ml，分装，高压灭菌(121℃/20min)，4℃保存。

e. 4M NaCl溶液称取46.752gNaCl，加超纯水溶解，定容到200ml，分装，高压灭菌(121℃/20min)，4℃保存。

f. PBS缓冲液称取8gNaCl，0.2gKCl，3.58gNa2HPO4.12H2O，0.27gKH2PO4，加800 ml 超纯水，调节pH至7.4，定容至1, 000 ml，分装，高压灭菌(121℃/20min)，4℃保存。

实用文档1.2 耗材名称厂家货号25cm2 Growth Area Flasks corning430639 75cm2细胞培养瓶corning430641 TC表面细胞培养皿，规格：35mm corning430165 TC表面细胞培养皿，规格：60mm corning430196 TC表面细胞培养皿，规格：100mm corning430293 6孔细胞培养板corning3516外旋盖冻存管corning430659 15ml尖底离心管corning430790 50ml尖底离心管corning4558 3毫升吸管Biologix30-0138A1 1.3 仪器名称仪器厂家仪器型号二氧化碳培养箱Thermo371生物安全柜Thermo Forma Class II，B2倒置荧光显微镜OLYMPUS IX71实用文档台式高速冷冻离心机Thermo LEGND MACH 1.6R小型高速离心机Thermo LEGEND MICRO 17小型冷冻高速离心机Thermo LEGEND MICRO 17R超低温冰箱SANYO MDF-U73V冰箱Haier BCD-290W二、方法2.1．包装细胞准备2.1.1.细胞复苏a. 把完全培养基预热至37℃；用清洗洁净的500ml烧杯盛300ml超纯水，然后放入37℃水浴锅中，预热至37℃（至少需30min）；准备好生物安全柜及所需培养耗材（灭菌处理）；b. 快速从液氮罐中取出装有冻存细胞的冻存管并放置于装有液氮的保温杯中，用洁净镊子取出冻存管，并立即放入上述准备好的水浴中（放入之前快速检查盖子是否拧紧，盖子切勿没入水中），用镊子镊好冻存管，快速沿着烧杯内壁转圈，细胞未冻融时切勿取出观察，细胞冻融时间一般为1-2 min，如果超过2 min仍未冻融，应掉弃该管细胞，细胞冻融后把冻存管放入70%酒精中3s，然后立即放入生物安全柜中；实用文档c. 把冻融的细胞立即转移至装有1ml预热完全培养基的15ml离心管中，混匀，立即加入4ml预热完全培养基，混匀；d. 加入5ml预热完全培养基，混匀，离心（100 g，5 min），小心移除上清；e. 加入6 ml预热完全培养基，吹打重悬细胞，然后把细胞悬液转移至T25培养瓶中，并放入二氧化碳培养箱（5% CO2, 37℃）中培养；f. 24小时观察细胞的贴壁情况，并根据细胞的密度进行换液或细胞传代；2.1.2细胞培养a. 当细胞达到80%融合时，移培养液，用PBS洗涤两次，加入1ml胰酶消化液，把培养皿置于倒置显微镜下观察，如大部分细胞变圆，立即移除胰酶消化液（如大部分细胞飘起，可不移除胰酶消化液），加入6ml 预热DMEM完全完全培养基，用吸管取培养液吹打瓶壁细胞，使其脱离瓶壁形成单细胞悬液，离心（100 g，5 min），小心移除上清，加入10ml预热完全培养基，吹打重悬细胞用细胞计数板在显微镜下计算细胞数，取1*106细胞分装入新T75培养瓶，添加基至总体积为20ml，置于37 ℃、5 %CO2 培养箱中培养；每隔2～3天传代1次，实验用第2～3代细胞。

