年初级检验技师《微生物检验》讲义第章细菌形态学检查法
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细菌形态学检查法
细菌的形态学检查是细菌检验中极为重要的基本方法之一，包括不染色标本检查法和染色标本检查法镜检可以迅速了解标本中有无细菌及大致的菌量，根据细菌形态、结构和染色性有助于对病原菌的初步识别和分类，为进一步作生化反应、血清学鉴定提供依据。对临床早期诊断和治疗疾病有一定的参考意义。
一、显微镜
在细菌的形态学检查中以光学显微镜为常用，借助显微镜放大至1000倍左右可以观察到细菌的一般形态和结构，至于细菌内部的超微结构，则需经电子显微镜放大数万倍以上才能看清。检查细菌常用的显微镜有以下几种：
1.普通光学显微镜
普通光学显微镜通常以可见光为光源，显微镜的最大分辨率为波长的一半，即0.25μm，而肉眼所能看到的最小形象为0.2mm，故在普通光学显微镜下用油镜放大1000倍，一般细菌大于0.25μm，故用普通光学显微镜均能清楚看到。
2.暗视野显微镜
用特制的暗视野集光器代替普通光学显微镜上的明视野集光器，暗视野集光器的中央为不透光的遮光板，光线不能直接射入镜筒，从集光器四周边缘斜射到标本部位的光线，经菌体散射后而进入物镜。故在强光的照射下，在暗的背景中看到发亮的菌体，明暗反差提高了观察的效果，多用于检查不染色的活细菌和螺旋体的形态及运动观察。
3.相差显微镜
相差显微镜依据光波穿过标本中密度不同的部位时，引起光相差异的原理，利用相差板的光栅作用，将光相的差异转换成光的强度的差异，使细菌中的结构呈现明、暗对比。本法可用于检查细菌的内部结构。
由于细胞各部分的折射率和厚度的不同，光线通过这种标本时，直射光和衍射光的光程就会有差别。随着光程的增加或减少，加快或落后的光波的相位会发生改变（产生相位差）。光的相位差人的肉眼感觉不到，但相差显微镜能通过其特殊装置——环状光阑和相板，利用光的干涉现象，将光的相位差转变为人眼可以察觉的振幅差（明暗差），从而使原来透明的物体表现出明显的明暗差异，对比度增强，使我们能比较清楚的观察到普通光学显微镜和暗视野显微镜下都看不到或看不清的活细胞及细胞内的某些细微结构。
4.荧光显微镜
荧光显微镜以紫外光为光源，能激发荧光物质发光使之成为可见光。细菌经荧光色素染色后，置于荧光显微镜下，即可激发荧光，因此在暗色的背景下可以看到发射荧光的细菌。由于紫外光的波长较短（0.3～0.4μm），故分辨率得到进一步提高。荧光显微镜还广泛应用于免疫荧光技术中。
衣原体免疫荧光染色
双球菌免疫荧光染色
5.电子显微镜
以电子束为光源，其波长极短（0.005nm），分辨能力大大提高，电磁圈代替普通显微镜的光学放大系统，放大倍数可达数万至数十万倍，能分辨1nm的物体，细菌的表面形态和内部超微结构均能清楚地显现。
电子显微镜有透射电子显微镜和扫描电子显微镜。前者适于观察细菌内部的超微结构，后者适于对细菌表面结构及附件的观察。
二、不染色细菌标本的检查
主要用于检查生活状态下细菌的动力及运动状况。常用的方法有压滴法和悬滴法，用暗视野显微镜则效果更好。细菌如有动力。可看到细菌自一处移至另一处，有明显的方向性位移；细菌如无动力，受水分子撞击细菌呈现布朗运动，只在原地颤动而无位置的改变。
在临床上，有时通过不染色标本的动力检查可对某些病原菌作出初步鉴定。如疑似霍乱患者，取其水样便，制成悬滴标本，于暗视野下观察细菌动力，若见穿梭似流星状运动的细菌，同法重新制备另一标本并加入O1群霍乱弧菌诊断血清，如果原运动活泼的现象停止为制动试验阳性，可初步推断为“疑似O1群霍乱弧菌”。
三、细菌染色标本的检查
细菌染色标本在普通光学显微镜下可以观察细菌的形态、大小、排列、染色性、特殊结构（芽胞、荚膜、鞭毛）、异染颗粒等。
因为在接近中性的环境中细菌都带有负电荷，易与带正电荷的碱性染料结合，故常用碱性染料如亚甲蓝、结晶紫、碱性复红等染色细菌。
细菌标本经染色后，除能清楚看到细菌的形态、大小、排列方式外，还可根据染色反应将细菌进行分类，因此染色标本的检查在细菌的鉴定中应用最广，具非常重要的作用。
细菌染色的基本程序：涂片、干燥、固定→染色（媒染）→（脱色）→（复染）。
（一）常用染料
用于细菌染色的染料，本身能解离，解离后的染料可以与被染物结合生成盐类，使之着色。根据染料的带电情况，可将染料分为碱性和酸性两大类。此外，还有复合染料。
1.碱性染料
