怀化医专《微生物学检验》教案编号：3
第八章细菌形态学检查
形态学检查的目的：
①从形态上识别细菌，为细菌分类与鉴别的基础；
②了解被检标本中有无细菌；
③直接从标本中观察到某些细菌，可对少数疾病初步诊断（如结核，脑膜炎等）。
第一节显微镜（microscope）
一、普通光学显微镜
原理自然光的波长为0.4um；显微镜的最大分辨率为0.2um（前者的一半）；肉眼的分辨率为0.2mm，故放大1000倍，使0.2um放大到0.2mm。
二、暗视野显微镜
用暗视野聚光器，使反光镜反射过来的光线不能进入镜筒，视野变暗，
线从暗视野聚光器周围斜射到菌体上，由于散射作用使菌体发光。
常用于活的微生物的动力检测。
三、相差显微镜
在检查不染色标本时，由于细菌的折光性与周围环境的折光性相近，对比不明显，看不清细菌及其内部结构，相差显微镜利用相差板的光栅作用，使光波穿过标本中密度不同的部位时，引起位相差，显出光的强度的明暗对比。
应用于活菌的形态及某些内部结构的观察。
四、荧光显微镜
以紫外光或蓝紫光作光源，因其波长比自然光短，故分辨率比普通显微镜要高。细菌经过荧光素染色后，在荧光显微镜下，由于菌体各种结构对荧光素的溶解、吸附情况不同，因此发出不同色调和亮度的荧光。
五、电子显微镜
以强大的电子流代替光源，因电子流的波长仅为0.005nm，（仅为可见光源的几万分之一），故其放大倍数可达10万-100万倍，可看清1nm的物体。电镜种类
透射电镜：因电子的透射作用，可观察细菌，virus内部结构，通过荧屏显
示。
扫描电镜：因电子流对物体的表面进行扫描，可清楚的显露出物体的三维空间的立体结构，可用于对细菌，virus的表面结构观察。
第二节不染色细菌标本检查法
仅用于细菌动力的观察。不能观察细菌的形态和结构特征。
1.压滴法明视野法、暗视野法。
2.悬滴法
3.毛细管法：孔径0.5-1.0mm，长约60-70mm毛细管，以此管轻取细菌培养物，待液体进入后，两端火焰封融。用于厌氧菌的动力观察。
注意：区别细菌的运动与布朗运动。
第三节细菌染色标本的检查
适于观察细菌的形态和某些结构。
一、染料：
大多是人工合成的含苯环或苯的有机物。
色基：即连接在苯环上带双键的有色化学基团，它使染料带颜色，其色基越多，颜色越深。如-NO2(硝基）\ -N=N-（偶氮基）
助色基：不显色，它决定了染料与被染物之间的亲和性，且有酸、碱之分，决定了染料的酸碱性：-NH2（碱性）-OH （酸性）
常用染料种类：
1、碱性染料：美兰，结晶紫，碱性复红等，常以氯化物形式存在，色基带正电，易与带负电的被染物结合着色。由于细菌PI低（2～5），因此常带负电荷，易与该类染料结合。
2、酸性染料：伊红，酸性复红，刚果红，色基带负电。细菌带负电荷不易着色，常用于细胞浆染色，很少用于细菌染色。
3、复合染料（中性染料）：是碱性染料和酸性染料的复合物，可与cell浆结合，如：伊红美兰、伊红天青。
4、单纯染料：多为偶氮化合物，亲和力低，不溶于水，而溶于脂溶剂。常用于脂肪组织染色，如：苏丹染料。
二、染色程序：
基本步骤：涂片（干燥）→固定→染色（初染、煤染、脱色、复染）
1、涂片制备：
液体标本（细菌培养液）直接涂于玻片上；
固体培养基上的培养物，取生理盐水涂片，涂成蚕豆大小的菌膜。
2、固定：
目的：①杀死细菌，使蛋白质凝固，易于着色；
②改变其通透性，利于染料进入；
③使菌体附着在玻片上；
④保持细菌原有的形态、结构。
方法：常用的火焰加热固定法，其它有：冷冻干燥法，化学干燥法。
3、染色：
（1）初染
（2）媒染
目的：加固初染——增加染料与被染物的亲和力、使染料固定于被染物、使细胞膜通透性改变。
媒染剂：石炭酸，碘液，明矾，酚等，也可用加热法。
（3）脱色
目的：使不该染上颜色的部分脱下颜色。
脱色剂：凡能使已经着色的被染物脱去颜色的化学试剂。酸（为碱的脱色剂），碱（为酸的脱色剂），还有甲醇，乙醇等，无机酸脱色能力强于有机酸，醇类中分子量小的强于分子量大的。
脱色机制：有的起溶媒作用（如醇类），有的影响蛋白质的电离程度，改变其电荷的性质或数量，从而影响细菌与染料结合的程度（如酸碱）。
