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2024年普通高中学业水平选择性考试安徽卷生物试卷养成良好的答题习惯，是决定成败的决定性因素之一。
做题前，要认真阅读题目要求、题干和选项，并对答案内容作出合理预测;答题时，切忌跟着感觉走，最好按照题目序号来做，不会的或存在疑问的，要做好标记，要善于发现，找到题目的题眼所在，规范答题，书写工整;答题完毕时，要认真检查，查漏补缺，纠正错误。
一、选择题：本题共15小题，每小题3分，共45分。
在每小题给出的四个选项中，只有一项是符合题目要求的。
1. 真核细胞的质膜、细胞器膜和核膜等共同构成生物膜系统。
下列叙述正确的是（）A. 液泡膜上的一种载体蛋白只能主动转运一种分子或离子B. 水分子主要通过质膜上的水通道蛋白进出肾小管上皮细胞C. 根尖分生区细胞的核膜在分裂间期解体，在分裂末期重建D. [H]与氧结合生成水并形成ATP的过程发生在线粒体基质和内膜上2. 变形虫可通过细胞表面形成临时性细胞突起进行移动和摄食。
科研人员用特定荧光物质处理变形虫，发现移动部分的细胞质中聚集有被标记的纤维网架结构，并伴有纤维的消长。
下列叙述正确的是（）A. 被荧光标记的网架结构属于细胞骨架，与变形虫的形态变化有关B. 溶酶体中的水解酶进入细胞质基质，将摄入的食物分解为小分子C. 变形虫通过胞吞方式摄取食物，该过程不需要质膜上的蛋白质参与D. 变形虫移动过程中，纤维的消长是由于其构成蛋白的不断组装所致3. 细胞呼吸第一阶段包含一系列酶促反应，磷酸果糖激酶1(PFK1）是其中的一个关键酶。
细胞中ATP减少时，ADP和AMP会增多。
当ATP/AMP浓度比变化时，两者会与PFK1发生竞争性结合而改变酶活性，进而调节细胞呼吸速率，以保证细胞中能量的供求平衡。
下列叙述正确的是（）A. 在细胞质基质中，PFK1催化葡萄糖直接分解为丙酮酸等B. PFK1与ATP结合后，酶的空间结构发生改变而变性失活C. ATP/AMP浓度比变化对PFK1活性的调节属于正反馈调节D. 运动时肌细胞中AMP与PFK1结合增多，细胞呼吸速率加快4. 在多细胞生物体的发育过程中，细胞的分化及其方向是由细胞内外信号分子共同决定的某信号分子诱导细胞分化的部分应答通路如图。
电泳法，是指带电荷的供试品（蛋白质、核苷酸等）在惰性支持介质（如纸、醋酸纤维素、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等）中，于电场的作用下，向其对应的电极方向按各自的速度进行泳动，使组分分离成狭窄的区带，用适宜的检测方法记录其电泳区带图谱或计算其百分含量的方法。
电泳技术的基本原理和分类在电场中，推动带电质点运动的力（F）等于质点所带净电荷量（Q）与电场强度（E）的乘积。
F＝QE质点的前移同样要受到阻力（F）的影响，对于一个球形质点，服从Stoke定律，即：F′＝6πrην式中r为质点半径，η为介质粘度，ν为质点移动速度，当质点在电场中作稳定运动时：F＝F′即QE＝6πrην可见，球形质点的迁移率，首先取决于自身状态，即与所带电量成正比，与其半径及介质粘度成反比。
除了自身状态的因素外，电泳体系中其它因素也影响质点的电泳迁移率。
电泳法可分为自由电泳（无支持体）及区带电泳（有支持体）两大类。
前者包括Tise-leas式微量电泳、显微电泳、等电聚焦电泳、等速电泳及密度梯度电泳。
区带电泳则包括滤纸电泳（常压及高压）、薄层电泳（薄膜及薄板）、凝胶电泳（琼脂、琼脂糖、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶）等。
自由电泳法的发展并不迅速，因为其电泳仪构造复杂、体积庞大，操作要求严格，价格昂贵等。
而区带电泳可用各种类型的物质作支持体，其应用比较广泛。
本节仅对常用的几种区带电泳分别加以叙述。
影响电泳迁移率的因素⒈电场强度电场强度是指单位长度（cm）的电位降，也称电势梯度。
如以滤纸作支持物，其两端浸入到电极液中，电极液与滤纸交界面的纸长为20cm，测得的电位降为200V，那么电场强度为200V/20cm＝10V/cm。
当电压在500V以下，电场强度在2-10v/cm时为常压电泳。
电压在500V以上，电场强度在20-200V/cm时为高压电泳。
电场强度大，带电质点的迁移率加速，因此省时，但因产生大量热量，应配备冷却装置以维持恒温。
⒉溶液的pH值溶液的pH决定被分离物质的解离程度和质点的带电性质及所带净电荷量。
河北科技师范学院赤潮案例分析院（系、部）名称：理化学院专业名称：应用化学学生姓名：李静亚学生学号：1011090308 指导教师：宋士涛2012年 4 月18日河北科技师范学院教务处制赤潮已成为一种世界性的公害，美国、日本、中国、加拿大、法国、瑞典、挪威、菲律宾、印度、印度尼西亚、马来西亚、韩国等30多个国家和地区赤潮发生都很频繁。
2012年我国深圳南澳海面出现较大面积赤潮,深圳南澳海面现较大面积夜光藻赤潮：靠近岸边的海面已变成赤红色，受污染的海面约有一个足球场大。
海面上漂浮着大量垃圾，海水也泛着阵阵恶臭。