电离后显色离子带正电荷，易与带负电荷的被染物结合。由于细菌的等电点在pH2～5之间，在碱性、中性、弱酸性的环境中细菌均带负电荷，易与带正电荷的染料结合而着色。常用的碱性染料有碱性复红、结晶紫、亚甲蓝等。
2.酸性染料
电离后显色离子带负电荷，易与带正电荷的被染物结合。一般情况下细菌都带有负电荷故不易着色。如果降低菌液的pH使细菌带正电荷，则可被染色。酸性染料通常用来染细胞浆，而很少用于细菌的染色。常用的酸性染料有伊红、刚果红等。
3.复合染料（中性染料）及荧光染料复合染料
是碱性染料和酸性染料的复合物，如瑞氏染料（伊红亚甲蓝）、吉姆萨染料（伊红天青）等；荧光染料如荧光素标记的抗体。这些染色常用于某些特殊的染色技术中。
（二）常用的染色方法
在细菌感染标本的检查中，临床上常用的染色方法有革兰染色、抗酸染色和荧光染色。
1.单染色法
用一种染料将细菌和周围物体染成同一种颜色，称为单染色法。细菌经单染色法处理后，可观察其形态、排列、大小及简单的结构，但不能显示各种细菌染色性的差异。
2.复染色法
用两种或两种以上的染料染色的方法，称为复染色法或鉴别染色法。常用的有革兰染色法和抗酸染色法。
（1）革兰染色：本法是细菌学中最经典、最常用的染色方法。通过革兰染色将所有细菌分为（G+菌和G-菌）两大类，可初步识别细菌，缩小范围，有助于进一步鉴定。
革兰染色法示意
革兰染色除用以鉴定细菌外，病原菌革兰染色特性可为临床选择用药提供参考，帮助临床制订有针对性的治疗方案。因为G+菌与G-菌对一些抗生素表现出不同的敏感性，且其致病物质（前者产生外毒素而后者多产生内毒素）及其作用机制不同。
（2）抗酸染色：抗酸染色也可将细菌分为两大类：即抗酸性细菌和非抗酸性细菌。将有肺结核症状病人的痰标本，制成涂片后，作萋-纳染色镜检，根据所见结果即可报告“找到（未找到）抗酸菌”。对临床疾病的诊断和治疗具有重要参考价值。
（3）荧光染色：荧光染色法敏感性强，效率高而且容易观察结果，在临床细菌鉴定中有很大的实用价值。如痰标本涂片、固定，用荧光染料金胺O法（也称金胺O-罗丹明B法）染色，以荧光显微镜检查，在暗背景中可观察到呈金黄色荧光的菌球。
另外还有鞭毛染色、异染颗粒染色等。鞭毛染色后于显微镜下可观察到菌体上有无鞭毛、鞭毛的位置及数量，在细菌鉴定中，特别是非发酵菌的鉴定中很重要。疑为白喉棒状杆菌感染，进行涂片检查，除证实为革兰阳性典型棒状杆菌外，还须用异染颗粒染色法，镜检异染颗粒，方可初步报告“检出形似白喉棒状杆菌”，为临床早期诊断提供依据。
习题
检查细菌动力常用
A.压滴法
B.悬滴法
C.毛细管法
D.革兰染色法
E.抗酸染色法
『正确答案』B
『答案解析』检查细菌动力常用悬滴法。
习题
革兰染色脱色时所选用乙醇浓度为
A.50%
B.75%
C.85%
D.95%
E.100%
『正确答案』D
『答案解析』革兰染色脱色时所选用乙醇浓度为95%。
习题
细菌L型检查常用的染色方法为
A.荚膜染色法
B.芽胞染色法
C.细胞壁染色法
D.革兰染色法
E.抗酸染色法
『正确答案』C
『答案解析』细菌L型检查常用的染色方法为细胞壁染色法。
习题
观察细菌鞭毛、芽胞常用的染色法
A.墨汁染色法
B.吉姆萨染色法
C.特殊染色法
D.革兰染色法
E.抗酸染色法
『正确答案』C
『答案解析』观察细菌鞭毛、芽胞常用的染色法特殊染色法。
习题
观察细菌内部的超微结构需要采用
A.荧光显微镜
B.暗视野显微镜
C.电子显微镜
D.相差显微镜
E.普通光学显微镜
『正确答案』C
『答案解析』观察细菌内部的超微结构要采用电子显微镜。
习题
以紫外光为光源显微镜是
A.荧光显微镜
B.暗视野显微镜
C.电子显微镜
D.相差显微镜
E.普通光学显微镜
『正确答案』A
『答案解析』荧光显微镜是以紫外光为光源显微镜。
习题
分枝杆菌常用的染色方法为
A.荚膜染色法
B.芽胞染色法
C.细胞壁染色法
D.革兰染色法
E.抗酸染色法
『正确答案』E
『答案解析』分枝杆菌常用的染色方法为抗酸染色法。
