第5章细菌形态学检查

• 实验报告内容
1.绘图 葡萄球菌、大肠杆菌及白色念珠菌的 基本示意图，记录革兰氏染色结果，分辨出革 兰阳性菌和革兰阴性菌。 2.如果染色结果不理想，请分析原因。
• 细菌形态示意图绘图要求
1.选择形态典型的部分细菌，红兰色笔绘图。 2.绘细菌的形态、排列，细菌的大小比例应适 宜，轮廓上（如球菌、杆菌）应有所区分。 注明 菌名：大肠杆菌 染色法： 放大倍数：10×100
菌体内部物质缩水（60％） 形成圆或卵圆形小体。 功能：芽胞形态辨细菌， 灭菌标准抗力强。
实验报告
一、目的 二、原理（主要） 三、材料 四、方法 五、结果（2+3幅图） 六、意义 七、注意事项
实验结果

1、绘制所涂片染色的G+及G-菌的形态图并 注 明放大倍数

2、绘制示教片中各细菌特殊结构形态图并注 明放大倍数
医学微生物学实验室规则：

学生进微生物实验室必须穿好工作服，离室需脱下 反折，要经常清洗消毒； 进实验室时随带书包、衣物等与实验无关物品一律 存放指定的储物柜内； 严禁在实验室进食、饮水和抽烟； 手拿培养物后或出实验室前要洗手，必要时用消毒 液泡手； 实验过程中避免一切不良的个人习惯；操作中产生 的垃圾不得随意抛掷，要扔在指定的桶内
（二）细菌涂片标本的制备
制备涂片包括涂片、干燥、固定三步。
涂片
干燥
固定
（二）细菌涂片标本的制备
1.涂片
① 接种环置于酒精灯的外焰中烧灼灭菌。
（二）细菌涂片标本的制备
1.涂片
② 取1~2环生理盐水（NS)置于载玻片上，接种 环用火焰烧灼灭菌。
（二）细菌涂片标本的制备
1.涂片
③ 小指和手掌小鱼肌侧拔掉棉塞，并烧灼试管口灭菌。 用已灭菌冷却的接种环伸入试管中取适量菌，注意勿使沾 有菌液的接种环触及试管壁及试管口。
化学学说
G+菌菌体内含有大量核糖核酸镁盐，可 与碘、结晶紫等染料牢固结合，使 已着色的细菌不易被乙醇脱色 G-菌 菌体内含核糖核酸镁盐很少，故易 被脱色
三、器材和试剂
1、菌种
葡萄球菌 大肠杆菌
2、试剂
初染液 媒染液 脱色液 复染液
革兰染色液
结晶紫 卢戈氏碘液 95%乙醇 稀释石碳酸复红 染色盘 接种环 酒精灯等
革兰染色法原理
3.化学学说
革兰氏阳性菌细胞内含有某种特殊化学成
份，一般认为是核糖核酸镁盐与多糖的复合物，
它能和料染一煤染剂复合物相互结合，使已着
色的细菌不易脱色。
细菌的革兰染色法
(一）实验材料
1.菌种 培养18~24h的葡萄球菌、大肠杆菌 及白色念珠菌。 2.试剂 生理盐水、革兰氏染色液。 3.仪器及用具 接种环、酒精灯、玻片、显微镜、香柏油等。
正染色
负染色
普通染色
特殊染色
简单染色法
复杂染色法
芽孢染色法
荚膜染色法
细胞壁染色法
抗酸染色
革兰氏染色
细菌特殊染色法
芽胞
鞭毛
革兰染色法
丹麦细菌学家Gram
于1884年发明的一种鉴
别细菌的染色法。
可将细菌鉴别为革 兰氏阳性G+菌和革兰氏
阴性G-菌两大类。
革兰染色法原理
1.通透性学说
革兰氏阳性菌细胞壁的通透性比阴性菌低，
通透性学说
G+菌细胞壁结构致密，肽聚糖层厚且交联 度高，脂质含量少，乙醇不易进入 G-菌细胞壁结构疏松，肽聚糖层薄且交联度 低，含大量脂质，乙醇易渗入。
等电点学说
G+菌等电点（pI2~3） G-菌等电点（pI4~5） 在相同pH条件下G+菌所带负电荷比G-菌 多，所以与带正电荷的结晶紫染料结合较 牢固，不易脱色。
从细胞质的基础颗粒长出，伸到细胞外面的细长呈波状弯曲的丝状物。 功能：鞭毛运动可鉴定、与致病性有关、具有抗原性（H抗原）
菌发出比鞭毛更更细、短、直、硬和多的丝状蛋白附属 物，与运动无关，菌毛中空，可分为普通菌毛和性菌毛 功能：普通菌毛附黏膜，性菌毛传递遗传物质
荚膜
细菌细胞壁外包绕的一层粘液性物质，厚度≥0.2μm边界 明显者称为荚膜，厚度＜0.2μm者称为微荚膜 功能：荚膜护菌强致病---抗吞噬作用、抗有害物质损伤、 抗干燥作用、黏附作用
[实验内容]
一、光学显微镜油镜的使用和保护法
二、细菌的革兰染色检查法
三、细菌基本形态和特殊结构的观察
实验一 细菌的形态学检查
[目的要求]
1.掌握显微镜油镜的使用和保护。
2.掌握细菌的基本形态和特殊结构。
3.掌握细菌涂片标本的制备及革兰染色的步骤，
判断革兰染色性及明确其临床意义。
一、显微镜油镜的使用和保护
• 显微镜的构造图 • 显微镜的使用方法
• 油镜头的辨认
• 显微镜的维护
油镜加香柏油的原理
• 玻璃折射率： n=1.52 • 香柏油折射率： n=1.515
二、细菌标本染色检查法
细菌个体微小，无色半透明，染色后能在显 微镜下识别其各种不同结构，并鉴别细菌。
细菌染色法:
细菌染色 活菌染色 死菌染色
细 菌 形态学检查
形态学检查分类
一、不染色标本检查(活体）
悬滴法
压滴法
二、染色标本检查
单染法：简单染色，一种染料 （美兰染色）
复染法：复杂染色，两种以上染料（革兰染 色、抗酸染色）
染色标本检查法的一般步骤
一、涂片制备 涂片 干燥 二、染色 初染 媒染 固定 脱色 复染
注：固定的目的 1、杀死细菌,保持细菌原有的形态和结构 2、增加细菌的通透性，使细菌易于着色 3、使细菌牢牢地黏附在玻片上，不至于在染色 过程中被水冲掉
5.
清洗镜头：油镜使用完毕，先用擦镜纸擦去镜
头上和标本上的香柏油，再用擦镜纸沾少许二 甲苯（或乙醚）擦去残余的香柏油，最后再用 干擦镜纸擦干净。
《医学微生物学》实验一
实验报告书写
1.实验题目
2.实验目的 3.实验原理
4.实验材料
5.实验方法 6.实验结果 7.结果分析 8. 实验意义
实验一 细菌的形态学检查
• 油镜观察结果1000倍
放大倍数：10×100
• 白色念珠菌革兰染色1000倍
放大倍数：10×100
革兰氏染色意义：
1.鉴别细菌
2.选择抗菌药物
3.研究细菌致病性
G+菌能产生外毒素， G-菌能产生内毒素，
两者的致病作用不同。
• 注意事项
1.脱色过度，可使 G+菌被误染为 G-菌； 2.脱色时间的长短还与涂片厚薄有关，以涂片薄 而均匀为好； 3.多种因素如菌龄、染色时间、pH等影响结果。
（二）细菌涂片标本的制备
3.固定
目的：使细菌蛋白变性，菌 体牢固黏附于玻片上，还可杀
死细菌。 玻片有菌膜一面向上，在火焰的外焰钟摆
样速度通过三次，时间约3秒钟。
革兰染色法操作步骤：
• 初染 媒染 脱色 复染
初染（结晶紫.碳酸钠） 媒染（ 碘 液） 脱色（丙酮酒精）
复染（ 复红）
革兰染色法
结晶紫、碳酸钠30秒 碘液媒染30秒 丙酮酒精数滴，脱色约5--10秒 碱性复红液2~3滴，5秒钟 待干，镜检。 注：每一步均需 细流水冲洗。
革兰染色(Gram stain)