2012年4月10日，深圳市海洋环境与资源监测中心工作人员到深圳东部海域南澳月亮湾进行水样化验，认定这里出现的较大面积红褐色物质是由一种名叫“夜光藻”的藻类大量繁殖所导致的赤潮。
数天前在大梅沙西部也出现小范围赤潮。
1.赤潮的污染来源“赤潮”，被喻为“红色幽灵”，国际上也称其为“有害藻华”，赤潮又称红潮，是海洋生态系统中的一种异常现象。
它是由海藻家族中的赤潮藻在特定环境条件下爆发性地增殖造成的。
海藻是一个庞大的家族，除了一些大型海藻外，很多都是非常微小的植物，有的是单细胞植物。
根据引发赤潮的生物种类和数量的不同，海水有时也呈现黄、绿、褐色等不同颜色。
赤潮是一种自然现象，也有人为因素引起的，但不一定是一种有害生态现象。
主要有海域水体富营养化；有特殊物质作为诱发因素，已知的有维生素B1、B12、铁、锰和脱氧核糖核酸（DNA）；环境条件，如水温、盐度等也决定着发生赤潮的生物类型。
引发赤潮的生物类型主要为藻类，目前已发现有63种浮游生物，硅藻有24种，甲藻32种、蓝藻3种、金藻1种、隐藻2种、原生动物1种。
∙大量工农业废水和生活污水排入海洋，特别是未经处理直接排入而导致近海、港湾富营养化程度日趋严重。
∙海洋开发、水产业带来了海洋生态环境和养殖业自身污染问题。
∙全球海运业发展导致外来有害赤潮种类的引入，气候变暖导致赤潮发生。
东海典型赤潮藻检测的荧光光谱特征研究浮游植物种类和数量的监测是海洋科学研究中一项例行的基础性工作,随着全球,特别是我国近海赤潮频发,迫切需要一种能够直接、快速进行浮游植物种类和数量分析的方法。
三维荧光光谱灵敏度高,能给出整个激发、发射波长范围内的全部荧光指纹信息,通过提取三维荧光光谱的特征,应用化学计量学方法可以直接进行多组分混合物的定性、定量的分析。
但目前国内外尚未见有应用活体浮游植物三维荧光光谱进行赤潮藻种类识别和数量测量的报道。
本文选取中国东海赤潮多发区11种分属于五个门类的典型浮游植物赤潮种、优势种(包括甲藻2种:塔玛亚历山大藻Alexandrium tamarense,东海原甲藻Prorocentrum donghaiense;硅藻6种:尖刺拟菱形藻Pseudo-nitzschia pungens,中肋骨条藻Skeletonema costatuma,新月菱形藻Nitzschia closterium,旋链角毛藻Chaetoceros curvisetus,柔弱角毛藻 Chaetoceros debilis,双突角毛藻Chaetoceros didymus;金藻1种:等鞭金藻Isochrysis galbana;绿藻1种:岛国大扁藻Platymonas helgolanidica;蓝藻1种:聚球藻Synechococcus sp.),对不同温度、光照、生长期条件下单一浮游植物活体的三维荧光光谱特征进行了研究,在纲(Class)或更细层次识别典型浮游植物,为开发低价、简便的赤潮藻荧光分析仪奠定技术基础。
本论文的主要研究成果如下: 1.对“悬浮液”活体浮游植物样品的三维荧光光谱的量测精密度和相似性进行了研究。
定义了两个三维光谱的相对误差,发现平行测量2次与平行测量8次,其平均相对误差的差异小于1%,因此确定正式实验采取平行测量两次。
11种浮游植物平行样的三维荧光光谱,其相对误差多数在10%以内,只有个别藻,如尖刺拟菱形藻略差,达15%;去除Rayleigh散射后的三维光谱,相对误差多数在5%以内。
1、调研什么是斑点/狭缝印迹，其用途是什么。
2、简单总结以下方法的用途和特点DGGE（变性梯度凝胶电泳）TGGE（温度梯度凝胶电泳）SSCP（单链构象多样性）分析T-RFLP（末端限制性酶切片段长度多态性）分析定义：斑点杂交（Dot blot）是将被检标本点到膜上，烘烤固定。
这种方法耗时短，可做半定量分析。
一张膜上可同时检测多个样品，为使点样准确方便，市售有多种多管吸印仪（Manifold），如MinifoldⅠ和Ⅱ、Bio-Dot(Bio-Rad)和Hybri-Dot，它们有许多孔，样品加到孔中，在负压下就会流到膜上呈斑点状或狭缝状。
反复冲洗进样孔，取出膜烤干或紫外线照射以固定标本，这时的膜就可以进行杂交。
（1）DNA斑点杂交：①先将膜在水中浸湿，再放到15×SSC中。
②将DNA样品溶于水或TE，煮沸5min，冰中速冷。
③用铅笔在滤膜上标好位置,将DNA点样于膜上,每个样品一般点5μl(2~10μg DNA)。
④将膜烘干，密封保存备用。
（2）RNA斑点杂交：与上法类似，每个样品至多加10μg总RNA（经酚/氯仿或异硫氰酸胍提取纯化），方法是将RNA溶于5μl DEPC水，加5μl甲醛/SSC缓冲液（10×SSC中含6.15mol/L 甲醛），使RNA变性，然后取5-8μl点样于处理好的滤膜上，烘干。
（3）完整细胞斑点杂交：应用类似检测细菌菌落的方法，可以对细胞培养物的特异序列进行快速检测，将整个细胞点到膜上，经NaOH处理，使DNA暴露、变性和固定，再按常规方法进行杂交与检测。
完整细胞斑点印迹法可以用于筛选大量标本，因为它使细胞直接在膜上溶解，所以DNA含量甚至比常用的提取法还高，又不影响与32P标记的探针杂交，但它不适用于非放射性标记探针，因为DNA纯度不够，会产生高本底。