（4）复染（对比染色）
常用染料：稀释复红、沙黄（与紫色对比）、美兰、苦味液（与红色对比）
三、常用的染色法
（一）单染法：
用一种染料染，细菌及周围部分都染成同一种颜色主要用于观察细菌的形
态、大小、排列及简单的结构，如美兰染色，复红染色。
（二）复染法：
用两种以上的染料，将不同的细菌或同一细菌的不同结构染成不同的颜色。可用于细菌的鉴别。常用的有——
1. 革兰染色法（Gram stain):
由丹麦细菌学家Christain Gram首创，已有100多年的历史。
染料：结晶紫、卢戈氏碘液、95%酒精、稀释石炭酸复红。
原理：
（1）等电点学说：革兰阳性菌ph2-3,低于革兰阴性菌ph4-5。与带正电荷的染料结合牢固。
（2）化学学说：革兰阳性菌含大量核糖核酸镁盐，与结晶紫和碘结合成大分子复合物而不易被脱色。
（3）通透性学说：革兰阳性菌cell wall因肽聚糖厚，脂类少，通透性低，酒精不易进入脱色，相反革兰阴性菌肽聚糖少，含脂多，易被酒精溶解，使cell wall通透性升高。
方法：略（实验课介绍）
结果：G+菌：紫色；G-菌：红色
意义：（1）鉴别细菌；（2）选择药物参考；（3）与致病性有关。
2. 抗酸染色（acid-fast stain）
原理：分枝杆菌一般不易着色，若用5%石炭酸复红加温并延长染色时间，可染上红色，又因其菌体中含有分枝菌酸，可抵抗3%盐酸酒精的脱色，仍保持红色，故称为抗酸菌。
方法：涂片、干燥、固定→石炭酸复红（初染）加热至冒蒸汽5min →
盐酸酒精脱色→碱性美兰（复染）1min
结果、意义：
3、特殊染色法
（1）细胞壁染色：
染液：10％鞣酸溶液、0.5％结晶紫溶液
方法：涂片自然干燥→鞣酸染15min，水洗→结晶紫染3~5min，水洗→待干，镜检。
结果：细胞壁（细菌的周边）染成紫色，内部无色；
无细胞壁的细菌（L型菌）整个菌体染成紫色。
（2）其它：鞭毛染色法、芽胞染色法、荚膜染色法、异染颗粒染色法
4.负染色法
将标本的背景染色而细菌不着色。如：墨汁、酸性染料（如刚果红、水溶性苯胺黑等），也可用墨汁染色结合单染色法（如美蓝）检查细菌的荚膜，黑色背景中，蓝色菌体外为无色的荚膜。
细菌形态学检查法（二） 三、染色标本的检查细菌标本经染色后，不仅能清晰地看到细菌的形态、大小及排列方式，还可根据染色结果将细菌进行分类。染色标本与周围环境在颜色上形成鲜明对比，可在普通光学显微镜下进行观察。一般形态学检查均需染色。 （一）常用染料用于细菌染色的染料，大部分是人工合成的含苯环的有机化合物，在其苯环上带有色基和助色基。色基赋予化合物颜色，助色基可增加色基与被染物的亲和力。助色基有的为碱性（如一NH2），有的为酸性（如一0H），因此助色基的性质决定染料的酸碱性。常用染料一般均难溶于水，易溶于有机溶剂，实验室配制时通常制成盐类水溶液。 1?碱性染料常用的碱性染料有碱性亚甲蓝、结晶紫及碱性复红等，这些染料电离后色基带正电荷，易与带负电荷的被染物结合。多数细菌等电点（pl）在2?5 之间，在中性、碱性以及弱酸性环境中都带负电荷，易被碱性染料着色，故细菌学检查中常用此类染料。 2.酸性染料常用的有伊红、酸性复红及刚果红等，这些染料电离后色基带负电荷，不易与细菌结合，不常用于细菌染色。必要时可降低菌液的pH，使细菌带正电荷，方可着色。 3.中性染料是碱性染料与酸性染料的复合物，如瑞氏染液中的伊红亚甲蓝、吉姆萨染液中的伊红天青等，可用于较特殊染色技术。 （二）常用的细菌染色法根据所用染料是一种还是多种，细菌染色法分为单染色法和复染色法。单染色法是用一种染料染色，细菌涂片染成同一颜色，可观察到形态、大小及排列等特点，但不能显示细菌染色特性。复染色法是用两种或两种以上染料进行染色，将不同细菌或同一细菌的不同结构染成不同颜色。复染色法不仅可以观察细菌的形态结构，还可根据染色反应鉴别细菌，故又称鉴别染色法。临床常用的主要有革兰染色和抗酸染色。 革兰染色本法是细菌学检验中最经典、最常用的染色方法，沿用至今已有百余年历史，是一种包括初染、媒染、脱色和复染的鉴别染色技术。