细菌形态结构观察实验报告精品篇 生物学实验报告 报告题目培养基的制备与灭菌 姓名刘伟 学号055656565 指导教师:xxxxxx 学习中心培养基的制备与灭菌 一、目的要求 1. 掌握微生物实验室常用玻璃器皿的清洗及包扎方法。 2. 掌握培养基的配置原则和方法。 3. 掌握高压蒸汽灭菌的操作方法和注意事项。 二、基本原理 牛肉膏蛋白胨培养基： 是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。由于这种培养基中含有一般细胞生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供细菌生长繁殖之用。 高压蒸汽灭菌： 主要是通过升温使蛋白质变性从而达到杀死微生物的效果。将灭菌的物品放在一个密闭和加压的灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅内水沸腾而产生蒸汽。待蒸汽将锅内冷空气从排气阀中趋尽，关闭排气阀继续加热。此时蒸汽不溢出，压力增大，沸点升高，获得高于100℃的温度导致菌体蛋白凝固变性，而达到灭菌的目的。 三、实验材料 1. 药品：牛肉膏、蛋白胨、nacl、琼脂、1mol/l的naoh和hcl溶液。 2. 仪器及玻璃器皿：天平、高压蒸汽灭菌锅、移液管、试管、烧杯、量筒、三 角瓶、培养皿、玻璃漏斗等。 3. 其他物品：药匙、称量纸、ph试纸、记号笔、棉花等。 四、操作步骤 （一）玻璃器皿的洗涤和包装 1．玻璃器皿的洗涤 玻璃器皿在使用前必须洗刷干净。将三角瓶、试管、培养皿、量筒等浸入含有洗涤剂的水中．用毛刷刷洗，然后用自来水及蒸馏水冲净。移液管先用含有洗涤剂的水浸泡，再用自来水及蒸馏水冲洗。洗刷干净的玻璃器皿置于烘箱中烘干后备用。 2．灭菌前玻璃器皿的包装 （1）培养皿的包扎：培养皿由一盖一底组成一套，可用报纸将几套培养皿包 成一包，或者将几套培养皿直接置于特制的铁皮圆筒内，加盖灭菌。包装后的培养皿须经灭菌之后才能使用。 （2）移液管的包扎：在移液管的上端塞入一小段棉花(勿用脱脂棉)，它的作 用是避免外界及口中杂菌进入管内，并防止菌液等吸入口中。塞入此小段棉花应距管口约0.5cm左右，棉花自身长度约1~1.5cm。塞棉花时．可用一外围拉直的曲别针、将少许棉花塞入管口内。棉花要塞得松紧适宜，吹时以能通气而又不使棉花滑下为准。 先将报纸裁成宽约5cm左右的长纸条，然后将已塞好棉花的移液管尖端放在长条报纸的一端，约成45℃角，折叠纸条包住尖端，用左手握住移液管身，有手将移液管压紧．在桌面
细菌形态学检查法（二） 三、染色标本的检查细菌标本经染色后，不仅能清晰地看到细菌的形态、大小及排列方式，还可根据染色结果将细菌进行分类。染色标本与周围环境在颜色上形成鲜明对比，可在普通光学显微镜下进行观察。一般形态学检查均需染色。 （一）常用染料用于细菌染色的染料，大部分是人工合成的含苯环的有机化合物，在其苯环上带有色基和助色基。色基赋予化合物颜色，助色基可增加色基与被染物的亲和力。助色基有的为碱性（如一NH2），有的为酸性（如一0H），因此助色基的性质决定染料的酸碱性。常用染料一般均难溶于水，易溶于有机溶剂，实验室配制时通常制成盐类水溶液。 1?碱性染料常用的碱性染料有碱性亚甲蓝、结晶紫及碱性复红等，这些染料电离后色基带正电荷，易与带负电荷的被染物结合。多数细菌等电点（pl）在2?5 之间，在中性、碱性以及弱酸性环境中都带负电荷，易被碱性染料着色，故细菌学检查中常用此类染料。 2.酸性染料常用的有伊红、酸性复红及刚果红等，这些染料电离后色基带负电荷，不易与细菌结合，不常用于细菌染色。必要时可降低菌液的pH，使细菌带正电荷，方可着色。 3.中性染料是碱性染料与酸性染料的复合物，如瑞氏染液中的伊红亚甲蓝、吉姆萨染液中的伊红天青等，可用于较特殊染色技术。 （二）常用的细菌染色法根据所用染料是一种还是多种，细菌染色法分为单染色法和复染色法。单染色法是用一种染料染色，细菌涂片染成同一颜色，可观察到形态、大小及排列等特点，但不能显示细菌染色特性。复染色法是用两种或两种以上染料进行染色，将不同细菌或同一细菌的不同结构染成不同颜色。复染色法不仅可以观察细菌的形态结构，还可根据染色反应鉴别细菌，故又称鉴别染色法。临床常用的主要有革兰染色和抗酸染色。 革兰染色本法是细菌学检验中最经典、最常用的染色方法，沿用至今已有百余年历史，是一种包括初染、媒染、脱色和复染的鉴别染色技术。通过此染色法，可将细菌分为革兰阳性（G +）菌和革兰阴性（G —）菌两大类，并可初步识别细菌，缩小范围，有助于进一步鉴定。有时结台细菌特殊形态结构及排列方式，对病原茵可做出初步鉴定。革兰染色的原理至今尚未完全清楚，有以下几种学说：① 细胞壁学说：G+菌细胞壁结构较致密，肽聚糖层厚，脂质含量少，乙醇不易透入，G—菌细胞壁结构较疏松，肽聚糖层少，脂质含量多，乙醇易渗入；②等电 点学说：G+菌的等电点低（pl 2?3）, G—菌等电点较高（pl4?5），在相同pH 条件下，G+菌所带负电荷比G —菌多，与带正电荷的结晶紫染料结合较牢固且不易脱色；⑧化学学说：G+菌细胞内含有大量核糖核酸镁盐，可与结晶紫和碘牢固地结合成大分子复合物，不易被乙醇脱色，G —菌细胞内含极少量的核糖核酸镁盐，吸附染料量少，形成的复合物分子也较小，故易被乙醇脱色。目前认为，细胞壁结构与化学组成上的差异是染色反应不同的丰要原因。
