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sds-page凝胶电泳原理SDS-凝胶电泳（Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis）是一种常用的蛋白质分析和分离技术。
它基于蛋白质在电场中的迁移速率与分子质量之间的关系，通过将蛋白质样品加入SDS变性和还原缓冲液，并进行蛋白质的电泳分离，可以实现蛋白质分子量的估计和蛋白质组分的分离。
以下将详细介绍SDS-凝胶电泳的原理。
一、样品处理：在进行SDS-凝胶电泳之前，需要对样品进行处理，包括蛋白质的变性和还原。
这样做的目的是将蛋白质分子展开成线性构象，使各种蛋白质以相似的形式进入凝胶，并消除了蛋白质修饰对迁移速率的影响。
1.变性：加入SDS变性缓冲液。
SDS是一种带负电荷的表面活性剂，可以与蛋白质相互作用，让蛋白质线性展开，并赋予蛋白质负电荷。
在变性缓冲液中通常还会包含甘油和十二烷基硫酸钠，以提高蛋白质的溶解度。
2. 还原：加入还原剂。
通常使用二巯基乙醇（2-mercaptoethanol）或二巯基丙烷（Dithiothreitol, DTT）等还原剂，以破坏蛋白质的二硫键，消除蛋白质中的多肽链的二级结构。
二、凝胶制备：SDS-的凝胶通常由两种不同浓度的聚丙烯酰胺（polyacrylamide）单体制备而成，其中较稀的为分离凝胶，较浓的为聚合凝胶。
聚丙烯酰胺是由甲基丙烯酰胺（acrylamide）和交联剂（常用的是二甲基丙烯酰胺）共聚合而成的。
1. 分离凝胶（stacking gel）：通常为4-15%（w/v）的聚丙烯酰胺。
分离凝胶中加入的缓冲液pH稍微较低，以产生较高的电场强度，使蛋白质迅速进入聚合凝胶。
2. 聚合凝胶（resolving gel）：通常为8-20%（w/v）的聚丙烯酰胺。
聚合凝胶中加入的缓冲液pH较高，以产生较低的电场强度，使蛋白质在其中进行分离。
三、电泳操作：1.样品加载：将处理后的蛋白质样品加载到凝胶孔上。
6 ％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳实验试剂及配制：a, 40 %丙烯酰胺单体凝胶贮存液。
丙烯酰胺38 g，甲叉双丙烯酰胺 2 g，加双蒸水定容至 100mL，过滤，贮存于棕色瓶中。
b,变性剂。
1 M NaOH 1 mL，甲酰胺 95 mL，溴酚蓝 0. 05 g，二甲苯青 0. 05 g，加双蒸水定容至100 mL。
C, 固定液。
100 mL 冰醋酸溶于双蒸水定容至1 000 mL。
d, 银染液。
硝酸银 1 g， 37 甲醛 1. 5 mL，加双蒸水定容至1000 mL。
f, 显影液。
无水碳酸钠 30 g， 37 甲醛 1. 5mL， 10 mg /mL 硫代硫酸钠 200 μL，加双蒸水定容至 1 000 mL。
DNA 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作流程6 ％变性凝胶的制备：40 %的凝胶贮存液 11. 2 mL，尿素36.36g， 5 × TBE 15mL，加双蒸水定容至 75 mL。
预冷至 4 ℃后，加入500 μL 10 过硫酸铵和 50 μL TEMD 混合均匀，灌胶。
灌胶完毕，插入样品梳，在室温下聚合 30 ～60 min。
聚合完全后，梳齿下可见二条折光线。
电泳:安装电泳装置，在电泳槽中加入1 × TBE缓冲液，使缓冲液覆盖样品孔。
拔出样品梳，用移液器吸取适量缓冲液冲洗样品孔。
打开变压器，恒定功率 60 W 预电泳 15 ～30 min。
预电泳结束后，用移液器将 DNA 样品小心注入样品孔中( 加样量为 3 ～ 5 μL) ，电泳直至带型分开。
固定:关闭电源，卸下玻璃板，剥离玻璃板，将胶板置于固定液中固定 30 min，直到指示剂颜色褪去。
漂洗:将胶板转移到双蒸水中漂洗三遍，每次 2 ～ 3 min。
染色:转移胶板至染色液中，在摇床上摇动染色 30 ～ 40 min。
显影:将胶板在双蒸水中漂洗 5 ～ 10 s 后立即放入预冷为 4 ℃～ 10 ℃的显影液中，摇动显影直到带型完全出现。
变性梯度凝胶电泳《变性梯度凝胶电泳》是一种有效的分离技术，它可以帮助科学家快速有效地分离不同类型的分子。
它和其他分离技术相比，有着独特的优势和不可替代的优势。
变性梯度凝胶电泳（DGGE）采用特殊的凝胶在不同变性环境中电泳，以有效地分离不同类型的DNA片段和蛋白质。