通过此染色法，可将细菌分为革兰阳性（G +）菌和革兰阴性（G —）菌两大类，并可初步识别细菌，缩小范围，有助于进一步鉴定。有时结台细菌特殊形态结构及排列方式，对病原茵可做出初步鉴定。革兰染色的原理至今尚未完全清楚，有以下几种学说：① 细胞壁学说：G+菌细胞壁结构较致密，肽聚糖层厚，脂质含量少，乙醇不易透入，G—菌细胞壁结构较疏松，肽聚糖层少，脂质含量多，乙醇易渗入；②等电 点学说：G+菌的等电点低（pl 2?3）, G—菌等电点较高（pl4?5），在相同pH 条件下，G+菌所带负电荷比G —菌多，与带正电荷的结晶紫染料结合较牢固且不易脱色；⑧化学学说：G+菌细胞内含有大量核糖核酸镁盐，可与结晶紫和碘牢固地结合成大分子复合物，不易被乙醇脱色，G —菌细胞内含极少量的核糖核酸镁盐，吸附染料量少，形成的复合物分子也较小，故易被乙醇脱色。目前认为，细胞壁结构与化学组成上的差异是染色反应不同的丰要原因。
细菌形态学检查法（一） 细菌形态学检查是细菌检验的重要方法之一，不仅可以为后续的进一步检验提供参考依据，更重要的是可以通过细菌形态学检查迅速了解标本中有无细菌及菌量的大致情况；对少数具有典型形态特征的细菌可以作出初步诊断，为临床选用抗菌药物治疗起到重要的提示作用。临床标本的细菌形态学检查方法主要包括染色标本和不染色标本的检查。 一、显微镜 细菌体积微小，必须借助显微镜放大后才能观察。细菌的一般形态结构可用光学显微镜观察，而细菌内部的超微结构则需用电子显微镜观察。 1．普通光学显微镜普通光学显微镜以可见光作为光源，波长0.4～0.7μm，最大分辨率0．2μm，约为波长的一半。人肉眼能分辨的最小距离是0．2mm，因此用油镜放大1000倍，0．2μm的微粒即被放大到肉眼可见的0．2mm。一般细菌都大于0．μm，故可用普通光学显微镜进行观察。 2．暗视野显微镜暗视野显微镜是在普通光学显微镜上装暗视野聚光器，使照明光线不直接进入物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，背景视野变暗，菌体发亮。观察时黑暗的背景中可见到发亮的菌体，明暗反差提高了观察效果，常用于不染色标本的动力及运动状况检查。 3．荧光显微镜荧光显微镜以高压汞灯作为光源，能发出280～600nm波长的光线，主要在365～435nm之间。根据使用荧光素的不同选择不同波长的光线作为激发光。因其波长比可见光短，故分辨率高于普通光学显微镜。细菌预先经相应的荧光素处理，然后置荧光显微镜下激发荧光，在暗色背景中可见到发荧光的菌体。用于观察细菌的结构及鉴别细菌。 4．相差显微镜相差显微镜是利用相差板的光栅作用，在普通光学显微镜基础上配制特殊相差板，采用特殊相差目镜制成。当光线透过标本时，标本不同部位因密度不同，引起光位相差异，相差板的光栅作用改变直射光的光位相和振幅，把光位相差异转为光强度差异，从而显示细菌不同部位的差异。多用于不染色活细菌的形态、内部结构及运动方式的观察。 5．电子显微镜电子显微镜以电子流代替光源，其波长与可见光相差几万倍，因而分辨能力得到极大提高，能分辨1am的微粒。目前使用的电子显微镜有透射电子显微镜(TEM)和扫描电子显微镜(SEM)两类。TEM可用于观察细菌、病毒的超微结构；SEM主要适合对细菌、病毒等表面结构及附件和三维立体图像的观察。电子显微镜观察须经特殊制片，无法观察活体微生物，因而在微生物学检验中不常使用。 二、不染色标本的检查
