变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)new

变性梯度凝胶电泳（DGGE）的研究进展【摘要】DGGE 技术是由Fischer等于1979年提出的一种用于检测DNA 突变的电泳技术[1]，之后Myers等首次在DGGE的引物中使用“GC夹子”，使得突变检出率大大提高，从而进一步完善了该技术。

1993年，Muyzer等将DGGE 技术应用于微生物的生态学研究，并且证实了该技术在研究自然界微生物群落的种群差异性和遗传多样性方面具有突出的优越性[2]。

与传统的菌种分离培养技术及生理生化指标检测相比，DGGE技术通过对微生物群落的核酸信息进行分析，能更准确、更快速的对菌群进行鉴定，同时可鉴定出自然状态下不可培养的菌株。

由于DGGE技术具有重现性高、可靠性强和高效快捷等优点[3]，现以用于微生物群落的复杂性分析、检测微生物种群动态变化、对比细菌的富集培养及分离培养、单基因组中rRNA的多样性分析、DNA提取方法比较等方面，在废水、海洋、森林、土壤等环境样品研究以及发酵工艺、植物内生真菌研究、种群演替规律研究等领域广泛应用。

【关键词】DGGE；微生态；纯培养1.DGGE技术的原理变性梯度凝胶电泳（DGGE）是根据小片段DNA分子（1kb以下）的熔解温度不同来分析DNA分子的多样性，理论上可以检测到单个碱基替换的DNA 分子。

DNA片段在丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于自身的物理性状，熔解状态的DNA分子片段在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速度比双链DNA分子慢[4]。

当DNA片段处在变性剂浓度不断增加的凝胶系统中，随着电泳的迁移就会部分融化，达到一定变性剂浓度时DNA就会熔解为单链的分子，这些离散的碎片集中在一个比较狭窄的变形梯度范围内，这样不同的DNA分子在不同变性剂浓度下熔解，在整个电泳图谱中成楼梯式排列。

通过对比熔解状态下DNA片段的多态性，就可以推测有碱基突变或序列差异的DNA分子片段。

为了提高检出率可在DNA一端加入一个高熔点区—GC夹（GC clamp）；GC夹就是在一侧引物的5′端加上一个30～40bp的连续GC碱基，这样在PCR 产物的一侧可产生一个GC夹的高熔点区，从而使相应的部分序列处于低熔点区而便于检测分析；这样，DGGE的突变检出率可提高到接近于100%[4]。

变性梯度凝胶电泳《变性梯度凝胶电泳》是一种有效的分离技术，它可以帮助科学家快速有效地分离不同类型的分子。

它和其他分离技术相比，有着独特的优势和不可替代的优势。

变性梯度凝胶电泳（DGGE）采用特殊的凝胶在不同变性环境中电泳，以有效地分离不同类型的DNA片段和蛋白质。

正常情况下，由于更多的低能量的片段的存在，特定的变性环境会吸引这些较低能量的片段，并且它们走的路程也会比较短，而其他高能量的片段则会走的路程会更长。

因此，将凝胶改变到一种低能量的片段可以吸引，而走得路程更长的片段，则可以有效地将这些片段分离开来。

DGGE的优点是它可以有效分离不同片段的DNA和蛋白质，并且可以更快地分离出更多的细小片段。

此外，由于DGGE有一个独特的低能量环境，它可以更好的区分不同的片段，而不会受到其他分离技术的限制。

另外，DGGE是一种半定量的分离技术，可以让研究者比较不同片段之间的相对含量。

除了上述优势，DGGE还具有一些缺点。

首先，由于梯度凝胶电泳系统搭建起来比较复杂，使用它来进行分离技术需要比较复杂的实验技术。

其次，由于梯度凝胶电泳系统比较复杂，对系统的调整和控制非常复杂，只有熟练的实验室人员才能处理好这些技术。

变性梯度凝胶电泳的应用非常广泛，它可以用来分离和分析不同类型的DNA片段和蛋白质，甚至可以用来检测细菌的抗药性。

它也可以用来研究基因的多样性，用于癌症和免疫系统的研究，以及对特定疾病的诊断。

最后，它也可以作为一种植物鉴定技术，用于比较不同植物类型间的分子差异。

总之，变性梯度凝胶电泳（DGGE）是一种有效的分离技术，它可以用于研究不同类型的DNA片段和蛋白质，还可以用于分析肿瘤细胞的分子结构，对特定疾病的诊断和植物鉴定。