正常情况下，由于更多的低能量的片段的存在，特定的变性环境会吸引这些较低能量的片段，并且它们走的路程也会比较短，而其他高能量的片段则会走的路程会更长。
因此，将凝胶改变到一种低能量的片段可以吸引，而走得路程更长的片段，则可以有效地将这些片段分离开来。
DGGE的优点是它可以有效分离不同片段的DNA和蛋白质，并且可以更快地分离出更多的细小片段。
此外，由于DGGE有一个独特的低能量环境，它可以更好的区分不同的片段，而不会受到其他分离技术的限制。
另外，DGGE是一种半定量的分离技术，可以让研究者比较不同片段之间的相对含量。
除了上述优势，DGGE还具有一些缺点。
首先，由于梯度凝胶电泳系统搭建起来比较复杂，使用它来进行分离技术需要比较复杂的实验技术。
其次，由于梯度凝胶电泳系统比较复杂，对系统的调整和控制非常复杂，只有熟练的实验室人员才能处理好这些技术。
变性梯度凝胶电泳的应用非常广泛，它可以用来分离和分析不同类型的DNA片段和蛋白质，甚至可以用来检测细菌的抗药性。
它也可以用来研究基因的多样性，用于癌症和免疫系统的研究，以及对特定疾病的诊断。
最后，它也可以作为一种植物鉴定技术，用于比较不同植物类型间的分子差异。
总之，变性梯度凝胶电泳（DGGE）是一种有效的分离技术，它可以用于研究不同类型的DNA片段和蛋白质，还可以用于分析肿瘤细胞的分子结构，对特定疾病的诊断和植物鉴定。
它具有独特的低能量环境，可以更好的区分不同的片段，而不会受到其他分离技术的限制。
它具有快速、高效和半定量的优势，是研究DNA分子和蛋白质的有效分离技术。
变性梯度凝胶电泳摘要：变性梯度凝胶电泳（DenaturingGradientGelE1ectrophoresiS，DGGE）是由Fisher 和Lerman发明用于检测DNA突变的技术，其主要是基于突变型和野生型棱酸序列的不同而导致其变性浓度的差异，利用变性梯度凝胶进行分离, 该手段分辨率达一个碱基。
恒定变性凝胶电泳(CDGE)、瞬时温度梯度电泳(TTGE)和温度梯度凝胶电泳(TGGE)是由DGGE经改进而成。
它们在突变分析上都有着重要的作用。
关键词：变性梯度凝胶电泳、恒定变性凝胶电泳、瞬时温度梯度电泳、温度梯度凝胶电泳1、前言：随着结构基因组计划接近尾声，人类基因神秘的面纱已逐步揭开，GenBank中已知基因的数目也与日俱增，各种遗传病的相关基因也了解得越来越多。
但是，在找到了候选基因后，还需要在相关的遗传病病人中进行突变检测，只有找到了相应的突变。
才能真正确定该基因与疾病的关系，从而服务于临床。
变性梯度凝胶电泳就是一种很有实用价值的突变分析方法。
该方法经改进，又发展出了恒定变性凝胶电泳(constant denaturant gel elec—trophoresis，CDGE)、瞬时温度梯度电泳(temporaltemperature gradient electrophoresis，TTGE)和温度梯度凝胶电泳(temperature gradient gel elec—trophoresis，TGGE)。
现在上述方法已经广泛应用于遗传病的诊断、突变分析和肿瘤相关基因的筛查等许多方面。
2、基本原理2.1变性梯度凝胶电泳由Fisher和Izrman口3于1983年创立，以后该技术和PCR技术相结合被广泛应用于各种突变分析。
它主要是利用梯度变性胶来分离DNA片段。
电泳开始时，DNA在胶中的迁移速率仅与分子太小有关，而一旦DNA泳动到某一点时，即到达该DNA变性浓度位置时，使得DNA双链开始分开，从而大大降低了迁移速率。
变性梯度凝胶电泳（DGGE）和温度梯度凝胶电泳（TGGE）变性梯度凝胶电泳（DGGE）产品说明DGGE变性梯度凝胶电泳系统包括内置式温度控制系统、可编程控电源、梯度凝胶生成器、内置式缓冲液循环泵及搅拌桨、电泳槽、梯度生成器、制胶配件及玻璃板等。
DGGE介绍：变性梯度凝胶电泳法（denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE）分析PCR产物，如果突变发生在最先解链的DNA区域，检出率可达100％，检测片段可达1kb，最适围为100bp-500bp。
基本原理基于当双链DNA 在变性梯度凝胶中进行到与DNA变性温度一致的凝胶位置时，DNA发生部分解链，电泳迁移率下降，当解链的DNA链中有一个碱基改变时，会在不同的时间发生解链，因影响电泳速度变化的程度而被分离。