细菌形态学检查法（一） 细菌形态学检查是细菌检验的重要方法之一，不仅可以为后续的进一步检验提供参考依据，更重要的是可以通过细菌形态学检查迅速了解标本中有无细菌及菌量的大致情况；对少数具有典型形态特征的细菌可以作出初步诊断，为临床选用抗菌药物治疗起到重要的提示作用。临床标本的细菌形态学检查方法主要包括染色标本和不染色标本的检查。 一、显微镜 细菌体积微小，必须借助显微镜放大后才能观察。细菌的一般形态结构可用光学显微镜观察，而细菌内部的超微结构则需用电子显微镜观察。 1．普通光学显微镜普通光学显微镜以可见光作为光源，波长0.4～0.7μm，最大分辨率0．2μm，约为波长的一半。人肉眼能分辨的最小距离是0．2mm，因此用油镜放大1000倍，0．2μm的微粒即被放大到肉眼可见的0．2mm。一般细菌都大于0．μm，故可用普通光学显微镜进行观察。 2．暗视野显微镜暗视野显微镜是在普通光学显微镜上装暗视野聚光器，使照明光线不直接进入物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，背景视野变暗，菌体发亮。观察时黑暗的背景中可见到发亮的菌体，明暗反差提高了观察效果，常用于不染色标本的动力及运动状况检查。 3．荧光显微镜荧光显微镜以高压汞灯作为光源，能发出280～600nm波长的光线，主要在365～435nm之间。根据使用荧光素的不同选择不同波长的光线作为激发光。因其波长比可见光短，故分辨率高于普通光学显微镜。细菌预先经相应的荧光素处理，然后置荧光显微镜下激发荧光，在暗色背景中可见到发荧光的菌体。用于观察细菌的结构及鉴别细菌。 4．相差显微镜相差显微镜是利用相差板的光栅作用，在普通光学显微镜基础上配制特殊相差板，采用特殊相差目镜制成。当光线透过标本时，标本不同部位因密度不同，引起光位相差异，相差板的光栅作用改变直射光的光位相和振幅，把光位相差异转为光强度差异，从而显示细菌不同部位的差异。多用于不染色活细菌的形态、内部结构及运动方式的观察。 5．电子显微镜电子显微镜以电子流代替光源，其波长与可见光相差几万倍，因而分辨能力得到极大提高，能分辨1am的微粒。目前使用的电子显微镜有透射电子显微镜(TEM)和扫描电子显微镜(SEM)两类。TEM可用于观察细菌、病毒的超微结构；SEM主要适合对细菌、病毒等表面结构及附件和三维立体图像的观察。电子显微镜观察须经特殊制片，无法观察活体微生物，因而在微生物学检验中不常使用。 二、不染色标本的检查
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果，常用于不染色标本的动力及运动状况检查。 3．荧光显微镜荧光显微镜以高压汞灯作为光源，能发出280～600nm波长的光线，主要在 365～435nm 之间。 根据使用荧光素的不同选择不同波长的光线作为激发光。 因其波长比可见光短，故分辨率高于普通光学显微镜。 细菌预先经相应的荧光素处理，然后置荧光显微镜下激发荧光，在暗色背景中可见到发荧光的菌体。 用于观察细菌的结构及鉴别细菌。 4．相差显微镜相差显微镜是利用相差板的光栅作用，在普通光学显微镜基础上配制特殊相差板，采用特殊相差目镜制成。 当光线透过标本时，标本不同部位因密度不同，引起光位相差异，相差板的光栅作用改变直射光的光位相和振幅，把光位相差异转为光强度差异，从而显示细菌不同部位的差异。 多用于不染色活细菌的形态、内部结构及运动方式的观察。 5．电子显微镜电子显微镜以电子流代替光源，其波长与可见光相差几万倍，因而分辨能力得到极大提高，能分辨 1am 的微粒。 目前使用的电子显微镜有透射电子显微镜(TEM)和扫描电子显微镜(SEM)两类。 TEM 可用于观察细菌、病毒的超微结构；SEM 主要适合对细菌、病毒等表面结构及附件和三维立体图像的观察。 电子显微镜观察须经特殊制片，无法观察活体微生物，因而在微生物学检验中不常使用。