它具有独特的低能量环境，可以更好的区分不同的片段，而不会受到其他分离技术的限制。

它具有快速、高效和半定量的优势，是研究DNA分子和蛋白质的有效分离技术。

变性梯度凝胶电泳摘要：变性梯度凝胶电泳（DenaturingGradientGelE1ectrophoresiS，DGGE）是由Fisher 和Lerman发明用于检测DNA突变的技术，其主要是基于突变型和野生型棱酸序列的不同而导致其变性浓度的差异，利用变性梯度凝胶进行分离, 该手段分辨率达一个碱基。

恒定变性凝胶电泳(CDGE)、瞬时温度梯度电泳(TTGE)和温度梯度凝胶电泳(TGGE)是由DGGE经改进而成。

它们在突变分析上都有着重要的作用。

关键词：变性梯度凝胶电泳、恒定变性凝胶电泳、瞬时温度梯度电泳、温度梯度凝胶电泳1、前言：随着结构基因组计划接近尾声，人类基因神秘的面纱已逐步揭开，GenBank中已知基因的数目也与日俱增，各种遗传病的相关基因也了解得越来越多。

但是，在找到了候选基因后，还需要在相关的遗传病病人中进行突变检测，只有找到了相应的突变。

才能真正确定该基因与疾病的关系，从而服务于临床。

变性梯度凝胶电泳就是一种很有实用价值的突变分析方法。

该方法经改进，又发展出了恒定变性凝胶电泳(constant denaturant gel elec—trophoresis，CDGE)、瞬时温度梯度电泳(temporaltemperature gradient electrophoresis，TTGE)和温度梯度凝胶电泳(temperature gradient gel elec—trophoresis，TGGE)。

现在上述方法已经广泛应用于遗传病的诊断、突变分析和肿瘤相关基因的筛查等许多方面。

2、基本原理2.1变性梯度凝胶电泳由Fisher和Izrman口3于1983年创立，以后该技术和PCR技术相结合被广泛应用于各种突变分析。

它主要是利用梯度变性胶来分离DNA片段。

电泳开始时，DNA在胶中的迁移速率仅与分子太小有关，而一旦DNA泳动到某一点时，即到达该DNA变性浓度位置时，使得DNA双链开始分开，从而大大降低了迁移速率。

变性梯度凝胶电泳（DGGE）和温度梯度凝胶电泳（TGGE）变性梯度凝胶电泳（DGGE）产品说明DGGE变性梯度凝胶电泳系统包括内置式温度控制系统、可编程控电源、梯度凝胶生成器、内置式缓冲液循环泵及搅拌桨、电泳槽、梯度生成器、制胶配件及玻璃板等。

DGGE介绍：变性梯度凝胶电泳法（denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE）分析PCR产物，如果突变发生在最先解链的DNA区域，检出率可达100％，检测片段可达1kb，最适围为100bp-500bp。

基本原理基于当双链DNA 在变性梯度凝胶中进行到与DNA变性温度一致的凝胶位置时，DNA发生部分解链，电泳迁移率下降，当解链的DNA链中有一个碱基改变时，会在不同的时间发生解链，因影响电泳速度变化的程度而被分离。

由于变性梯度凝胶电泳法是利用温度和梯度凝胶迁移率来检测，需要一套专用的电泳装置，合成的PCR引物最好在5`末端加一段40bp-50bp的GC夹，以利于检测发生于高熔点区的突变。

DGGE原理：变性梯度凝胶电泳系统(denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)的原理是使用一对特异性引物，PCR扩增微生物自然群体的16s rRNA基因，产生长度相同但序列有异的DNA片段的混合物。