（4）用途：可对DNA、RNA进行检测和分析，在菌种亲缘关系鉴定、疾病监测、重组细菌检测等方面广泛应用于基因工程和分子生物学工程。
化学实验报告之电泳实验目旳：结识胶体粒子是带电粒子实验原理：带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反旳电极移动实验器材及药物：铁架台、u形管、石墨碳棒、粗铜丝、滴管、导线、直流电源、fe(oh)3胶体、定量nacl溶液实验操作：1、将烧杯中旳蒸馏水加热至沸腾，向沸水中逐滴滴加入6滴fecl3饱和溶液。
继续煮沸至溶液呈红褐色，停止加热。
观测制得旳fe（oh）3胶体2、取一支u形管，注入fe（oh）3胶体到距离管口5.0cm处，固定在铁架台上，用滴管给u形管旳两端沿壁慢慢注入一定浓度旳nacl溶液，使u形管两端明显分层，形成清晰旳液面3、给u形管两端插入碳棒电极，并分别连接电源旳正负极，观测现象并记录时间。
实验现象：u形管和阴极连接旳一端液面上升，浮现明显旳液面差，阴极一端颜色加深，阳极一端颜色变浅实验分析：在外加直流电源旳作用下，fe（oh）3胶体微粒在分散介质里向阴极作定向移动,注意碳棒不要和胶体接触，，否则胶体放电或电解水，nacl溶液旳浓度不要太大最佳是51毫摩每升。
篇二：电泳实验报告实验十二电泳一、目旳规定1）掌握电泳法测ζ电势旳原理和技术；2）从实验现象中加深对胶体旳电学性质旳理解，即在外电场作用下，胶粒和介质分别向带相反电荷旳电极移动，就产生了电泳和电渗旳电动现象（因电而动）。
二、基本原理1．电泳由于胶粒带电，而溶胶是电中性旳，则介质带与胶粒相反旳电荷。
在外电场作用下，胶粒和介质分别向带相反电荷旳电极移动，就产生了电泳和电渗旳电动现象。
影响电泳旳因素有：带电粒子旳大小、形状；粒子表面电荷旳数目；介质中电解质旳种类、离子强度，ph值和粘度；电泳旳温度和外加电压等。
从电泳现象可以获得胶粒或大分子旳构造、大小和形状等有关信息。
2．三种电势，固体表面相对溶液旳电势，?0=f（固体表面电荷密?0：热力学电势（或平衡电势）度，电势决定离子浓度）。
??：斯特恩电势。
离子是有一定大小旳，并且离子与质点表面除了静电作用外，尚有范德华吸引力。
第32卷第5期暨南大学学报（自然科学版）Vol．32No．5 2011年10月Journal of Jinan University（Natural Science）Oct．2011常见赤潮藻类的变性梯度凝胶电泳分析邵娟，王朝晖，林朗聪，张珂（暨南大学水生生物研究所，广东广州510632）［摘要］为了解我国典型有毒有害赤潮藻类的变性梯度凝胶电泳（DGGE）指纹图谱以及DGGE技术在赤潮藻类分析鉴定中的作用，本课题组运用DGGE技术，研究了我国沿海7种重要赤潮藻类的单一种类以及混合种类样品的18S rDNA V3区的DGGE指纹图谱，并且对2009年10月底在广东省珠海海域发生的双胞旋沟藻（Cochlodini-um geminatum）赤潮样品进行了DGGE分析．结果表明，DGGE技术能够对环节环沟藻、海洋原甲藻、血红哈卡藻、锥状斯氏藻、中肋骨条藻、塔玛亚历山大藻、双胞旋沟藻7种常见的海洋赤潮藻类具有较好的区分效果，同时监测出赤潮样品中双胞旋沟藻、血红哈卡藻、环节环沟藻和海洋原甲藻4种优势种，种类组成与显微镜观察结果具有较好的一致性．结果说明DGGE技术可作为一种辅助方法对赤潮藻类进行分类鉴定．［关键词］变性梯度凝胶电泳（DGGE）；海洋微藻；双胞旋沟藻；赤潮；聚合酶链式反应（PCR）［中图分类号］Q178．53；X55［文献标志码］A［文章编号］1000－9965（2011）05－0504－05Analysis of harmful algal bloom species using denaturinggradient gel electrophoresis（DGGE）SHAO Juan，WANG Zhao-hui，LIN Lang-cong，ZHANG Ke（Institute of Hydrobiology，Jinan University，Guangzhou510632，China）［Abstract］Denaturing gradient gel electrophoresis（DGGE）fingerprints of18S rDNA V3region of single species and multi-species of seven harmful algal bloom（HAB）taxa were studied in this study．The purpose is to understand DGGE fingerprints of typical HAB species from Chinese sea areas and the use of DGGE in the identification of HAB specie．