【微生物检验】形态学检查对细菌鉴定的导航作用细菌鉴定的原则之一就是用最少的试验完成鉴定。细菌形态学检查是最基本、简单、快速的常规鉴定方法。细菌形态学包括细菌细胞形态学和细菌菌落形态学。细菌形态学正确描述依赖于方法、培养基、培养时间、染色试剂等，培养基和培养时间不同会影响细菌的形态。下面是yjbys 小编为大家带来的关于形态学检查对细菌鉴定的导航作用的知识，欢迎阅读。 1菌落特征观察 细菌在固体培养基表面生长形成菌落。对菌落进行描述应包括菌落大小(分大、中、小，以1mm 为界)、形状、高度、边缘、表面状态、密度(透明度)、硬度(用接种环刮取菌落时的感觉)、菌落内部结构、颜色、光泽以及与培养基表面的黏附程度，还应包括菌落的溶血、气味和色素产生情况等特性。观察菌落特征的目的是为了对细菌进行初步鉴定。有些特征是某些细菌所特有的，具有属或种的鉴别价值，如肺炎链球菌在绵羊血琼脂平板上的脐窝状菌落(如图1 所示)、伴放线凝集杆菌菌落特殊的内部结构(如图2 所示)、侵蚀艾肯菌的斗笠样菌落、斯氏假单胞菌皱纹样菌落、变形杆菌迁徙样菌落、铜绿假单胞菌的水溶性色素、紫色色杆菌的脂溶性色素(如图3 所示)、粘质沙雷菌的红色色素(如图4 所示)、产吲哚金黄杆菌产生的吲哚气味、嗜血杆菌产生的鼠穴气味、诺卡菌产生的腐土气味、厌氧菌产生的腐氨气味、荧光假单胞菌产生的黄色荧光素、某些厌氧菌可产生砖红色荧光素等。有些细菌产生色素受到气体的影响(粘质沙雷菌在厌氧环境下不产色)，有些细菌产生色素受到光线的影响(某些快速生长分枝杆菌是光产色或暗产色)。 对细菌菌落特征的观察和描述是细菌鉴定的第一步骤，其主要目的体现在以下几方面。
教学活动设计方案十二 学习情境四：微生物的鉴定总学时44学时 授课日期 1101班项目十二：形态学检查学时2学时1102班 教学要求教学 目标 能力目标： 1.知道对可疑培养物进行细菌形态学检查的方法及意义。 2.会做细菌不染色标本的检查：悬滴法、压滴法。 3.会做细菌染色标本的检查：革兰染色、抗酸染色。 4.会使用暗视野、明视野显微镜观察细菌动力。 知识目标： 1.明确细菌不染色标本检查的原理、方法、结果及意义。 2.明确革兰染色原理、方法、结果判断及意义。 3.明确抗酸染色原理、方法、结果判断及意义。 态度目标： 1.严格按照操作规程进行操作。 2.具有团队合作意识，培养分析问题及解决问题的能力。 3.具有高度的质量意识，养成良好的操作行为习惯。 4.对处理后的培养物妥善处理，注意生物安全。 重点 难点 1.针对可疑培养物选择形态检查方法。 2.暗视野显微镜的使用。 教学 资源 培养基、接种环、酒精灯、超净工作台、显微镜、各种细菌培养物、革兰染液、抗酸染液等 教学 环境 医学检验实训中心、一体化多媒体教室 教学 方法 问题导入、多媒体展示、现场教学、全程参与式教学 教学步骤问题导入： 问题1：尿液标本在血平板上长出圆形、光滑、湿润、灰白色略扁平的菌落，怎样进行后续检测呢？ 问题2：粪便标本在SS琼脂上长出无色小菌落，疑似志贺氏菌，用怎样一个简单的方
法大致判断呢？ 引入学习内容： 1.针对不同的可疑培养物选择正确的细菌形态检查方法,明确形态学检查在细菌鉴定中的意义。 2.运用革兰染色或抗酸染色检查细菌的形态。 3.用暗视野显微镜、明视野显微镜检查细菌动力。 教师多媒体授课 1.可疑培养物的细菌形态学检查方法： 【不染色标本】不染色标本检查法：压滴法、悬滴法、暗视野检查法；不染色标本检查的意义：主要用于检查细菌动力。 【染色标本】染色标本检查法有：革兰染色法、抗酸染色法、特殊染色法；染色标本检查的意义：主要是鉴别细菌 2. 不染色标本检查法的技术要点： 【材料准备】不染色标本检查法所用材料：洁净的玻片、盖玻片、凡士林、无菌生理盐水、酒精灯、接种环 【技术要点】1.标本新鲜 2.高倍镜观察 3.鉴别运动形式，正确判断结果 4.暗视野显微镜的使用要点 压滴法、悬滴法学生实训 1.将学生分成8组，每组4人。 2.发放各种疑似培养物标本。 3.进行疑似培养物的涂片染色镜检，并记录结果。 4.进行疑似培养物的动力观察，并记录结果。 5.在操作过程中可以相互探讨，及时纠正操作训练中出现的问题。 教师现场指导： 1.悬滴法和压滴法技能训练。 悬滴法、压滴法方法步骤；悬滴法、压滴法注意事项 2.运用革兰染色检查细菌形态。 革兰染色在形态学检查中的地位；染色关键步骤；染色方法类型与运用 学习效果评价
怀化医专《微生物学检验》教案编号:３