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果，常用于不染色标本的动力及运动状况检查。 3．荧光显微镜荧光显微镜以高压汞灯作为光源，能发出280～600nm波长的光线，主要在 365～435nm 之间。 根据使用荧光素的不同选择不同波长的光线作为激发光。 因其波长比可见光短，故分辨率高于普通光学显微镜。 细菌预先经相应的荧光素处理，然后置荧光显微镜下激发荧光，在暗色背景中可见到发荧光的菌体。 用于观察细菌的结构及鉴别细菌。 4．相差显微镜相差显微镜是利用相差板的光栅作用，在普通光学显微镜基础上配制特殊相差板，采用特殊相差目镜制成。 当光线透过标本时，标本不同部位因密度不同，引起光位相差异，相差板的光栅作用改变直射光的光位相和振幅，把光位相差异转为光强度差异，从而显示细菌不同部位的差异。 多用于不染色活细菌的形态、内部结构及运动方式的观察。 5．电子显微镜电子显微镜以电子流代替光源，其波长与可见光相差几万倍，因而分辨能力得到极大提高，能分辨 1am 的微粒。 目前使用的电子显微镜有透射电子显微镜(TEM)和扫描电子显微镜(SEM)两类。 TEM 可用于观察细菌、病毒的超微结构；SEM 主要适合对细菌、病毒等表面结构及附件和三维立体图像的观察。 电子显微镜观察须经特殊制片，无法观察活体微生物，因而在微生物学检验中不常使用。
教学活动设计方案十二 学习情境四：微生物的鉴定总学时44学时 授课日期 1101班项目十二：形态学检查学时2学时1102班 教学要求教学 目标 能力目标： 1.知道对可疑培养物进行细菌形态学检查的方法及意义。 2.会做细菌不染色标本的检查：悬滴法、压滴法。 3.会做细菌染色标本的检查：革兰染色、抗酸染色。 4.会使用暗视野、明视野显微镜观察细菌动力。 知识目标： 1.明确细菌不染色标本检查的原理、方法、结果及意义。 2.明确革兰染色原理、方法、结果判断及意义。 3.明确抗酸染色原理、方法、结果判断及意义。 态度目标： 1.严格按照操作规程进行操作。 2.具有团队合作意识，培养分析问题及解决问题的能力。 3.具有高度的质量意识，养成良好的操作行为习惯。 4.对处理后的培养物妥善处理，注意生物安全。 重点 难点 1.针对可疑培养物选择形态检查方法。 2.暗视野显微镜的使用。 教学 资源 培养基、接种环、酒精灯、超净工作台、显微镜、各种细菌培养物、革兰染液、抗酸染液等 教学 环境 医学检验实训中心、一体化多媒体教室 教学 方法 问题导入、多媒体展示、现场教学、全程参与式教学 教学步骤问题导入： 问题1：尿液标本在血平板上长出圆形、光滑、湿润、灰白色略扁平的菌落，怎样进行后续检测呢？ 问题2：粪便标本在SS琼脂上长出无色小菌落，疑似志贺氏菌，用怎样一个简单的方
法大致判断呢？ 引入学习内容： 1.针对不同的可疑培养物选择正确的细菌形态检查方法,明确形态学检查在细菌鉴定中的意义。 2.运用革兰染色或抗酸染色检查细菌的形态。 3.用暗视野显微镜、明视野显微镜检查细菌动力。 教师多媒体授课 1.可疑培养物的细菌形态学检查方法： 【不染色标本】不染色标本检查法：压滴法、悬滴法、暗视野检查法；不染色标本检查的意义：主要用于检查细菌动力。 【染色标本】染色标本检查法有：革兰染色法、抗酸染色法、特殊染色法；染色标本检查的意义：主要是鉴别细菌 2. 不染色标本检查法的技术要点： 【材料准备】不染色标本检查法所用材料：洁净的玻片、盖玻片、凡士林、无菌生理盐水、酒精灯、接种环 【技术要点】1.标本新鲜 2.高倍镜观察 3.鉴别运动形式，正确判断结果 4.暗视野显微镜的使用要点 压滴法、悬滴法学生实训 1.将学生分成8组，每组4人。 2.发放各种疑似培养物标本。 3.进行疑似培养物的涂片染色镜检，并记录结果。 4.进行疑似培养物的动力观察，并记录结果。 5.在操作过程中可以相互探讨，及时纠正操作训练中出现的问题。 教师现场指导： 1.悬滴法和压滴法技能训练。 悬滴法、压滴法方法步骤；悬滴法、压滴法注意事项 2.运用革兰染色检查细菌形态。 革兰染色在形态学检查中的地位；染色关键步骤；染色方法类型与运用 学习效果评价
怀化医专《微生物学检验》教案编号:３