A nature sample from the Cochlodinium geminatum bloom in Zhuhai coasts in October2009was analyzed．Results showed that distinguish lanes appeared in DGGE fingerprints by the seven HAB species including Gyrodinium instriatum，Prorocentrum micans，Akashiwo sanguinea，Scrippsiella trochoidea，Skeletonema costatum，Alexandrium tamarense and Cochlo-dinium geminatum．Meanwhile four dominant species（Cochlodinium geminatum，Akashiwo sanguinea，Gyrodinium instriatum and Prorocentrum micans）were observed in fingerprint of the bloom sample，which were consistent with the microscopical observation．The results suggested that DGGE technique could be applied as an auxiliary method for HAB species identification and analyzing．［Key words］denaturing gradient gel electrophoresis（DGGE）；marine microalgae；Cochlodinium geminatum；harmful algal bloom；polymerase chain reaction（PCR）［收稿日期］2011－07－13［基金项目］国家自然科学基金资助项目（41076093）；中央高校基本科研业务费专项资金项目（21611417）［作者简介］邵娟（1986－），女，硕士研究生，研究方向：海洋环境与赤潮，E-mail：shao123456juan@126．com通讯作者：王朝晖（1968－），女，教授，博士，研究方向：海洋生态学变性梯度凝胶电泳（DGGE）技术是由Fischer 和Lerman［1］于1979年最早提出的用于检测DNA 突变的一种电泳技术，是根据DNA在不同浓度的变性剂中解链行为的不同而导致电泳迁移率发生变化，从而将片段大小相同而碱基组成不同的DNA片段分开．1993年，DGGE技术被运用至微生物生态学研究中［2］，主要用于分析不同环境中微生物的分子多态性和群落结构，研究结果表明DGGE技术能很好地反映水体、土壤以及污染环境中微生物群落结构特征和基因多态性［3－6］．赤潮是目前全球所面临的重大海洋环境问题，赤潮藻类分类是赤潮研究基础．传统的藻类分类方法主要是根据藻细胞形态学特征和生理生化特点进行分类，一般是运用光学显微镜以及电子扫描显微镜对藻类的外形特征进行观察．虽然形态学方法比较直观，但有的藻细胞形态学差异微小，在光学显微镜下很难区分，特别是有些有毒有害种类［7］．随着分子生物学的发展和完善，为赤潮藻类的分析鉴定提供了新的方法，国内外有很多学者利用分子技术来研究浮游植物的分类，多数研究集中在藻类的分子进化系统发展和检测等方面［8］．但是目前有关DGGE技术在海洋环境中的运用多集中在微生物方面［9－10］，有关该技术在浮游植物的研究报道还非常有限［11－12］．Wang等［11］研究证明用DGGE技术能够较好区分形态相近的18种甲藻实验室培养株系；Sun等［12］利用DGGE技术研究了东海和黄海浮游植物DNA指纹，研究结果显示浮游植物分子多样性与传统显微镜观察法研究结果具有较好的一致性；陈美军等用DGGE技术对太湖不同湖区的浮游生物多样性及组成结构进行了研究，结果表明不同湖区浮游生物的DGGE指纹图谱存在明显差异［13］．为了了解我国典型有毒有害赤潮藻类的DGGE指纹图谱以及DGGE技术在赤潮藻类分析鉴定中的作用，本课题组选取了我国沿海7种重要赤潮藻类，研究了单一种类DNA样品以及混合样品的DGGE指纹图谱，并且对2009年10月底在广东省珠海海域发生的双胞旋沟藻（Cochlodinium geminatum）赤潮样品进行了DGGE分析，以了解DGGE技术对赤潮藻类的鉴别作用特别是对形态相近的有害甲藻的鉴定，为DGGE技术运用于赤潮监测和浮游植物分子多样性研究提供参考．1材料与方法1．1实验藻种与培养本研究选用7种典型赤潮藻类，均来源于广州暨南大学水生生物研究所藻种室，分别为甲藻环节环沟藻（Gyrodinium instriatum）、海洋原甲藻（Proro-centrum micans）、血红哈卡藻（Akashiwo sanguinea）、锥状斯氏藻（Scrippsiella trochoidea）、塔玛亚历山大藻（Alexandrium tamarense）、双胞旋沟藻（Cochlodini-um geminatum）以及硅藻中肋骨条藻（Skeletonema costatum），其中、塔玛亚历山大藻、海洋原甲藻、锥状斯氏藻和中肋骨条藻分离于广东省大亚湾海域，血红哈卡藻、环节环沟藻和双胞旋沟藻分离于2009年广东珠海双胞旋沟藻赤潮水样．