由于变性梯度凝胶电泳法是利用温度和梯度凝胶迁移率来检测，需要一套专用的电泳装置，合成的PCR引物最好在5`末端加一段40bp-50bp的GC夹，以利于检测发生于高熔点区的突变。
DGGE原理：变性梯度凝胶电泳系统(denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)的原理是使用一对特异性引物，PCR扩增微生物自然群体的16s rRNA基因，产生长度相同但序列有异的DNA片段的混合物。
然后用变性梯度凝胶电泳分离产物混合物。
变性梯度凝胶电泳DGGE胶是在6％聚丙烯酰胺胶中添加线性梯度的变性剂，变性剂的浓度由上到下，从低到高成线性梯度。
在一定温度下，在同一浓度的变性剂浓度下，序列不同的产物，其部分解链程度也不同，而产物解链程度又直接影响其电泳迁移率，结果不同的产物在凝胶上分离开来。
在引物的5’端加上40个碱基左右的G-C串可使变性梯度凝胶电泳DGGE对序列差异的分辨率提高到近100％。
所以变性梯度凝胶电泳法可用于微生物群落结构的研究、微生物种群动态的分析、富集培养物及分离物的分析、核糖体RNA同源性的分析。
变性梯度凝胶电泳（DGGE）的溶液配制、操作步骤及注意事项一、实验试剂及配置1、40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺（37.5：1）试剂用量丙烯酰胺38.93g双丙烯酰胺 1.07gMilliQ 水加到100mL 溶液采用0.45µm滤膜过滤，储存在4℃2、0％的变性储存液凝胶梯度6％8％10％12％40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺15mL 20mL 25mL 30mL 50×TAE缓冲液2mL 2mL 2mL 2mL MilliQ 水83mL 78mL 73mL 68mL总容积100mL 100mL 100mL 100mL3、100％的变性储存液凝胶梯度6％8％10％12％40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺15mL 20mL 25mL 30mL 50×TAE缓冲液2mL 2mL 2mL 2mL去离子甲酰胺40mL 40mL 40mL 40mL 尿素42g 42g 42g 42g MilliQ 水加到100mL 加到100mL 加到100mL 加到100mL4、50×TAE缓冲液试剂用量终浓度Tris碱242.0g 2M冰乙酸57.1 1M 0．5M EDTA，pH8.0 100.0mL 50mM MilliQ 水加到1000.0mL将溶液混合溶解，121℃下蒸汽灭菌20-30min,储存在室温5、银染液的配制:原液：8×固定液（250 ml）：乙醇200 ml冰乙酸10mlMilliQ 水40ml（A）：1×固定液（400 ml）：8×固定液50mlMilliQ 水350ml（B）银染溶液(400ml)：AgNO3 0.8 g8×固定液50mlMilliQ 水350ml（C）：显影剂（500ml）：NaOH 7.5gMilliQ 水500 ml甲醛 1.5ml6、10％过硫酸铵（AP）：过硫酸胺0.3g超纯水 3.0ml溶解后使用0.45µm微孔滤膜过滤，4℃保存，保存时间为1周。
PCR-DGGE技术一、实验原理变性梯度凝胶电泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）最早是Lerman 等人于20 世纪80 年代初期发明的，起初主要用来检测DNA 片段中的点突变。
Muyzer 等人在1993 年首次将其应用于微生物群落结构研究。
后来又发展出其衍生技术，温度梯度凝胶电泳（TGGE）。
该技术被广泛用于微生物分子生态学研究的各个领域，目前已经发展成为研究微生物群落结构的主要分子生物学方法之一。
双链DNA分子在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，其迁移行为取决于其分子大小和电荷。
不同长度的DNA片段能够被区分开，但同样长度的DNA片段在胶中的迁移行为一样，因此不能被区分。
DGGE技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上，加入了变性剂（尿素和甲酰胺）梯度，从而能够把同样长度但序列不同的DNA片段区分开来。
一个特定的DNA片段有其特有的序列组成，其序列组成决定了其解链区域和解链行为。