慢病毒包装实验流程介绍
慢病毒包装流程：
1、载体质粒与系统质粒共转染293T细胞。

2、收集48~72h的细胞上清液。

3、超速离心纯化浓缩。

4、纯化分装。

5、滴度检测。

慢病毒包装具体实验步骤如下：
一、质粒转染
1、转染前，依次准备好转染试剂、Opti-MEM培养基、目的质粒、骨架质粒、EP管。

2、然后，配置质粒和OMEM的混合液。

3、配置转染试剂和OMEM的混合液。

4、轻轻混匀，静置5min。

5、将配好的质粒与转染试剂混合后形成转染体系。

6、轻轻混匀，静置20min。

7、从培养箱中取出10cm培养皿，弃去培养液，更换为OMEM 培养液。

8、转染，轻轻混匀。

9、在培养皿盖上做好标记，放回培养箱继续培养。

10、转染后6-8h，更换为新鲜的DMEM培养基。

11、转染后次日，显微镜下观察转染效率。

12、转染后48h，收集上清液于干净的50ml离心管中。

13、加入新鲜的DMEM培养基，继续培养。

14、转染后72h，再次收集上清液。

二、浓缩纯化
1、将收集好的上清液离心，弃去细胞碎片。

2、用0.22μm滤膜过滤，分装到超速离心管中。

3、超速离心。

4、离心结束后，将所收获的病毒颗粒重新悬浮，于4℃冰箱中溶解，过夜。

5、次日，再次将溶解后的病毒过滤、分装、入库。

慢病毒包装、浓缩纯化及滴度测定一、试剂、耗材及仪器1.1试剂1.1.1 商品化试剂及试剂盒名称厂家货号Lenti-X 293T Cell Line clontech 632180 DMEM Gibco C11995500BT Fetal Bovine Serum, Qualified, Australia Origin Life Technologies 10099-141 Lipofectamine™LTX & Plus Reagent invitrogen 15338 QIAGEN Plasmid Midi Kit (25) QIAGEN 121431.1.2 试剂配制a. 氨苄青霉素储液称取氨苄青霉素10g，加8ml 超纯水，溶解，定容至10 ml，过滤除菌，分装，-20℃保存。

b. LB液体培养基称取蛋白胨（tryptone）10g、酵母提取物（yeast extract）5g、NaCl 10 g，加800 ml 超纯水，用10M NaOH调节pH至7.0，定容至1, 000 ml，分装，高压灭菌(121℃/20min)，4℃保存。

c. 完全培养基把DEME培养基与血清按照9:1(V/V)进行混合。

d. 50%PEG6000溶液称取125gPEG6000用超纯水溶解，定容到250ml，分装，高压灭菌(121℃/20min)，4℃保存。

e. 4M NaCl溶液称取46.752gNaCl，加超纯水溶解，定容到200ml，分装，高压灭菌(121℃/20min)，4℃保存。

f. PBS缓冲液称取8gNaCl，0.2gKCl，3.58gNa2HPO4.12H2O，0.27gKH2PO4，加800 ml 超纯水，调节pH至7.4，定容至1, 000 ml，分装，高压灭菌(121℃/20min)，4℃保存。

1.2 耗材名称厂家货号25cm2 Growth Area Flasks corning 430639 75cm2细胞培养瓶corning 430641 TC表面细胞培养皿，规格：35mm corning 430165 TC表面细胞培养皿，规格：60mm corning 430196 TC表面细胞培养皿，规格：100mm corning 430293 6孔细胞培养板corning 3516 外旋盖冻存管corning 430659 15ml尖底离心管corning 430790 50ml尖底离心管corning 4558 3毫升吸管Biologix 30-0138A11.3 仪器名称仪器厂家仪器型号二氧化碳培养箱Thermo 371生物安全柜Thermo Forma Class II，B2倒置荧光显微镜OLYMPUS IX71台式高速冷冻离心机Thermo LEGND MACH 1.6R小型高速离心机Thermo LEGEND MICRO 17小型冷冻高速离心机Thermo LEGEND MICRO 17R超低温冰箱SANYO MDF-U73V冰箱Haier BCD-290W二、方法2.1．包装细胞准备2.1.1.细胞复苏a. 把完全培养基预热至37℃；用清洗洁净的500ml烧杯盛300ml超纯水，然后放入37℃水浴锅中，预热至37℃（至少需30min）；准备好生物安全柜及所需培养耗材（灭菌处理）；b. 快速从液氮罐中取出装有冻存细胞的冻存管并放置于装有液氮的保温杯中，用洁净镊子取出冻存管，并立即放入上述准备好的水浴中（放入之前快速检查盖子是否拧紧，盖子切勿没入水中），用镊子镊好冻存管，快速沿着烧杯内壁转圈，细胞未冻融时切勿取出观察，细胞冻融时间一般为1-2 min，如果超过2 min仍未冻融，应掉弃该管细胞，细胞冻融后把冻存管放入70%酒精中3s，然后立即放入生物安全柜中；c. 把冻融的细胞立即转移至装有1ml预热完全培养基的15ml离心管中，混匀，立即加入4ml预热完全培养基，混匀；d. 加入5ml预热完全培养基，混匀，离心（100 g，5 min），小心移除上清；e. 加入6 ml预热完全培养基，吹打重悬细胞，然后把细胞悬液转移至T25培养瓶中，并放入二氧化碳培养箱（5% CO2, 37℃）中培养；f. 24小时观察细胞的贴壁情况，并根据细胞的密度进行换液或细胞传代；2.1.2细胞培养a. 当细胞达到80%融合时，移培养液，用PBS洗涤两次，加入1ml胰酶消化液，把培养皿置于倒置显微镜下观察，如大部分细胞变圆，立即移除胰酶消化液（如大部分细胞飘起，可不移除胰酶消化液），加入6ml 预热DMEM完全完全培养基，用吸管取培养液吹打瓶壁细胞，使其脱离瓶壁形成单细胞悬液，离心（100 g，5 min），小心移除上清，加入10ml预热完全培养基，吹打重悬细胞用细胞计数板在显微镜下计算细胞数，取1*106细胞分装入新T75培养瓶，添加基至总体积为20ml，置于37 ℃、5 %CO2 培养箱中培养；每隔2～3天传代1次，实验用第2～3代细胞。