然后用变性梯度凝胶电泳分离产物混合物。

变性梯度凝胶电泳DGGE胶是在6％聚丙烯酰胺胶中添加线性梯度的变性剂，变性剂的浓度由上到下，从低到高成线性梯度。

在一定温度下，在同一浓度的变性剂浓度下，序列不同的产物，其部分解链程度也不同，而产物解链程度又直接影响其电泳迁移率，结果不同的产物在凝胶上分离开来。

在引物的5’端加上40个碱基左右的G-C串可使变性梯度凝胶电泳DGGE对序列差异的分辨率提高到近100％。

所以变性梯度凝胶电泳法可用于微生物群落结构的研究、微生物种群动态的分析、富集培养物及分离物的分析、核糖体RNA同源性的分析。

变性梯度凝胶电泳（DGGE）的溶液配制、操作步骤及注意事项一、实验试剂及配置1、40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺（37.5：1）试剂用量丙烯酰胺38.93g双丙烯酰胺 1.07gMilliQ 水加到100mL 溶液采用0.45µm滤膜过滤，储存在4℃2、0％的变性储存液凝胶梯度6％8％10％12％40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺15mL 20mL 25mL 30mL 50×TAE缓冲液2mL 2mL 2mL 2mL MilliQ 水83mL 78mL 73mL 68mL总容积100mL 100mL 100mL 100mL3、100％的变性储存液凝胶梯度6％8％10％12％40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺15mL 20mL 25mL 30mL 50×TAE缓冲液2mL 2mL 2mL 2mL去离子甲酰胺40mL 40mL 40mL 40mL 尿素42g 42g 42g 42g MilliQ 水加到100mL 加到100mL 加到100mL 加到100mL4、50×TAE缓冲液试剂用量终浓度Tris碱242.0g 2M冰乙酸57.1 1M 0．5M EDTA，pH8.0 100.0mL 50mM MilliQ 水加到1000.0mL将溶液混合溶解，121℃下蒸汽灭菌20-30min,储存在室温5、银染液的配制:原液：8×固定液（250 ml）：乙醇200 ml冰乙酸10mlMilliQ 水40ml（A）：1×固定液（400 ml）：8×固定液50mlMilliQ 水350ml（B）银染溶液(400ml)：AgNO3 0.8 g8×固定液50mlMilliQ 水350ml（C）：显影剂（500ml）：NaOH 7.5gMilliQ 水500 ml甲醛 1.5ml6、10％过硫酸铵（AP）：过硫酸胺0.3g超纯水 3.0ml溶解后使用0.45µm微孔滤膜过滤，4℃保存，保存时间为1周。

变性梯度凝胶电泳DGGE刘琳 1131428 环境科学一、 实验目的1． 学习掌握变性梯度凝胶电泳的原理和方法。

2． 练习变性梯度凝胶电泳的操作步骤。

3． 分析并掌握变性梯度凝胶电泳的思路，并了解其在微生物群落研究中的地位。

二、 实验原理双链DNA 分子在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，其迁移行为决定于其分子大小和电荷。

不同长度的DNA 片段能够被区分开，但同样长度的DNA 片段在凝胶中的迁移行为一样，因此不能被区分。

DGGE 技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上，加入了变性剂（尿素和甲酰胺）梯度，从而能够把同样长度但序列不同的DNA 片段区分开来。

不同的双链DNA 片段因为其序列组成不一样，所以其解链区域及各解链区域的解链温度也是不一样的。

同样长度但序列不同的DNA 片段会在胶中不同位置处达到各自最低解链区域的解链温度，因此它们会在胶中的不同位置处发生部分解链导致迁移速率大大下降，从而在胶中被区分开来。

然而，一旦温度（或变性剂浓度）达到DNA 片段最高的解链区域温度时，DNA 片段会完全解链，成为单链DNA分子，此时它们又能在胶中继续迁移。

因此，如果不同DNA 片段的序列差异发生在最高的解链区域时，这些片段就不能被区分开来。

DNA 片段在DGGE 胶中的迁移行为（如下图）：变性剂LowHigh在DNA 片段的一端加入一段富含GC 的DNA 片段（一般30-50个碱基对），使DNA 片段最高的解链区域在GC 夹子这一段序列处，它的解链温度很高，可以防止DNA 片段在DGGE/TGGE 胶中完全解链。