一个几百个碱基对的DNA片段一般有几个解链区域，每个解链区域有一段连续的碱基组成。
当变性剂浓度逐渐增加达到其最低的解链区浓度时，该区域这一段连续的碱基对发生解链。
当变性剂那浓度再升高依次达到其他解链区域浓度后，最高的解链区域也发生解链，从而双链DNA完全解链。
不同的双链DNA片段因为其序列组成不一样，所以其解链区域和解链区域的解链浓度也是不一样的。
当进行DGGE电泳时，一开始变性剂浓度比较小，不能使双链DNA片段最低的解链区域解链，此时DNA片段的迁移行为和在一般的聚丙烯酰胺凝胶中一样。
然而一旦DNA片段迁移到一特定位置，其变性剂浓度刚好能使双链DNA片段最低的解链区域解链时，双链DNA片段最低的解链区域立即发生解链。
部分解链的DNA片段在胶中的迁移速率会急剧下降。
因此同样长度但序列不同的DNA片段会在胶中不同位置处达到各自最低解链区域的解链变性剂浓度，因此它们会在胶中不同的位置分开。
RNA甲醛变性胶电泳提取样品的总RNA后，一般根据RNA的凝胶电泳图来判断RNA的质量。
由于RNA容易形成二级结构，因此常用甲醛变性胶来进行RNA电泳，得到的电泳图能真实反映RNA的质量状况。
一、试剂：DEPC（Sigma公司产品），MOPs（Bocherigmer公司产品），甲酰胺（Formamide，Sigma公司产品），溴酚蓝（Bromphenol Blue，Sigma公司产品）。
EDTA-Na2，氢氧化钠，醋酸钠，甲醛，甘油，分析纯，国产。
二、试剂配制：1、DEPC 水的处理：用量筒量取去离子水2L，在通风橱中，加入2ml DEPC到2升去离子水中，终浓度为0.1%的DEPC。
迅速盖上盖子，混匀，然后放在摇床中中速摇荡至少4hr，再高压灭菌。
灭菌时将瓶盖松开，15磅灭菌20min。
2、10 × FA Buffer（formaldehyde agarose buffer：200 mM的MOPs，50 mM的NaAc，10 mM的EDTA）：配制500ml，称取3.4g NaAC•3H2O放入1000ml烧杯中，加入400ml DEPC 处理过的去离子水，加入搅拌子，放在磁力搅拌器上溶解。
然后加入20.9g MOPs，放在磁力搅拌器上溶解。
再加1.86g EDTA二水二钠，放在磁力搅拌器上溶解。
用1M灭过菌的NaOH 调PH至7.0（约用NaOH 40ml），用DEPC 处理过的去离子水定容至500ml，装入棕色瓶中，写好标签，室温避光保存。
4、5 ×甲醛变性胶加样缓冲液（5×loading buffer）：配制10ml。
预先配制水饱和的溴酚蓝溶液：在1.5ml 离心管中加入约0.1mg溴酚蓝，加入1ml DEPC水溶解，充分振荡溶解，离心，可见离心管底部有溴酚蓝粉末剩余，上层液体即水饱和的溴酚蓝液。
在15ml灭菌离心管中，依次加入以下各种成分：4.0ml 10 × FA buffer3.1ml 甲酰胺2.0ml 100%的甘油720ul 37%的甲醛80ul0.5M的 EDTA （PH 8.0）16ul 水饱和的溴酚蓝100ul DEPC水混匀，分装，-20℃保存，常用放4℃保存。
RNA甲醛变性凝胶电泳
a、电泳槽用酒精棉球擦净，然后用3%H2O2浸泡10min，DEPC处理的水冲洗后封存80°C烘干；实验室用的所有玻璃器皿都要需要用0.1% DEPC处理的水溶液浸泡，37℃放置2h，然后用灭菌水淋洗数次，并于100℃干烤15min，在1.034×105Pa的压力下灭菌15min。
能经受高温烘烤的玻璃器皿可在洗净后，在150℃以上烤5h，以除去RNA酶。
b、铺胶（50ml）
琼脂糖0.75g（2.2%）
无RNase水36ml
10×MOPS 5ml
37%甲醛9ml
将琼脂糖加水用微波炉融化后，加10×MOPS，待胶冷却至60°C左右，再加甲醛和EB。
凝胶可以室温下放置1h；
c、RNA样品处理（以一条泳道为例）
10×MOPS 1.0ml
37%甲醛 3.5ml
甲酰胺10.0ml
RNA样品 4.5ml(20mg RNA)
EB 1ml
于65°C变性15min，冰浴冷却。
经此处理的RNA样品，-70°C可存放半年；
d、加4.0ml甲醛凝胶加样缓冲液（5×）；
e、加样和电泳
将凝胶预电泳10min，电压为80v。
随后加样品，以电压为80v电压进行电泳，电泳液为1×MOPS 电泳缓冲液。
直至溴酚蓝迁移至胶下游的3/4处；
f、电泳结束后，取出凝胶，用DEPC处理过的水淋洗凝胶，然后进行RNA转膜；。