慢病毒生产及使用操作手册一、实验流程制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 更换为完全培养基，培养48和72h后，分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，病毒上清液通过超离心浓缩病毒。

以下内容由汉恒生物科技（上海）有限公司精心整理总结。

二、实验材料（一）慢病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为三质粒系统，组成为pspax2, pMD2G,pHBLV TM系列质粒。

1、载体信息（见附录）2、细胞株 293T，慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM(含10% FBS)。

贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。

3、菌株大肠杆菌菌株DH5α。

用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。

三、包装细胞293T细胞的培养（一） 293T细胞的冻存随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降、突变等。

为了防止此类现象的出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。

在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。

1、去掉上清液，加入PBS洗去残留的培养基；2、加入0.25%的胰酶，消化1～2min后，镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，去除胰酶，加入新鲜培养基吹打混匀，移入离心管中。

3、细胞计数，将细胞全部晃下，加入 3mL 37 ℃预热的 10％ DMEM，用 10mL 移液管进行吹打，较大力吹打 6～8 次即可，不留死角，之后，将所有细胞吸出，置于15mL 离心管中，取 50ul 混匀后的细胞于 1.5mL eppendorf 管中，加入 450ul 10％ DMEM，即为 10 倍稀释，混匀，取 10ul 细胞于计数板中计数。

计数板上共 4 大格，每大格 16 小格。

计数时，4 大格均计数，总数除以 4（得每大格细胞数），再乘以 10（10 倍稀释），即为实际 n万/mL 细胞浓度。

4、细胞离心，1000rpm，5min。

慢病毒的浓缩与纯化P E G浓缩法
公司标准化编码 [QQX96QT-XQQB89Q8-NQQJ6Q8-MQM9N]
慢病毒的浓缩与纯化——PEG-8000浓缩法
实验试剂
1. NaCl
2. PEG8000
实验设备
1. 高压灭菌锅
2. μm滤头
3. 高速离心机
4. 低温冰箱
实验步骤
1. 5X PEG8000 NaCl配制称取NaCl g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q 纯水中；121摄氏度 30min 湿热灭绝 30min；保存在4℃。

2. 使用μm滤头过滤慢病毒上清液；
3. 每30ml过滤后的病毒初始液，加入5X PEG-8000 NaCl母液 ml；
4. 每20～30min混合一次，共进行3-5次；
5. 4度放置过夜；
6. 4度，4000 g，离心 20min；
7. 吸弃上清，静置管子1～2分钟，吸走残余液体；
8. 加入适量的慢病毒溶解液溶解慢病毒沉淀；
9. 集中后的病毒悬液分装成50 μl每份，保存在成品管中。

用碎干冰速冻后储存在-80 ℃。

慢病毒生产及使用操作手册一、实验流程制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒,三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 更换为完全培养基,培养48和72h后，分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液,病毒上清液通过超离心浓缩病毒。