当加了GC 夹子后，DNA 片段中基本上每个碱基处的序列差异都能被区分开（Myers, 1985)。

DGGE 有两种电泳形式：垂直电泳和水平电泳。

垂直电泳是为了确定变性剂梯度；而水平电泳则是对比分析不同样品的微生物差异。

本次试验做的是水平电泳，主要对比分析不同样品的微生物差异。

三、 实验器材与药剂器材：DGGE system (D-Code, Bio-Rad)、移液管、移液枪、枪头、制胶设备、30ml 针筒、聚乙烯细管、电泳仪试剂：16s rDNA V3区PCR 扩增产物、胶浓度为8%变性剂浓度分别为0%和90%丙烯酰胺胶、50×TAE buffer、去离子甲酰胺、尿素、去离子水、10%过硫酸铵(Aps)、TEMED 、sDNA 染料 变性剂Low high四、实验步骤1．首先按照实验要求将50x TAE buffer稀释为1×TAE buffer，并利用90%和0%的变性胶分别配置15.5ml的35%和55%的变性胶溶液。

变性梯度凝胶电泳变性梯度凝胶电泳原著：Jeroen H. Roelfsema and Dorien J. M. Peters1.翻译：小高1.简介变性梯度凝胶电泳是人们多年来广泛使用的一种健全的检测点突变的方法（1）。