第八章细菌形态学检查 形态学检查的目的: ①从形态上识别细菌,为细菌分类与鉴别的基础; ②了解被检标本中有无细菌; ③直接从标本中观察到某些细菌,可对少数疾病初步诊断(如结核,脑膜炎等)。 第一节显微镜(mｉcroscopｅ) 一、普通光学显微镜 原理自然光的波长为0、4um;显微镜的最大分辨率为0.2um(前者的一半);肉眼的分辨率为0.2ｍm,故放大100０倍,使0.2um放大到０.2mm。 二、暗视野显微镜 用暗视野聚光器,使反光镜反射过来的光线不能进入镜筒,视野变暗, 线从暗视野聚光器周围斜射到菌体上,由于散射作用使菌体发光。 常用于活的微生物的动力检测。 三、相差显微镜 在检查不染色标本时,由于细菌的折光性与周围环境的折光性相近,对比不明显,瞧不清细菌及其内部结构,相差显微镜利用相差板的光栅作用,使光波穿过标本中密度不同的部位时,引起位相差,显出光的强度的明暗对比。 应用于活菌的形态及某些内部结构的观察。 四、荧光显微镜 以紫外光或蓝紫光作光源,因其波长比自然光短,故分辨率比普通显微镜要高。细菌经过荧光素染色后,在荧光显微镜下,由于菌体各种结构对荧光素的溶解、吸附情况不同,因此发出不同色调与亮度的荧光。 五、电子显微镜 以强大的电子流代替光源,因电子流的波长仅为０、００5nm,(仅为可见光源的几万分之一),故其放大倍数可达1０万-100万倍,可瞧清1nm的物体。
电镜种类 透射电镜:因电子的透射作用,可观察细菌,virus内部结构,通过荧屏显示。 扫描电镜:因电子流对物体的表面进行扫描,可清楚的显露出物体的三维空间的立体结构,可用于对细菌,virus的表面结构观察。 第二节不染色细菌标本检查法 仅用于细菌动力的观察。不能观察细菌的形态与结构特征。 1.压滴法明视野法、暗视野法。 2、悬滴法 3、毛细管法:孔径0、5-1.0mm,长约6０－70ｍm毛细管,以此管轻取细菌培养物,待液体进入后,两端火焰封融。用于厌氧菌的动力观察。 注意:区别细菌的运动与布朗运动。 第三节细菌染色标本的检查 适于观察细菌的形态与某些结构。 一、染料: 大多就是人工合成的含苯环或苯的有机物。 色基:即连接在苯环上带双键的有色化学基团,它使染料带颜色,其色基越多,颜色越深。如-NＯ2(硝基)＼-N＝N－(偶氮基) 助色基:不显色,它决定了染料与被染物之间的亲与性,且有酸、碱之分,决定了染料的酸碱性:-NH2(碱性) -OH(酸性) 常用染料种类: 1、碱性染料:美兰,结晶紫,碱性复红等,常以氯化物形式存在,色基带正电,易与带负电的被染物结合着色。由于细菌PI低(2～５),因此常带负电荷,易与该类染料结合。 2、酸性染料:伊红,酸性复红,刚果红,色基带负电。细菌带负电荷不易着色,常用于细胞浆染色,很少用于细菌染色。 ３、复合染料(中性染料):就是碱性染料与酸性染料的复合物,可与cell浆结合,如:伊红美兰、伊红天青。 4、单纯染料:多为偶氮化合物,亲与力低,不溶于水,而溶于脂溶剂。常用于脂肪
第十章细菌形态学检查法 本章考点： 1.显微镜 （1）普通光学显微镜 （2）暗视野显微镜 （3）相差显微镜 （4）荧光显微镜 （5）电子显微镜 2.不染色细菌标本检查法 3.细菌染色标本检查法 （1）常用染料 （2）常用染色方法 细菌的形态学检查包括不染色标本检查法和染色标本检查法，显微镜是观察细菌形态所必备的基本工具。 镜检不仅可以迅速了解标本中有无细菌及大致的菌量，而且根据细菌形态、结构和染色性有助于对病原菌的初步识别和分类，为进一步作生化反应、血清学鉴定提供依据。对某些细菌，如痰中的抗酸杆菌和脑脊液中的脑膜炎奈瑟菌等，通过形态学检查可得到初步诊断，对临床早期诊断和治疗疾病有一定的参考意义。 一、显微镜 在细菌的形态学检查中以光学显微镜为常用，借助显微镜放大至1000倍左右可以观察到细菌的一般形态和结构，至于细菌内部的超微结构，则需经电子显微镜放大数万倍以上才能看清。检查细菌常用的显微镜有以下几种： 1.普通光学显微镜：普通光学显微镜通常以自然光或灯光为光源，显微镜的最大分辨率为波长的一半，即0.25μm，而肉眼所能看到的最小形象为0.2mm，故在普通光学显微镜下用油镜放大1000倍，可将0.25μm 的微粒放大到0.25mm，肉眼便可以看清，一般细菌大于0.25μm，故用普通光学显微镜均能清楚看到。 2.暗视野显微镜：暗视野显微镜是用特制的暗视野集光器代替普通光学显微镜上的明视野集光器，由于暗视野集光器的中央为不透光的遮光板，光线不能直接射入镜筒，故背景视野黑暗无光，而从集光器四周边缘斜射到标本部位的光线，经菌体散射后而进入物镜。故在强光的照射下，可以在黑暗的背景中看到发亮的菌体，犹如夜空中的明亮星星。明暗反差提高了观察的效果，多用于检查不染色的活细菌和螺旋体的形态及运动观察。