1884年由丹麦医师Gram创立
革兰染色是最常用的一种染色方法，可以将细菌初 步分为革兰染色阳性菌和革兰染色阴性菌，在临床 上具有非常重要的意义

一、目的
1、掌握细菌涂片的制备及革兰染色的方法 2、了解革兰染色的原理和临床意义
二、原理
1、通透性学说 2、等电点学说 3、化学学说
3、其它
载玻片
四、方法与步骤
1、细菌涂片的制备 涂片 2、染色 初染（结晶紫）
30s 1min
冲洗
干燥
固定
1min
冲洗
媒染（卢戈氏碘液）
脱色
（95%乙醇） 冲洗 吸干
复染（稀释石碳酸复红）
30s
冲洗
吸水纸
染色完成之后，在涂片区滴上香柏油使用油镜观察实验结果
五、注意事项

无菌操作（接种环灭菌和取菌） 涂片的厚度要适中 染色的时间控制，一一半半 冲洗的方法，不要对着涂片区冲洗
光圈开到最大。
转高倍镜头、滴加镜油、换油镜头：转动
转换器，使高倍镜头离开通光孔，在需观察部 位的玻片上滴加一滴香柏油，然后慢慢转动油 镜，在转换油镜时，从侧面水平注视镜头与玻 片的距离，使镜头浸入油中而又不以压破载玻 片为宜。
油镜的使用方法
4.
调试观察：观察目镜，并慢慢转动细调节器至
物象清晰为止。［如果不出现物象或者目标不 理想要重新寻找，在加油区之外重找时应按： 低倍→高倍→油镜程序。在加油区内重找应按： 低倍→油镜程序，不得经高倍镜，以免油沾污 镜头。］
透镜 折光率 油 1.515 1.0 空气
玻
1.52
璃
空
气
油镜原理示意图
物 低倍目镜
镜 10×
工作距离(mm) 5.40
高倍目镜
油镜头
40×
100×
0.390.11ຫໍສະໝຸດ 油镜的使用方法1.
寻找视野：在使用油镜之前，必须先经低、高
倍镜观察，然后将需进一步放大的部分移到视 野的中心。
2. 3.
增大光照强度：将聚光器上升到最高位置，
六、结果
初染
结 晶 紫
G+菌
媒染
卢 戈 氏 碘 液
脱色
95%
复染
石 碳 酸 复 红
乙 醇
G-菌
一
一
半
半
图一
图二
七、临床意义 1、鉴别细菌