以下内容由汉恒生物科技(上海）有限公司精心整理总结。

二、实验材料(一）慢病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为三质粒系统，组成为pspax2, pMD2G,pHBLV TM系列质粒.1、载体信息（见附录）2、细胞株 293T，慢病毒的包装细胞,为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM （含10% FBS).贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。

3、菌株大肠杆菌菌株DH5α。

用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。

三、包装细胞293T细胞的培养（一） 293T细胞的冻存随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降、突变等。

为了防止此类现象的出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。

在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。

1、去掉上清液，加入PBS洗去残留的培养基；2、加入0。

25％的胰酶，消化1~2min后，镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时,去除胰酶，加入新鲜培养基吹打混匀，移入离心管中.3、细胞计数，将细胞全部晃下,加入 3mL 37 ℃预热的 10％ DMEM，用 10mL 移液管进行吹打，较大力吹打 6～8 次即可，不留死角，之后，将所有细胞吸出,置于15mL 离心管中，取 50ul 混匀后的细胞于 1.5mL eppendorf 管中，加入 450ul 10% DMEM，即为 10 倍稀释，混匀，取 10ul 细胞于计数板中计数。

计数板上共 4 大格,每大格 16 小格。

计数时，4 大格均计数，总数除以 4（得每大格细胞数），再乘以 10（10 倍稀释）,即为实际 n万/mL 细胞浓度.4、细胞离心,1000rpm，5min。

YRGene慢病毒包装试剂盒（精简版）说明书产品编号：产品规格： 个 皿产品简介：赢润生物的慢病毒包装试剂盒包括如下成分：（ ）优化配比的慢病毒包装辅助质粒混合物，可兼容大多数慢病毒表达载体。

（ ）高效率的慢病毒浓缩液，无需超速离心，也不需要价格昂贵的过滤柱，快速富集病毒粒子，其优势在于操作安全简单，对设备要求低，产毒效率高，能够快速、高效地收获高滴度病毒。

产品组成：慢病毒包装步骤：转染前，传代 细胞于 培养皿中（例如，接种 × 细胞于 培养皿中，使用完全培养基 培养），当细胞密度能够达到 即可进行转染。

：培养基里面不要添加抗生素。

转染前 小时，更换培养基，加入 新鲜的完全培养基（ ），注意不要添加抗生素。

准备转染。

在 离心管中，分别配制 管与 管试剂（ ）配好后，放置 ，然后将 管缓慢加入 管，混合均匀。

室温放置 ，使得脂质体 混合物形成。

：混合后可能会出现淡淡的乳白状，不会影响转染。

然后将混合液逐滴均匀加入 培养皿，轻微混匀。

置于 ， 培养箱中培养过夜。

第三天，更换培养基，加入 的完全培养基，同样注意不要加抗生素。

转染后 后收取上清，转移至 离心管。

：上清里面含有病毒，请小心操作。

在 ℃离心 ，去除沉淀。

上清液用 μ 滤器过滤后转移到新的离心管中。

慢病毒浓缩：每 过滤后的病毒初始液，加入 ，每 混合一次，共进行 次。

℃放置过夜。

℃， ，离心 。

去掉上清，静置管子 ，吸走残余液体。

加入无血清 充分溶解慢病毒沉淀。

病毒悬液分装成 μ 每份 保存在离心管中，速冻后储存在 ℃。

慢病毒滴度测定：进行慢病毒感染实验之前，我们强烈建议您进行慢病毒滴度检测。

在滴定测定的前一天取 孔板，每孔接种 × 细胞。

加 到新鲜的完全培养基中，使其终浓度为 μ 。

加含有 的完全培养基 倍稀释病毒。

具体操作如下：取一个 离心管（或 孔板），加入 μ 培养基和 μ 待测病毒原液，混合均与后吸取 μ 病毒混合液至第二个离心管（或 孔板第二个孔），混合时尽量不要产生气泡，如此稀释至第八个孔（即稀释 倍）。

一、简介慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。

区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。

慢病毒载体的研究发展得很快,研究的也非常深入。

该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上,从而达到持久性表达.二、实验流程（大致的简单过程）慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。

慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。

为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体（自己构建）和包装质粒（购入）同时共转染细胞，在293T 细胞(购入)中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组,从而高水平的表达效应分子.大致的实验流程：1. 根据目的基因相关信息（序列,序列号等），构建含有外源基因或siRNA的重组载体；（即质粒构建，已构建好，质粒可以永久保存）2. 对于测序正确的重组质粒，提取和纯化高质量的不含内毒素的重组质粒；3. 使用高效重组载体和病毒包装质粒（购入）共转染293T 细胞[1]，进行病毒包装和生产，收集病毒液；4. 浓缩、纯化病毒液；5. 用高质量的病毒液感染细胞(293T细胞)；6。

通过定量PCR精确测定病毒滴度（高精确滴定方法）和Western 分析实验结果；7。

用高质量的病毒液感染宿主细胞；检测基因功能或者siRNA的沉默效率以及使用药物进行稳定转染细胞株的筛选，通常状况下，筛选的细胞克隆株具有长期的表达稳定性.病毒液足够用于一般的动物活体实验。

三、重组质粒构建流程1.基因的获得：shRNA寡核苷酸序列的设计和合成（将正确序列克隆入载体中,退火形成双链，PCR扩增）2。

回收A．酶切产物的胶回收：一般做50-100ul 体系,然后跑电泳回收，回收量一般为30ul. B．PCR扩增产物的胶回收原理：首先利用低熔点琼脂糖凝胶电泳DNA片段，分离目的条带DNA，然后紫外光下切割含目的DNA条带的胶块，利用胶回收试剂盒回收纯化DNA片段。

慢病毒包装实验的要点：1：良好的293FT细胞状态是转染成功的首要因素，细胞代数不宜超过30代；2：细胞铺板需均匀，避免细胞成团，影响转染效率；尽量多的细胞转入质粒，产生的病毒就越多；3：细胞换液和共转染时，动作要轻柔避免细胞漂浮。

尽量少的细胞死亡，产生的病毒就越多；实验前要准备的试剂、耗材和仪器；试剂准备：10%灭活胎牛血清+90%DMEM配好的完全培养基,0.25%胰酶，PBS,TRL 转染试剂，包装质粒，目的质粒，无血清培养基。

耗材准备：10cm细胞培养皿，6孔细胞培养板，吸头规格1ml、200ul、10ul，10ml移液管，离心管规格15ml、5ml、1.5ml，0.22um PVDF滤膜和10ml无菌注射器，试管架。

仪器准备：倒置荧光显微镜，普通光学倒置显微镜，电动移液器，吸引器，移液枪，二级生物安全柜，二氧化碳细胞培养箱。

第一天：上午（病毒包装质粒共转染前，293FT细胞复苏后至少让其传代两次以上，293FT 细胞能成倍的增长，确定细胞状态好）；实验前准备：安全柜开紫外灯照30分钟；把培养基和试剂放置常温；消化细胞：从37 5%的co2细胞培养箱拿出细胞状态良好的293FT细胞，吸出原培养基，加入PBS 1ml略洗之后吸出，加入1ml胰酶消化1-2min，轻轻拍打培养皿，再加入3ml新鲜培养基终止消化，将培养皿中的细胞转移至15ml离心管内离心1000r /5min,吸出上清液，加入10ml PBS吹打混匀后，离心1000r /5min, 吸出上清液。

细胞铺板：在10cm细胞培养皿上标记细胞名称、细胞代数、时间和操作人，将计数好大约2.5×106个293FT细胞吸入15ml离心管，再加入完全培养基至10ml充分混匀，然后把混匀的293FT细胞移入10cm培养皿）。

放置培养箱中培养48h。

插入铺板后图片刚铺板后铺板1天后第三天：上午细胞转染：细胞铺板48h后，从培养箱取出293FT细胞，倒置显微镜观察，细胞密度达90%左右；吸出原有培养基，沿皿壁缓慢加入8ml完全培养基，放置于培养箱中，待转染。