它是一种基于PCR的方法，其原理是，与野生型基因相比，改变了PCR产物中突变序列的解链温度。

通过PCR，致使DNA两个基因其中一个中的点突变变成不同的DNA的混合体。

PCR 后的产物中包括野生型基因和突变型基因。

即同源二聚体。

然而这两种产物的解链温度差别不大。

在PCR反应的最后一个循环，形成另外一种产物，即异源双链DNA，它包括一条野生型的链和一条突变的链。

DGGE的原理就在于同源PCR产物的解链温度远远低于异源PCR的产物，因为异源双链有一个错配(see Fig. 1)。

为了看到同源和异源DNA的解链温度之间的差别，只要让其在含有变性剂尿素和甲酰胺的丙烯酰胺梯度凝胶上电泳即可。

仅仅靠这些变性剂本身是不够的。

另外，跑电泳的胶的温度也比较高，通常在60℃。

电泳过程中，PCR产物在变性以前一直保持双链DNA的形式。

一旦变性后，PCR产物将以单链DNA的形式继续跑，但是片段则会保留在变性的地方。

为了达到这个目的，需要连上一个所谓的GC夹子以阻止完全变性。

这个GC夹子是由40-60个单纯的鸟嘌呤和胞嘧啶核苷酸构成的一条链，然后连接在其中的一种PCR引物上。

加上GC夹子进行PCR后的产物其一端具有很高的变性温度。

因此，PCR产物在DGGE的胶上将部分变性。

GC夹子保持双链。

其余的片段形成“Y”形继续保留在胶上原来的地方。

2.操作步骤2.1.设计PCR引物对于DGGE来说，用于筛选点突变的PCR引物的解链特性是很关键的。

当片段到达凝胶的临界点时，应该及时地变性，而不是在一端开始随着电泳的进行逐渐的慢慢的变性。

这种慢性解链会形成模糊的条带或者斑点，将导致很难检测出突变。

因为解链特性对于实验的成败至关重要，所以选取用来扩增目标产物的引物时必须格外小心。

【实验目的】掌握变性梯度凝胶电泳检测新的突变，以及测定高度多态基因的基因型的技术方法。

【实验原理】在现代遗传学中DNA 序列突变的分析占有十分重要的地位。

由于在较大DNA 序列中检测一个细微的突变非常困难，因而现在人们建立了几种方法来解决这一难题。

变性梯度凝胶电泳(DGGE)能把长度相同而核苷酸顺序不同的双链DNA 片段分开。

这种方法利用了DNA 分子从双螺旋型变成局部变性型时电泳迁移率会下降的现象。

不同的DNA 片段发生这种变化所需梯度不同。

DGGE 的凝胶中沿电场方向变性剂(甲醛和尿素)含量递增，当DNA 片段通过这种变性剂递增的凝胶时，不同分子的电泳迁移率在不同区域会发生降低。

这就可使核苷酸顺序不同DNA 片段分开。

此方法可作为测序的初始步骤在杂合个体中分离等位基因。

许多研究表明变性递度凝胶电泳分离能力很强，它可以把相差仅1bp 的DNA 片段分开。

【仪器、材料与试剂】1.50×TAE 缓冲液(2mol/LTris 乙酸盐，0.05mol/L EDTA pH8.0)1L 体积：242gTris碱，57.1mL 冰醋酸，100mL 0.5mol/L EDTA pH8.0，加水至lL。

2.丙烯酰胺贮存液：40%丙烯酰胺(38:2 丙烯酰胺:双丙烯酰胺)。

3.过硫酸铵贮存液(10%)：10mL 配制：1g 过硫酸铵加水至10mL。

TEMED(N，N，N＇，N＇，—四甲基乙二胺)。

（生物秀实验频道）4.变性剂贮存液：(0%)6%丙烯酰胺TAE 溶液。

250mL 溶液：37.5mL 丙烯酰胺贮存液，5mL50×TAE 缓冲液，加水至250mL，过滤和排气。

5.变性剂贮存液(100%)：6%丙烯酰胺，7mol/L 尿素，40%甲醛TAE 溶液。

250mL配制：37.5mL 丙烯酰胺贮存液，5mL50×TAE 缓冲液，105g 尿素，100mL 甲醛，加水至750mL，过滤并排气。

PCR-DGGE实验原理和操作步骤【实验目的】1．了解PCR-DGGE技术的原理。

2．了解并熟悉PCR-DGGE技术的步骤。

【实验原理】变性梯度凝胶电泳（DGGE）是一种根据DNA片段的熔解性质而使之分离的凝胶系统。

核酸的双螺旋结构在一定条件下可以解链，称之为变性。

核酸50%发生变性时的温度称为熔解温度（Tm）。

Tm值主要取决于DNA分子中GC含量的多少。

DGGE将凝胶设置在双重变性条件下：温度50~60 ℃，变性剂0~100%。

当一双链DNA片段通过一变性剂浓度呈梯度增加的凝胶时，此片段迁移至某一点变性剂浓度恰好相当于此段DNA的低熔点区的Tm 值，此区便开始熔解，而高熔点区仍为双链。

这种局部解链的DNA分子迁移率发生改变，达到分离的效果。

Tm的改变依赖于DNA序列，即使一个碱基的替代就可引起Tm值的升高和降低。

因此，DGGE可以检测DNA分子中的任何一种单碱基的替代、移码突变以及少于10个碱基的缺失突变。

为了提高 DGGE的突变检出率，可以人为地加入一个高熔点区——GC夹。

GC夹（GC clamp）就是在一侧引物的5′端加上一个30~40bp的GC结构，这样在PCR产物的一侧可产生一个高熔点区，使相应的感兴趣的序列处于低熔点区而便于分析。

因此，DG GE的突变检出率可提高到接近于100%。

作为一种突变检测技术，DGGE具有如下的优点：（1）突变检出率高。

DGGE的突变检出率为99%以上。

（2）检测片段长度可达1kb，尤其适用于100~500bp的片段。

（3）非同位素性。

DGGE不需同位素掺入，可避免同位素污染及对人体造成的伤害。

（4）操作简便、快速。

DGGE一般在24小时内即可获得结果。

（5）重复性好。

但是，该方法需要特殊的仪器，而且合成带GC夹的引物也比较昂贵。

【实验用品】1．PCR扩增仪；变性梯度凝胶电泳仪；凝胶成像及分析系统；紫外透射仪；高速离心机；电泳仪；电泳槽。

2．尿素、去离子甲酰胺、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、琼脂糖3．微量加样器（200μl，20μl）；Tip头（200μl，20μl）。