藻种分离后培养于f/2培养基中，培养温度为20ħ，光照强度100μE，光暗比为12ʒ12．1．2赤潮样品采集与分析在珠海赤潮高发期的4月29日下午4时左右，在珠海渔女塑像附近海域采集了赤潮带表层水样，在2h内迅速运回实验室进行处理．取水样50mL 至离心管中进行总DNA的提取，另取约20mL水样，用鲁哥氏液进行固定，在显微镜下对浮游植物进行定性定量分析．1．3总DNA的提取分两组实验进行PCR-DGGE分析，第一组为4种有害甲藻（环节环沟藻、海洋原甲藻、血红哈卡藻、锥状斯氏藻）单一藻种以及两两混合和多种混合进行分析，以了解DGGE技术对甲藻DNA片段的分离效果；第二组实验根据珠海赤潮水样中的浮游植物组成，对水样中的优势藻类单种和混合样品以及赤潮水样进行分析，揭示DGGE技术对自然样品的分离效果．在藻细胞培养至对数生长期，分别取单一藻类培养液以及2种、3种和多种赤潮藻类培养液等体积混合液各50mL至离心管中，在4ħ下10000g 离心5min收集藻细胞，加入200μL Milly-Q水重悬浮后，转入1.5mL离心管中，采用UNIQ柱式植物基因组提取试剂盒（上海生工）提取总DNA，在4ħ下存储备用．1．4PCR扩增本实验所用引物为真核生物18S rDNA V3区的特异性引物对F1427GC（5'-CGCCCGCCGCGC-CCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCTCTGTGAT -GCCCTTAGATGTTCTGGG-3'）和R1616（5'-GCG-GTGTGTA2CAAAGGGCAGGG-3'）［14］，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成．PCR反应在Applied Biosystems veriti TM PCR仪中进行，反应体系为25μL，包括2.5μL10ˑ反应缓冲液、0.6μL上、下游引物（10μmol/L）、0.6μL dNTPs（10mmol/L）、0.2μL Taq DNA聚合酶（5U/μL）、模板量1μL，以ddH2O补足体积．PCR反应条505第5期邵娟，等：常见赤潮藻类的变性梯度凝胶电泳分析件为94ħ1min；94ħ变性1min，65ħ退火1min（每个循环降低1ħ），72ħ延伸1min，10个循环；94ħ变性1min，55ħ退火1min，72ħ延伸1min，20个循环；72ħ延伸10min［15］．用质量分数1%的琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳检测．1．5DGGE取PCR扩增产物20μL，在Bio-Rad公司的Dcode TM通用突变检测系统对PCR产物进行DGGE 分析．DGGE条件为：丙烯酰胺质量分数8%，变性梯度30% 70%（100%的变性剂浓度为7mol/L尿素和质量分数40%去离子甲酰胺），先用200V电压电泳10min，然后再用100V电压电泳16h．缓冲液为1ˑTAE．电泳结束后用0.5μg/mL的溴化乙锭染色20min，用Bio-Rad公司凝胶成像系统（Gel Doc2000TM）进行拍照．2结果2．1赤潮水样的观察与分析样品中浮游植物组成见表1．旋沟藻是赤潮水样中最优势物种，细胞密度为315cells/mL，占浮游植物总密度的73.26%；血红哈卡藻是第二优势物种，细胞密度和百分比含量分别为600cells/mL和13.95%；中肋骨条藻和环节环沟藻细胞密度也分别达到100和70cells/mL．表12009年10月29日珠海赤潮样品中浮游植物组成中文名称学名细胞密度/mL双胞旋沟藻Cochlodinium geminatum3150血红哈卡藻Akashiwo sanguinea600中肋骨条藻Skeletonema costatum100环节环沟藻Gyrodinium instriatum70日本纤囊藻Fibrocapsa japonica60米氏凯伦藻Karenia mikomotoi40圆鳞异囊藻Heterocapsa circularisquama30异囊藻Heterocapsa niei30海洋原甲藻Prorocentrum micans20多纹膝沟藻Gonyaulax polygramma20塔玛亚历山大藻Alexandrium tamarense20单眼藻Warnowia polyphenmus20哈曼褐多沟藻Pheopolykrikos harmannii20圆筛藻Coscinodiscus sp．10无纹多沟藻Polykrikos schwartzii10环沟藻Gyrodinium pepo10裸甲藻Gymnodinium aureum102．