第八章细菌形态学检查 形态学检查的目的: ①从形态上识别细菌,为细菌分类与鉴别的基础; ②了解被检标本中有无细菌; ③直接从标本中观察到某些细菌,可对少数疾病初步诊断(如结核,脑膜炎等)。 第一节显微镜(mｉcroscopｅ) 一、普通光学显微镜 原理自然光的波长为0、4um;显微镜的最大分辨率为0.2um(前者的一半);肉眼的分辨率为0.2ｍm,故放大100０倍,使0.2um放大到０.2mm。 二、暗视野显微镜 用暗视野聚光器,使反光镜反射过来的光线不能进入镜筒,视野变暗, 线从暗视野聚光器周围斜射到菌体上,由于散射作用使菌体发光。 常用于活的微生物的动力检测。 三、相差显微镜 在检查不染色标本时,由于细菌的折光性与周围环境的折光性相近,对比不明显,瞧不清细菌及其内部结构,相差显微镜利用相差板的光栅作用,使光波穿过标本中密度不同的部位时,引起位相差,显出光的强度的明暗对比。 应用于活菌的形态及某些内部结构的观察。 四、荧光显微镜 以紫外光或蓝紫光作光源,因其波长比自然光短,故分辨率比普通显微镜要高。细菌经过荧光素染色后,在荧光显微镜下,由于菌体各种结构对荧光素的溶解、吸附情况不同,因此发出不同色调与亮度的荧光。 五、电子显微镜 以强大的电子流代替光源,因电子流的波长仅为０、００5nm,(仅为可见光源的几万分之一),故其放大倍数可达1０万-100万倍,可瞧清1nm的物体。
电镜种类 透射电镜:因电子的透射作用,可观察细菌,virus内部结构,通过荧屏显示。 扫描电镜:因电子流对物体的表面进行扫描,可清楚的显露出物体的三维空间的立体结构,可用于对细菌,virus的表面结构观察。 第二节不染色细菌标本检查法 仅用于细菌动力的观察。不能观察细菌的形态与结构特征。 1.压滴法明视野法、暗视野法。 2、悬滴法 3、毛细管法:孔径0、5-1.0mm,长约6０－70ｍm毛细管,以此管轻取细菌培养物,待液体进入后,两端火焰封融。用于厌氧菌的动力观察。 注意:区别细菌的运动与布朗运动。 第三节细菌染色标本的检查 适于观察细菌的形态与某些结构。 一、染料: 大多就是人工合成的含苯环或苯的有机物。 色基:即连接在苯环上带双键的有色化学基团,它使染料带颜色,其色基越多,颜色越深。如-NＯ2(硝基)＼-N＝N－(偶氮基) 助色基:不显色,它决定了染料与被染物之间的亲与性,且有酸、碱之分,决定了染料的酸碱性:-NH2(碱性) -OH(酸性) 常用染料种类: 1、碱性染料:美兰,结晶紫,碱性复红等,常以氯化物形式存在,色基带正电,易与带负电的被染物结合着色。由于细菌PI低(2～５),因此常带负电荷,易与该类染料结合。 2、酸性染料:伊红,酸性复红,刚果红,色基带负电。细菌带负电荷不易着色,常用于细胞浆染色,很少用于细菌染色。 ３、复合染料(中性染料):就是碱性染料与酸性染料的复合物,可与cell浆结合,如:伊红美兰、伊红天青。 4、单纯染料:多为偶氮化合物,亲与力低,不溶于水,而溶于脂溶剂。常用于脂肪
第十章细菌形态学检查法 本章考点： 1.显微镜 （1）普通光学显微镜 （2）暗视野显微镜 （3）相差显微镜 （4）荧光显微镜 （5）电子显微镜 2.不染色细菌标本检查法 3.细菌染色标本检查法 （1）常用染料 （2）常用染色方法 细菌的形态学检查包括不染色标本检查法和染色标本检查法，显微镜是观察细菌形态所必备的基本工具。 镜检不仅可以迅速了解标本中有无细菌及大致的菌量，而且根据细菌形态、结构和染色性有助于对病原菌的初步识别和分类，为进一步作生化反应、血清学鉴定提供依据。对某些细菌，如痰中的抗酸杆菌和脑脊液中的脑膜炎奈瑟菌等，通过形态学检查可得到初步诊断，对临床早期诊断和治疗疾病有一定的参考意义。 一、显微镜 在细菌的形态学检查中以光学显微镜为常用，借助显微镜放大至1000倍左右可以观察到细菌的一般形态和结构，至于细菌内部的超微结构，则需经电子显微镜放大数万倍以上才能看清。检查细菌常用的显微镜有以下几种： 1.普通光学显微镜：普通光学显微镜通常以自然光或灯光为光源，显微镜的最大分辨率为波长的一半，即0.25μm，而肉眼所能看到的最小形象为0.2mm，故在普通光学显微镜下用油镜放大1000倍，可将0.25μm 的微粒放大到0.25mm，肉眼便可以看清，一般细菌大于0.25μm，故用普通光学显微镜均能清楚看到。 2.暗视野显微镜：暗视野显微镜是用特制的暗视野集光器代替普通光学显微镜上的明视野集光器，由于暗视野集光器的中央为不透光的遮光板，光线不能直接射入镜筒，故背景视野黑暗无光，而从集光器四周边缘斜射到标本部位的光线，经菌体散射后而进入物镜。故在强光的照射下，可以在黑暗的背景中看到发亮的菌体，犹如夜空中的明亮星星。明暗反差提高了观察的效果，多用于检查不染色的活细菌和螺旋体的形态及运动观察。
年初级检验技师《微生物检验》讲义第章细菌形态学检查法