实验四变性梯度凝胶电泳（DGGE）和温度梯度凝胶电泳（TGGE）一、实验原理变性梯度凝胶电泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）最初是Lerman等人于20世纪80年代初期发明的，起初主要用来检测DNA片段中的点突变(20, 42, 52, 53)。

Muyzer等人在1993年首次将其应用于微生物群落结构研究 (50)。

后来又发展出其衍生技术，温度梯度凝胶电泳（temperature gradient gel electrophoresis，TGGE） (49)。

此后十年间，该技术被广泛用于微生物分子生态学研究的各个领域，目前已经发展成为研究微生物群落结构的主要分子生物学方法之一 (49, 51)。

1．原理双链DNA分子在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，其迁移行为决定于其分子大小和电荷。

不同长度的DNA片段能够被区分开，但同样长度的DNA片段在胶中的迁移行为一样，因此不能被区分。

DGGE/TGGE技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上，加入了变性剂（尿素和甲酰胺）梯度或是温度梯度，从而能够把同样长度但序列不同的DNA片段区分开来。

一个特定的DNA片段有其特有的序列组成，其序列组成决定了其解链区域(melting domain, MD)和解链行为(melting behavior) (20, 42)。

一个几百个碱基对的DNA片段一般有几个解链区域，每个解链区域有一段连续的碱基对组成（图1）。

当温度逐渐升高（或是变性剂浓度逐渐增加）达到其最低的解链区域温度时，该区域这一段连续的碱基对发生解链。

当温度再升高依次达到各其他解链区域温度时，这些区域也依次发生解链。

直到温度达到最高的解链区域温度后，最高的解链区域也发生解链，从而双链DNA完全解链。

（图1显示的是一个234bp长的DNA片段的解链区域，横坐标是该DNA片段的序列，依次从第一个碱基到第234个碱基；纵坐标是解链温度。

变性梯度凝胶电泳Denaturing Gradient Gel Electrophoresis变性梯度凝胶电泳(Denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)的方法应用于探究微生物的多样性，使得DGGE技术迅速成为了一项简单、可行的微生物多样性检测手段。

DGGE技术是根据长度相同但序列不同的DNA片段特点，在含有变性剂梯度的凝胶上，因其解链的变性浓度的不同而导致迁移率不同的原理而将DNA片段分离开的一种方法。

理论上DGGE能将仅存在一个碱基差异的DNA片段分开，而实际上，其分辩率较低且操作重复性差使得该方法仍然存在一些问题。

更重要的是，随着科技的突飞猛进，DGGE技术已逐渐被高通量测序所取代。

一、试剂与仪器1. 材料1.1 实验试剂表1.1 实验试剂一览表Table 1.1 The list of reagents试剂来源或生产公司EDTA Genebase®，Genebase Gene-Tech公司去离子甲酰胺分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司十二烷基磺酸钠Genebase®，Genebase Gene-Tech公司Tris碱Genebase®，Genebase Gene-Tech公司APS Genebase®，Genebase Gene-Tech公司TEMED Genebase®，Genebase Gene-Tech公司N，N’甲叉双丙烯酰胺Genebase®，Genebase Gene-Tech公司Gel-red染色液Biouim，美国氯化钠，二氯甲烷，甲醇等江苏永华精细化学品有限公司1.2 主要仪器设备表3.2 实验仪器一览表Table 3.2 The list of instruments and equipments仪器名称来源或出厂公司DGGE电泳仪Bio-Rad公司，美国EL 104电子天平梅特勒-托利多仪器有限公司pH计梅特勒-托利多仪器有限公司-20℃低温冰箱海尔公司Milli-Q纯水系统Millipore公司，美国G-560E型旋涡混合器Eppendorf公司，德国5810D型低温冷冻离心机Eppendorf公司，德国全套微量移液器Eppendorf公司，德国1.3 相关溶剂及试剂配制(1) EDTA溶液(0.5 M，pH 8.0)：取1000 mL的烧杯加约800 mL超纯水，称取186.1 g EDTA逐量加入并用磁力搅拌器搅拌加速其溶解，随后用NaOH调节溶液的pH值至8.0，然后用1000 mL的容量瓶定容至1000 mL。