2PCR扩增产物分析图1为4种有害甲藻（环节环沟藻、海洋原甲藻、血红哈卡藻、锥状斯氏藻）单一藻种以及两两混合和多种混合后PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图，可以看出该引物扩增产物大小均一，约为250 bp，可见引物具有较好的专一性，且目的片段的大小适于DGGE分析（200 700bp）．图2显示了6种赤潮藻类单种、混合样品以及2009年10月29日珠海赤潮水样PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图，同样所有样品的扩增产物大小一致，均为250bp左右．M：marker DL2000；1：环节环沟藻；2：海洋原甲藻；3：血红哈卡藻；4：锥状斯氏藻；5：环节环沟藻+血红哈卡藻；6：海洋原甲藻+锥状斯氏藻；7：环节环沟藻+血红哈卡藻+锥状斯氏藻；8：环节环沟藻+海洋原甲藻+血红哈卡藻；9：环节环沟藻+海洋原甲藻+血红哈卡藻+锥状斯氏藻．图14种赤潮甲藻PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图M：marker DL2000；1：环节环沟藻；2：海洋原甲藻；3：血红哈卡藻；4：中肋骨条藻；5：塔玛亚历山大藻；6：双胞旋沟藻；7：环节环沟藻+海洋原甲藻+血红哈卡藻+中肋骨条藻+塔玛亚历山大藻+双胞旋沟藻；8：珠海赤潮海水样品．图26种赤潮藻类及珠海赤潮水样PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图2．3DGGE分析将图1和图2中所示的PCR扩增产物进行DGGE分析，结果分别见图3和图4．从图3中可以看出，单一种类的PCR产物在DGGE分析中清楚的出现一条条带（1 4泳道），而两两混合藻细胞PCR 产物则出现与其单种产物相对应的两条条带（5 6泳道），在3种混合（7 8泳道）以及4种混合（9泳道）的PCR产物分别出现了3条和4条条带．研究结果表明DGGE技术能够准确的区分出环节环沟藻、海洋原甲藻、血红哈卡藻、锥状斯氏藻这4种甲605暨南大学学报（自然科学版）第32卷藻，并且每条泳道里的条带数正好与样品中的种类数相同，说明DGGE 技术能够较好的区分不同种的甲藻．从图4中的1 6泳道分别为6种赤潮藻类单种PCR 产物的DGGE 图谱，而第7泳道为6种藻混合的图谱．可以看出，第7泳道出现了比较清晰6条带，并且正好与1 6泳道中的单种泳带位置相对应，表明DGGE 技术能够准确的区分出环节环沟藻、海洋原甲藻、血红哈卡藻、中肋骨条藻、塔玛亚历山大藻、双胞旋沟藻这几种常见的海洋赤潮藻类．第8泳道赤潮样品中较清晰的4条带正好与1、2、3、6号泳道中的条带位置相对应，说明珠海赤潮样品的优势种类包括双胞旋沟藻、血红哈卡藻、环节环沟藻、海洋原甲藻，而另一优势种类中肋骨条藻则由于细胞微小，只在图谱中出现了微弱条带，这与显微镜观察结果基本一致（表1）．样品中的其他微弱条带则是本研究中没有设置单一物种对照的一些非优势种条带．1：环节环沟藻；2：海洋原甲藻；3：血红哈卡藻；4：锥状斯氏藻；5：环节环沟藻+血红哈卡藻；6：海洋原甲藻+锥状斯氏藻；7：环节环沟藻+血红哈卡藻+锥状斯氏藻；8：环节环沟藻+海洋原甲藻+血红哈卡藻；9：环节环沟藻+海洋原甲藻+血红哈卡藻+锥状斯氏藻．图34种赤潮甲藻PCR 扩增产物的DGGE图谱1：环节环沟藻；2：海洋原甲藻；3：血红哈卡藻；4：中肋骨条藻；5：亚历山大藻；6：双胞旋沟藻；7：环节环沟藻+海洋原甲藻+血红哈卡藻+中肋骨条藻+亚历山大藻+双胞旋沟藻；8：珠海双胞旋沟藻赤潮海水样品．图46种赤潮藻类以及珠海赤潮水样PRC 扩增产物的DGGE 图谱3讨论赤潮藻类的鉴定在赤潮监测中具有很重要的作用，特别是对某些造成严重危害的有毒有害赤潮藻类的鉴定尤为重要．在目前的监测技术中，光学显微镜分析是最为简单、快速的方法之一，但是有些赤潮藻类形态学差异不明显，很难在光学显微镜下区分．虽然扫描电子显微镜能区分赤潮微藻的细微结构，但很耗时而且需要昂贵的扫描电镜．而一些裸甲藻类由于缺乏细胞壁，固定后很容易变形，更难在显微镜下进行分类鉴定．随着分子生物学技术的发展，许多分子生物学技术已经运用到赤潮藻类种类鉴定之中，如双向电泳［16］、实时定量PCR ［17］以及PCR 与凝胶电泳结合技术等［18－20］．这些技术可以对某一特定种类进行定性鉴定，有的还可以定量分析，但它们有一个共同弱点，就是不能对环境中共存的其他藻类进行鉴定［11］．在本研究中，PCR-DGGE 技术实现了对血红哈卡藻、环节环沟藻、海洋原甲藻、锥状斯氏藻4种甲藻以及环节环沟藻、双胞旋沟藻、亚历山大藻、中肋骨条藻、血红哈卡藻、海洋原甲藻6种常见海洋赤潮藻的明显区分，并且正确分析了珠海赤潮样品中的优势种类组成．说明PCR-DGGE 技术能在环境样品中区分多种赤潮藻类，实现对赤潮原因种和优势种的正确分类．在微生物群落结构监测中，通过比较DGGE 图谱中条带的数量和亮度，可反映环境样品中微生物物种的数量和优势种群［21］．目前，PCR-DGGE 技术也已经运用于海洋浮游植物群落结构和多样性研究，该技术对形态结构相近的Pfiesteria 属的种类具有很好的区分效果，同时也能较好地鉴别赤潮样品中的主要原因种［11］．