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细菌形态学检查法 细菌的形态学检查是细菌检验中极为重要的基本方法之一，包括不染色标本检查法和染色标本检查法镜检可以迅速了解标本中有无细菌及大致的菌量，根据细菌形态、结构和染色性有助于对病原菌的初步识别和分类，为进一步作生化反应、血清学鉴定提供依据。对临床早期诊断和治疗疾病有一定的参考意义。 一、显微镜 在细菌的形态学检查中以光学显微镜为常用，借助显微镜放大至1000倍左右可以观察到细菌的一般形态和结构，至于细菌内部的超微结构，则需经电子显微镜放大数万倍以上才能看清。检查细菌常用的显微镜有以下几种： 1.普通光学显微镜 普通光学显微镜通常以可见光为光源，显微镜的最大分辨率为波长的一半，即0.25μm，而肉眼所能看到的最小形象为0.2mm，故在普通光学显微镜下用油镜放大1000倍，一般细菌大于0.25μm，故用普通光学显微镜均能清楚看到。 2.暗视野显微镜 用特制的暗视野集光器代替普通光学显微镜上的明视野集光器，暗视野集光器的中央为不透光的遮光板，光线不能直接射入镜筒，从集光器四周边缘斜射到标本部位的光线，经菌体散射后而进入物镜。故在强光的照射下，在暗的背景中看到发亮的菌体，明暗反差提高了观察的效果，多用于检查不染色的活细菌和螺旋体的形态及运动观察。 3.相差显微镜 相差显微镜依据光波穿过标本中密度不同的部位时，引起光相差异的原理，利用相差板的光栅作用，将光相的差异转换成光的强度的差异，使细菌中的结构呈现明、暗对比。本法可用于检查细菌的内部结构。
怎样在显微镜中观看细菌 步骤:先在载玻片上滴加一滴生理盐水.把菌落用接种环挑起后,涂于生理盐水中央直径1CM左右要混匀——把载玻片放在酒精灯上加热烘干———滴加草酸铵结晶紫６０秒——水洗——革兰氏碘液６０Ｓ——９５％酒精脱色３０Ｓ——水洗——番红２分钟——干燥镜检。 最终目的是要在显微镜中看见清晰的细菌形状，所以在染色后脱色和水洗最重要，如脱色和水洗不净就会造成细菌和没洗净的颜色混在一起分不清。 革兰式染色及其原理:上面的就为革兰氏染色步骤，主要针对的是细菌的检验，因为它们极小。其他的如酵母菌等形状很大不用染色。 细菌之所以能被染色主要是和它的结构有关，而且有些能被染成蓝色，有些能染成红色，以此来分为革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌. 对于革兰氏阳性菌它们的细胞结构中脂类含量少，当用结晶紫染色后再用酒精脱色时，将脂类溶解抽提出来，使肽聚糖孔径变小通透性降低，结晶紫不易被抽提出来所以能保持蓝色。 对于革兰氏阴性菌它们的肽聚糖少而脂类多，所以酒精很容易把结晶紫染料提取出来，再经过第二次用番红复染时便染上了红色。 关于测定细菌的大小：细菌可以用测微尺测定。它包括目微尺和镜台微尺，目微尺无刻度镜台微尺有刻度。使用时先把镜台微尺放在镜台上用目微尺找到镜台微尺后使用换算把目微尺刻度进行标定，然后就可心测量细菌的大小了。 从显微镜中观察细菌是件很有意思的事情，在你没找到之前会着急，在找到后又会十分有惊喜感。你会感叹世界竟会有如此小的生命。 第一节细菌形态检查法 2009-06-03 19:56 细菌形态学是研究细菌的一个重要方面，了解细菌的形态和结构对研究细菌的生理活动、致病性和免疫性，以及鉴别细菌、诊断疾病和防治细菌性感染等均有重要的理论和实际意义。由于细菌个体微小，常以微米(μm)为测量单位，肉眼不能直接看到，必须借助显微镜放大后才能观察。根据不同的研究目的和要求，可分别选择普通光学显微镜、相差显微镜、暗视野显微镜、荧光显微镜和电子显微镜等。另外，由于细菌呈半透明状，要想更清楚地观察其大小和形态，需要进行染色。显微镜检查有不染色标本检查法和染色标本检查法两种。 一、不染色标本检查法 不染色标本主要用于检查活菌的动力及运动状况。细菌未染色时无色透明，在显微镜下主要靠细菌的折光率与周围环境的不同来进行观察。有鞭毛的细菌运动活泼，无鞭毛的细菌则呈不规则布朗运动。梅毒苍白密螺旋体、钩端螺旋体、弯曲杆菌等的活菌各有特征鲜明的形态和运动方式，具有诊断意义。常用方法有压滴法或悬滴法，置于普通光学显微镜或暗视野显微镜下观察。 1. 压滴法取菌液一滴，置于清洁载玻片中央，覆上盖玻片，于高倍镜下观察。