年初级检验技师《微生物检验》讲义第章细菌形态学检查法
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细菌形态学检查法 细菌的形态学检查是细菌检验中极为重要的基本方法之一，包括不染色标本检查法和染色标本检查法镜检可以迅速了解标本中有无细菌及大致的菌量，根据细菌形态、结构和染色性有助于对病原菌的初步识别和分类，为进一步作生化反应、血清学鉴定提供依据。对临床早期诊断和治疗疾病有一定的参考意义。 一、显微镜 在细菌的形态学检查中以光学显微镜为常用，借助显微镜放大至1000倍左右可以观察到细菌的一般形态和结构，至于细菌内部的超微结构，则需经电子显微镜放大数万倍以上才能看清。检查细菌常用的显微镜有以下几种： 1.普通光学显微镜 普通光学显微镜通常以可见光为光源，显微镜的最大分辨率为波长的一半，即0.25μm，而肉眼所能看到的最小形象为0.2mm，故在普通光学显微镜下用油镜放大1000倍，一般细菌大于0.25μm，故用普通光学显微镜均能清楚看到。 2.暗视野显微镜 用特制的暗视野集光器代替普通光学显微镜上的明视野集光器，暗视野集光器的中央为不透光的遮光板，光线不能直接射入镜筒，从集光器四周边缘斜射到标本部位的光线，经菌体散射后而进入物镜。故在强光的照射下，在暗的背景中看到发亮的菌体，明暗反差提高了观察的效果，多用于检查不染色的活细菌和螺旋体的形态及运动观察。 3.相差显微镜 相差显微镜依据光波穿过标本中密度不同的部位时，引起光相差异的原理，利用相差板的光栅作用，将光相的差异转换成光的强度的差异，使细菌中的结构呈现明、暗对比。本法可用于检查细菌的内部结构。
怀化医专《微生物学检验》教案编号：3
第八章细菌形态学检查 形态学检查的目的： ①从形态上识别细菌，为细菌分类与鉴别的基础； ②了解被检标本中有无细菌； ③直接从标本中观察到某些细菌，可对少数疾病初步诊断（如结核，脑膜炎等）。 第一节显微镜（microscope） 一、普通光学显微镜 原理自然光的波长为0.4um；显微镜的最大分辨率为0.2um（前者的一半）；肉眼的分辨率为0.2mm，故放大1000倍，使0.2um放大到0.2mm。 二、暗视野显微镜 用暗视野聚光器，使反光镜反射过来的光线不能进入镜筒，视野变暗， 线从暗视野聚光器周围斜射到菌体上，由于散射作用使菌体发光。 常用于活的微生物的动力检测。 三、相差显微镜 在检查不染色标本时，由于细菌的折光性与周围环境的折光性相近，对比不明显，看不清细菌及其内部结构，相差显微镜利用相差板的光栅作用，使光波穿过标本中密度不同的部位时，引起位相差，显出光的强度的明暗对比。 应用于活菌的形态及某些内部结构的观察。 四、荧光显微镜 以紫外光或蓝紫光作光源，因其波长比自然光短，故分辨率比普通显微镜要高。细菌经过荧光素染色后，在荧光显微镜下，由于菌体各种结构对荧光素的溶解、吸附情况不同，因此发出不同色调和亮度的荧光。 五、电子显微镜 以强大的电子流代替光源，因电子流的波长仅为0.005nm，（仅为可见光源的几万分之一），故其放大倍数可达10万-100万倍，可看清1nm的物体。电镜种类 透射电镜：因电子的透射作用，可观察细菌，virus内部结构，通过荧屏显