本研究中，在珠海赤潮样品的DGGE 图谱中较为清晰地出现了双胞旋沟藻、环节环沟藻、血红哈卡藻和海洋原甲藻条带（图4），而且条带亮度与细胞密度一致．样品中的骨条藻细胞密度也达到100cells /mL ，但由于骨条藻细胞微小，只在图谱中出现了微弱条带（图4第8泳道）；而骨条藻的单一条带（图4第4泳道）却很清晰，这是因为单种条带的DNA 是从实验室培养的对数生长期藻液提取，细胞密度远远高于环境样品（＞106cells /mL ），提取的DNA 量也较大，故条带较亮．但是PCR-DGGE 技术也具有其局限性，该技术不能定性定量监测样品中每一种生物物种，只有在已知种类对照条带的基础上进行比较和分析鉴定，当然也可以将DGGE 胶上的DNA 条带回收，进行二次PCR 扩增，然后测定DNA 序列，从而对赤潮生物进行准确分类，但这比较耗时，费用也较高．因此，在赤潮藻类分析鉴定中，PCR-DGGE 技术只能作为显微镜观察分析方法的补充，在大致确认了优势种之705第5期邵娟，等：常见赤潮藻类的变性梯度凝胶电泳分析后，进而对优势物种进行准确鉴定．［参考文献］［1］FISCHER S G，LERMAN L S．Length-independent sepa-ration of DNA restriction fragments in two-dimensional gelelectrophoresis［J］．Cell，1979，（16）：191－200．［2］MUYZER G，DE WAAL E C，Uitterlinden A G．Profi-ling of complex microbial populations by denaturing gradi-ent gel electrophoresis analysis of polymerase chain reac-tion-amplified genes coding for16S rRNA［J］．Appliedand Environmental Microbiology，1993，59（3）：695－700．［3］SHAO K Q，GAO G，QIN B Q，et al．Comparing sedi-ment bacterial communities in the macrophyte-dominatedand algae-dominated areas of eutrophic Lake Taihu，Chi-na［J］．Canadian Journal of Microbiology，2011，57（4）：263－272．［4］HOSSAIN M Z，SUGIYAMA S．Influences of plant litter diversity on decomposition，nutrient mineralization andsoil microbial community structure［J］．Grassland Sci-ence，2011，57（2）：72－80．［5］BELLUCCI M，CURTIS T P．Ammonia-oxidizing bacterta in wastewater［J］．Methods in Enzymology，2011，496：269－286．［6］王洋清，杨红军，李勇．DGGE技术在森林土壤微生物多样性研究中的应用［J］．生物技术通报，2011，（5）：75－79．［7］甄毓，于志刚，米铁柱．分子生物学在微藻分类研究中的应用［J］．中国海洋大学学报，2006，36（6）：875－878．［8］王鹏，梁君荣，高亚辉，等．基于核糖体DNA大亚基片断序列探讨中国东海海域原甲藻的分子分类［J］．厦门大学学报：自然科学版，2005，44（3）：437－440．［9］AN C，TAKAHASHI H，KIMURA B，et al．Comparison of PCR-DGGE and PCR-SSCP analysis for bacterial floraof Japanese traditional fermented fish products，aji-nare-zushi and iwashi-nukazuke［J］．Journal of the Science ofFood and Agriculture，2010，90（11）：1796－1801．［10］BAGWELL C E，FORMOLO M，YE Q，et al．Direct a-nalysis of sulfate reducing bacterial communities in gashydrate-impacted marine sediments by PCR-DGGE［J］．Journal of Basic Microbiology，2009，49：87－92．［11］WANG Q，DEEDS J R，PLACE A R，et al．Dinoflagel-late community analysis of a fish kill using denaturing gra-dient gel electrophoresis［J］．