形态学检查对细菌鉴定的导航作用 细菌鉴定的原则之一就是用最少的试验完成鉴定。细菌形态学检查是最基本、简单、快速的常规鉴定方法。细菌形态学包括细菌细胞形态学和细菌菌落形态学。细菌形态学正确描述依赖于方法、培养基、培养时间、染色试剂等，培养基和培养时间不同会影响细菌的形态。观察细菌的典型形态，应该是将细菌接种在该细菌最适生长的培养基上、放入该细菌最适生长环境中（包括温度和所需气体条件）进行孵育，孵育时间应视细菌的生长速度而定，大部分常见的细菌以培养24h为宜，有些细菌需要更长时间的孵育才能显现出典型的菌落特征。有时为了鉴别某一种或某一类细菌，需要观察细菌在特殊的培养基（包括显色培养基）上或在特定环境下（气体、温度和光线等）培养的形态特征。 1、菌落特征观察 细菌在固体培养基表面生长形成菌落。对菌落进行描述应包括菌落大小（分大、中、小，以1mm为界）、形状、高度、边缘、表面状态、密度（透明度）、硬度（用接种环刮取菌落时的感觉）、菌落内部结构、颜色、光泽以及与培养基表面的黏附程度，还应包括菌落的溶血、气味和色素产生情况等特性。观察菌落特征的目的是为了对细菌进行初步鉴定。有些特征是某些细菌所特有的，具有属或种的鉴别价值，如肺炎链球菌在绵羊血琼脂平板上的脐窝状菌落（如图1所示）、伴放线凝集杆菌菌落特殊的内部结构（如图2所示）、侵蚀艾肯菌的斗笠样菌落、斯氏假单胞菌皱纹样菌落、变形杆菌迁徙样菌落、铜绿假单胞菌的水溶性色素、紫色色杆菌的脂溶性色素（如图3所示）、粘质沙雷菌的红色色素（如图4所示）、产吲哚金黄杆菌产生的吲哚气味、嗜血杆菌产生的鼠穴气味、诺卡菌产生的腐土气味、厌氧菌产生的腐氨气味、荧光假单胞菌产生的黄色荧光素、某些厌氧菌可产生砖红色荧光素等。有些细菌产生色素受到气体的影响（粘质沙雷菌在厌氧环境下不产色），有些细菌产生色素受到光线的影响（某些快速生长分枝杆菌是光产色或暗产色）。
怀化医专《微生物学检验》教案编号：3
第八章细菌形态学检查 形态学检查的目的： ①从形态上识别细菌，为细菌分类与鉴别的基础； ②了解被检标本中有无细菌； ③直接从标本中观察到某些细菌，可对少数疾病初步诊断（如结核，脑膜炎等）。 第一节显微镜（microscope） 一、普通光学显微镜 原理自然光的波长为0.4um；显微镜的最大分辨率为0.2um（前者的一半）；肉眼的分辨率为0.2mm，故放大1000倍，使0.2um放大到0.2mm。 二、暗视野显微镜 用暗视野聚光器，使反光镜反射过来的光线不能进入镜筒，视野变暗， 线从暗视野聚光器周围斜射到菌体上，由于散射作用使菌体发光。 常用于活的微生物的动力检测。 三、相差显微镜 在检查不染色标本时，由于细菌的折光性与周围环境的折光性相近，对比不明显，看不清细菌及其内部结构，相差显微镜利用相差板的光栅作用，使光波穿过标本中密度不同的部位时，引起位相差，显出光的强度的明暗对比。 应用于活菌的形态及某些内部结构的观察。 四、荧光显微镜 以紫外光或蓝紫光作光源，因其波长比自然光短，故分辨率比普通显微镜要高。细菌经过荧光素染色后，在荧光显微镜下，由于菌体各种结构对荧光素的溶解、吸附情况不同，因此发出不同色调和亮度的荧光。 五、电子显微镜 以强大的电子流代替光源，因电子流的波长仅为0.005nm，（仅为可见光源的几万分之一），故其放大倍数可达10万-100万倍，可看清1nm的物体。电镜种类 透射电镜：因电子的透射作用，可观察细菌，virus内部结构，通过荧屏显
示。 扫描电镜：因电子流对物体的表面进行扫描，可清楚的显露出物体的三维空间的立体结构，可用于对细菌，virus的表面结构观察。 第二节不染色细菌标本检查法 仅用于细菌动力的观察。不能观察细菌的形态和结构特征。 1.压滴法明视野法、暗视野法。 2.悬滴法 3.毛细管法：孔径0.5-1.0mm，长约60-70mm毛细管，以此管轻取细菌培养物，待液体进入后，两端火焰封融。用于厌氧菌的动力观察。 注意：区别细菌的运动与布朗运动。 第三节细菌染色标本的检查 适于观察细菌的形态和某些结构。 一、染料： 大多是人工合成的含苯环或苯的有机物。 色基：即连接在苯环上带双键的有色化学基团，它使染料带颜色，其色基越多，颜色越深。如-NO2(硝基）\ -N=N-（偶氮基） 助色基：不显色，它决定了染料与被染物之间的亲和性，且有酸、碱之分，决定了染料的酸碱性：-NH2（碱性）-OH （酸性） 常用染料种类： 1、碱性染料：美兰，结晶紫，碱性复红等，常以氯化物形式存在，色基带正电，易与带负电的被染物结合着色。由于细菌PI低（2～5），因此常带负电荷，易与该类染料结合。 2、酸性染料：伊红，酸性复红，刚果红，色基带负电。细菌带负电荷不易着色，常用于细胞浆染色，很少用于细菌染色。 3、复合染料（中性染料）：是碱性染料和酸性染料的复合物，可与cell浆结合，如：伊红美兰、伊红天青。 4、单纯染料：多为偶氮化合物，亲和力低，不溶于水，而溶于脂溶剂。常用于脂肪组织染色，如：苏丹染料。