慢病毒包装的⽅法、步骤详细教程分享本⽂梳理了慢病毒包装的全部流程，并结合具体实例介绍了慢病毒包装的⽅法、步骤，并对包装过程中的关键点进⾏了细致的分析。

使初学者也能握毫⽆障碍地⾃主完成病毒包装、纯化、滴度测定等实验。

以293T细胞为例：慢病毒感染293T细胞 - 合肥知恩⽣物慢病毒感染293T细胞1.293T细胞分盘转染前⼀天，将已经长好的细胞以合适的⽐例传代到10cm培养⽫中，当细胞长到80%时准备转染，步骤如下：1）弃去培养液，加⼊5 mL 灭菌PBS溶液，轻轻晃动，洗涤细胞⽣长⾯，然后弃去 PBS 溶液。

2）⽤2 mL 胰蛋⽩酶消化对数⽣长期的293T细胞。

3）以含10%⾎清的培养基调整细胞密度为5 ×106个/10 mL，重新接种于10cm细胞培养⽫中，37 ℃，5% CO2 培养箱继续培养，转染前细胞密度80%左右。

注意：293T细胞的状态⾮常重要，⼀般建议购买新的细胞株后分批多次冻存，以保证每次包装病毒时细胞的代数不会超过10代。

同时尽量不要使⽤国产⾎清。

复苏后的细胞需要传2代后才能进⾏病毒的包装，并且传达后18-24h 需要密度达到80%左右。

2.转染前换液转染前1~2h 将需要转染的细胞换新鲜的培养基，8mL/10cm⽫。

注意：293T细胞贴壁性不是很好，换液时应⼩⼼滴加尽量避免冲起细胞。

3.转染（1）以⼀个10cm平⽫为例，取2个EP管，分别加⼊500 µl⽣理盐⽔，标记为A、B；（2）A管加⼊60µg PEI，并充分涡旋混匀，B管加⼊过表达质粒和两个辅助质粒pSPAX2、pMD2.G，三质粒⽐例为4：3：1，共24µg；（3）将A管PEI加⼊到B管中,轻轻混匀，静置20min；将混合液加⼊细胞中，过夜培养。

注意：质粒提取的质量，包括浓度和纯度。

浓度⾄少要超过500ng/ul，因为浓度低，加⼊的体积就会相应增⼤，会增加细胞污染的风险。

纯度可以使⽤核酸测定仪进⾏检测，260/280在1.8-2.0之间。

慢病毒包装试验慢病毒包装试验慢病毒（Lentivirus）载体是以 HIV1 （人类免疫缺陷 1 型病毒）为基础进展起来的基因治疗载体。

慢病毒具有感染谱广泛、可以有效感染分裂期和静止期细胞、长期稳定表达外源基因等优点，因此成为导入外源基因的有力工具。

现在慢病毒系统已经被广泛应用到各种细胞系的基因过表达、RNA 干扰、microRNA 讨论以及活体动物试验中。

一、试验流程图 1、慢病毒包装试验流程图二、试验仪器与试验材料psPAX2 质粒，pMD2.G 质粒，pHBLVTM系列质粒；293T 细胞；wan全培育基；DH5α 菌株；Stbl3 菌株。

三、试验步骤1. 质粒扩增。

将构建好的慢病毒载体和包装质粒使用大抽试剂盒进行质粒的去内毒素抽提，浓度建议不低于 1 μg/μl，A260/280 在 1.71.8 间方可用于病毒包装。

推举使用 Qiagen 大抽试剂盒进行质粒的大量去内毒素抽提（质粒质量会极大影响后续转染效率和病毒的滴度）。

2. 脂质体转染。

转染前一天，在10 cm皿中接种生长状态良好的293T细胞，以第二天汇合度能达到 30% ～ 50% 为宜。

24 h 后转染，转染前需要把 DMEM 和慢病毒包装专用转染试剂 LentiFitTM恢复至室温，使用前需摇匀。

每个皿的质粒成分如下：表 1、慢病毒包装转染体系用于包装的三个质粒摩尔比通常为 1:1:1，可以依据情况稍加调整。

请参考 LentiFitTM转染试剂说明书进行转染操作，转染后46 h 换新鲜培育基。

3. 病毒收集和离心。

转染后 48 h 和 72 h 分别两次收集病毒上清（48 h 收集后置换新鲜培液），将收集的上清用0.45 μm滤器过滤，然后放于超速离心管中，4 ℃，72000 g 离心 120 min。

4. 病毒重悬和保存。

弃上清，500 μl 重悬液重悬病毒沉淀，一周内使用则置于4 ℃ 保存，如需长时间存放需置于80 ℃ 或液氮罐保存。