Harmful Algae，2005，4（1）：151－162．［12］SUN J，YU Z G，GAO Y H，et al．Phytoplankton diver-sity in the East China Sea and Yellow Sea measured byPCR-DGGE and its relationships with environmental fac-tors［J］．Chinese Journal of Oceanology and Limnology，2010，28（2）：315－322．［13］陈美军，孔繁翔，陈非洲，等．太湖不同湖区真核微型浮游生物基因多样性的研究［J］．环境科学，2008，29（3）：769－775．［14］VAN HANNEN E J，VAN AGTERVELD M P，GONS H J，et al．Revealing genetic diversity of eukaryotic micro-organisms in aquatic environments by denaturing gradientgel electrophoresis［J］．Journal of Phycology，1998，34：206－213．［15］BERGLUND J，JRGENS K，BRUCHMLLER I，et al．Use of group-specific PCR primers for identification ofchrysophytes by denaturing gradient gel electrophoresis［J］．Aquatic Microbial Ecology，2005，39（2）：171－182．［16］OLDACH D W，DELWICHE C F，JAKOBSEN K S，et al．Heteroduplex mobility assay-guided sequence discov-ery：elucidation of the small subunit（18S）rDNA se-quences of Pfiesteria piscicida and related dinoflagellatesfrom complex algal culture and environmental sampleDNA pools［J］．Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America，2000，97（8）：4303－4308．［17］BOWERS H A，TENGS T，GLASGOW J R，et al．De-velopment of real-time PCR assays for rapid detection ofPfiesteria piscicida and related dinoflagellates［J］．Ap-plied and Environmental Microbiology，2000，66（11）：4641－4648．［18］RUBLEE P A，KEMPTON J，SCHAEFER E，et al．PCR and FISH detection extends the range of Pfiesteria piscici-da in estuarine waters［J］．Virginia Journal of Science，1999，50：325－335．［19］SAITO K，DRGON T，ROBLEDO J，et al．Characteriza-tion of the rRNA locus of Pfiesteria piscicida and develop-ment of standard and quantitative PCR-based detection as-says targeted to the nontranscribed spacer［J］．Appliedand Environmental Microbiology，2002，68（11）：5394－5407．［20］ZHANG H，AND LIN S．Detection and quantification of Pfiesteria piscicida by using the mitochondrial cytochromeb gene［J］．Applied and Environmental Microbiology，2002，68（2）：989－994．［21］FROMIN N，HAMELIN J，TARNAWASKI S，et al．Sta-tistical analysis of denaturing gel electrophoresis（DGE）fingerprinting patterns［J］．Environmental Microbiology，2002，4（11）：634－643．［责任编辑：黄建军］805暨南大学学报（自然科学版）第32卷。