示。 扫描电镜：因电子流对物体的表面进行扫描，可清楚的显露出物体的三维空间的立体结构，可用于对细菌，virus的表面结构观察。 第二节不染色细菌标本检查法 仅用于细菌动力的观察。不能观察细菌的形态和结构特征。 1.压滴法明视野法、暗视野法。 2.悬滴法 3.毛细管法：孔径0.5-1.0mm，长约60-70mm毛细管，以此管轻取细菌培养物，待液体进入后，两端火焰封融。用于厌氧菌的动力观察。 注意：区别细菌的运动与布朗运动。 第三节细菌染色标本的检查 适于观察细菌的形态和某些结构。 一、染料： 大多是人工合成的含苯环或苯的有机物。 色基：即连接在苯环上带双键的有色化学基团，它使染料带颜色，其色基越多，颜色越深。如-NO2(硝基）\ -N=N-（偶氮基） 助色基：不显色，它决定了染料与被染物之间的亲和性，且有酸、碱之分，决定了染料的酸碱性：-NH2（碱性）-OH （酸性） 常用染料种类： 1、碱性染料：美兰，结晶紫，碱性复红等，常以氯化物形式存在，色基带正电，易与带负电的被染物结合着色。由于细菌PI低（2～5），因此常带负电荷，易与该类染料结合。 2、酸性染料：伊红，酸性复红，刚果红，色基带负电。细菌带负电荷不易着色，常用于细胞浆染色，很少用于细菌染色。 3、复合染料（中性染料）：是碱性染料和酸性染料的复合物，可与cell浆结合，如：伊红美兰、伊红天青。 4、单纯染料：多为偶氮化合物，亲和力低，不溶于水，而溶于脂溶剂。常用于脂肪组织染色，如：苏丹染料。
怎样在显微镜中观看细菌 步骤:先在载玻片上滴加一滴生理盐水.把菌落用接种环挑起后,涂于生理盐水中央直径1CM左右要混匀——把载玻片放在酒精灯上加热烘干———滴加草酸铵结晶紫６０秒——水洗——革兰氏碘液６０Ｓ——９５％酒精脱色３０Ｓ——水洗——番红２分钟——干燥镜检。 最终目的是要在显微镜中看见清晰的细菌形状，所以在染色后脱色和水洗最重要，如脱色和水洗不净就会造成细菌和没洗净的颜色混在一起分不清。 革兰式染色及其原理:上面的就为革兰氏染色步骤，主要针对的是细菌的检验，因为它们极小。其他的如酵母菌等形状很大不用染色。 细菌之所以能被染色主要是和它的结构有关，而且有些能被染成蓝色，有些能染成红色，以此来分为革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌. 对于革兰氏阳性菌它们的细胞结构中脂类含量少，当用结晶紫染色后再用酒精脱色时，将脂类溶解抽提出来，使肽聚糖孔径变小通透性降低，结晶紫不易被抽提出来所以能保持蓝色。 对于革兰氏阴性菌它们的肽聚糖少而脂类多，所以酒精很容易把结晶紫染料提取出来，再经过第二次用番红复染时便染上了红色。 关于测定细菌的大小：细菌可以用测微尺测定。它包括目微尺和镜台微尺，目微尺无刻度镜台微尺有刻度。使用时先把镜台微尺放在镜台上用目微尺找到镜台微尺后使用换算把目微尺刻度进行标定，然后就可心测量细菌的大小了。 从显微镜中观察细菌是件很有意思的事情，在你没找到之前会着急，在找到后又会十分有惊喜感。你会感叹世界竟会有如此小的生命。 第一节细菌形态检查法 2009-06-03 19:56 细菌形态学是研究细菌的一个重要方面，了解细菌的形态和结构对研究细菌的生理活动、致病性和免疫性，以及鉴别细菌、诊断疾病和防治细菌性感染等均有重要的理论和实际意义。由于细菌个体微小，常以微米(μm)为测量单位，肉眼不能直接看到，必须借助显微镜放大后才能观察。根据不同的研究目的和要求，可分别选择普通光学显微镜、相差显微镜、暗视野显微镜、荧光显微镜和电子显微镜等。另外，由于细菌呈半透明状，要想更清楚地观察其大小和形态，需要进行染色。显微镜检查有不染色标本检查法和染色标本检查法两种。 一、不染色标本检查法 不染色标本主要用于检查活菌的动力及运动状况。细菌未染色时无色透明，在显微镜下主要靠细菌的折光率与周围环境的不同来进行观察。有鞭毛的细菌运动活泼，无鞭毛的细菌则呈不规则布朗运动。梅毒苍白密螺旋体、钩端螺旋体、弯曲杆菌等的活菌各有特征鲜明的形态和运动方式，具有诊断意义。常用方法有压滴法或悬滴法，置于普通光学显微镜或暗视野显微镜下观察。 1. 压滴法取菌液一滴，置于清洁载玻片中央，覆上盖玻片，于高倍镜下观察。
形态学检查对细菌鉴定的导航作用 细菌鉴定的原则之一就是用最少的试验完成鉴定。细菌形态学检查是最基本、简单、快速的常规鉴定方法。细菌形态学包括细菌细胞形态学和细菌菌落形态学。细菌形态学正确描述依赖于方法、培养基、培养时间、染色试剂等，培养基和培养时间不同会影响细菌的形态。观察细菌的典型形态，应该是将细菌接种在该细菌最适生长的培养基上、放入该细菌最适生长环境中（包括温度和所需气体条件）进行孵育，孵育时间应视细菌的生长速度而定，大部分常见的细菌以培养24h为宜，有些细菌需要更长时间的孵育才能显现出典型的菌落特征。有时为了鉴别某一种或某一类细菌，需要观察细菌在特殊的培养基（包括显色培养基）上或在特定环境下（气体、温度和光线等）培养的形态特征。 1、菌落特征观察 细菌在固体培养基表面生长形成菌落。对菌落进行描述应包括菌落大小（分大、中、小，以1mm为界）、形状、高度、边缘、表面状态、密度（透明度）、硬度（用接种环刮取菌落时的感觉）、菌落内部结构、颜色、光泽以及与培养基表面的黏附程度，还应包括菌落的溶血、气味和色素产生情况等特性。观察菌落特征的目的是为了对细菌进行初步鉴定。有些特征是某些细菌所特有的，具有属或种的鉴别价值，如肺炎链球菌在绵羊血琼脂平板上的脐窝状菌落（如图1所示）、伴放线凝集杆菌菌落特殊的内部结构（如图2所示）、侵蚀艾肯菌的斗笠样菌落、斯氏假单胞菌皱纹样菌落、变形杆菌迁徙样菌落、铜绿假单胞菌的水溶性色素、紫色色杆菌的脂溶性色素（如图3所示）、粘质沙雷菌的红色色素（如图4所示）、产吲哚金黄杆菌产生的吲哚气味、嗜血杆菌产生的鼠穴气味、诺卡菌产生的腐土气味、厌氧菌产生的腐氨气味、荧光假单胞菌产生的黄色荧光素、某些厌氧菌可产生砖红色荧光素等。有些细菌产生色素受到气体的影响（粘质沙雷菌在厌氧环境下不产色），有些细菌产生色素受到光线的影响（某些快速生长分枝杆菌是光产色或暗产色）。
实验二细菌的形态学检查 【目的和要求】 1．熟悉细菌染色的常用染料和一般程序。 2．掌握革兰染色的方法、原理、结果观察及意义。 3．熟悉不染色标本检查法（压滴法和悬滴法）的方法与结果观察。 4．熟悉细菌的特殊染色法。 【试剂与器材】 1．菌种：葡萄球菌、大肠埃希菌。 2．试剂：革兰染色液、细胞壁染色液、芽胞染色液、鞭毛染色液、生理盐水等。 3．其他：载玻片、接种环、酒精灯、显微镜、香柏油、蜡笔、擦镜纸、脱油剂等。【实验内容】 一、细菌染色的一般程序 细菌染色法分单染法和复染法。单染法是用一种染料去染，所有细菌都染成一种颜色；复染法是用多种染料对细菌进行染色，不同细菌可染成不同的颜色。 大部分细菌染色的基本程序相同，即：涂片→干燥→固定→染色，根据实验目的选择不同的染色方法，在实际工作中，应用最广泛的是革兰染色法。 二、革兰染色 1．染色原理 （1）等电点学说：革兰阳性菌的等电点（pI2～3）比革兰阴性菌（pI4～5）低，在同一pH条件下革兰阳性菌带负电荷比革兰阴性菌要多，与带正电荷的碱性染料（结晶紫）结合性牢固，不易脱色。 （2）化学学说：革兰阳性菌含有大量的核糖核酸镁盐，与进入胞浆内的结晶紫和碘牢固结合成大分子复合物，不易被95%酒精脱色；而革兰阴性菌含此种物质少，故易被乙醇脱色。 （3）通透性学说：革兰阳性菌细胞壁结构较致密，肽聚糖层较厚，含脂质少，脱色时，乙醇不易进入，而且95％乙醇可使细胞壁脱水，细胞壁间隙缩小，通透性降低，阻碍结晶紫和碘复合物渗出。而革兰阴性菌细胞壁结构疏松，肽聚糖层较薄，含脂质多，易被乙醇溶解，致使细胞壁通透性增高，细胞内的结晶紫与碘复合物易被溶出而脱色。 2．方法 （1）涂片：取清洁无油迹的载玻片1张，用蜡笔划线将其分成左右两格。用接种环先挑取生理盐水1~2环于载玻片每格中央，再分别挑取大肠杆菌和葡萄球菌少许菌落与生理盐水研匀，涂成直径约1.5cm的菌膜。 （2）干燥：让涂片自然干燥，也可在酒精灯火焰较远处微微加热烘干，但切勿靠近火焰。（3）固定：干燥后的标本片在酒精灯火焰上来回通过3次（以钟摆的速度），冷却后染色。固定的目的在于杀死细菌，并使菌膜与玻片牢固粘附，避免染色过程中被水冲洗掉，通过固定还可凝固细胞质，改变细菌对染料的通透性，使细菌易与染料结合而着色。 （4）染色：分以下四步： （初染）（媒染）（脱色）（复染） 3．结果：革兰阳性菌染成紫色；革兰阴性菌染成红色。 4．注意事项： （1）涂片厚薄要适宜，以菌膜刚好能透过字迹为宜（半透明）。如果涂片太厚有可能将革兰阴性菌染成紫色，涂片太薄则可能将革兰阳性菌染成红色。