变性梯度凝胶电泳(DGGE)溶液的配制：40%变性浓度的丙烯酰胺Acrylamide/甲叉丙烯酰胺母液:丙烯酰胺97.325 g甲叉丙烯酰胺溶液 2.675 gDDW 定容至250 mL0.45μm滤膜过滤，4℃保存20%变性浓度的胶溶液:40%变性浓度的母液100 mL50⨯TAE 10 mL甲酰胺40 mL尿素42 gDDW至500 mL4℃保存，戴手套操作30%变性浓度的胶溶液:40%变性浓度的母液100 mL50⨯TAE 10 mL甲酰胺60 mL尿素63 gDDW至500 mL4℃保存，戴手套操作60%变性浓度的胶溶液:40%变性浓度的母液100 mL50⨯TAE 10 mL甲酰胺120 mL尿素126 gDDW至500 mL4℃保存，戴手套操作70%变性浓度的胶溶液:40%变性浓度的母液100 mL50 TAE 10 mL甲酰胺140 mL尿素147 gDDW至500 mL4℃保存，戴手套操作变性梯度凝胶电泳制胶(DGGE)1)选择两块匹配的玻璃板（一大一小），将大玻璃板平放于桌面上，左右边缘各平铺一块垫片（注意垫片成套使用，凹口相对位于玻璃板上部），将小玻璃板压于垫片上，用制胶夹板固定玻璃板后立于制胶器上调整位，松开夹板上的旋钮调整两块玻璃板的水平位置至底部平齐，调整左右垫片至垂直，调整好后将旋钮拧紧；2)将软垫片平铺至制胶位，将调整好的制胶板从调整位转移至制胶位（共有两个制胶位可同时制胶两块），左右手同时操作底部白色旋钮，先使有柄端竖直向上左右手同时用力将旋钮插入制胶夹板侧面夹缝中，然后旋转手柄180°将制胶板固定在软垫片上；3)分别配制好高低变性浓度的丙烯酰胺溶液各16 ml，加入39 μL AP（过硫酸铵溶液，10% w/v）及40 μL TEMED并立即混匀，将溶液吸入对应的带软管的注射器中，排除注射器及软管中的气泡，将注射器固定至变性梯度生成仪上（注意高低浓度固定位置的选择！）；低浓度胶：20%尿素/8%丙烯酰胺16 mLTEMED 40 μL10%AP 40 μL高浓度胶：60%尿素/8%丙烯酰胺16 mLTEMED 40 μL10%AP 40 μL4）将两个注射器上的软管和一段带硬塑接口的软管连接到三通接口上，将硬塑接口固定至玻璃板的中部，缓慢轮转变性梯度生成仪使丙烯酰胺溶液缓缓注入玻璃夹缝中（注意接口一定要在玻璃板中央，灌注速度不宜过快）；5）待溶液全部注入玻璃夹缝后，将匹配的梳子插入玻璃板夹缝的中央（注意动作要轻以防丙烯酰胺溶液溢出），等待丙烯酰胺溶液凝固成胶；6）往电泳槽中加入缓冲液（1×TAE）至RUN刻度；7）将制胶板固定到承载核上放入电泳槽中，注意左右平衡，承载核上部制胶板之间需补满缓冲液；8）加盖温度控制箱，接通加热电源，加热缓冲液（缓冲液低于FILL刻度时禁止加热！），此时不需开启PUMP功能；9）缓冲液达到所需温度停止加热，拔出电源插头，移开温度控制箱，微量注射器上样；10）加盖温度控制箱继续加热缓冲液至所需温度，接通电泳电源开始电泳；Step1：30 V/500 mA/250 W 15 minStep2：130 V/500 mA/250 W 4 h 30 min11）电泳结束后停止加热及电泳电源，移开温度控制箱，取出承载核卸下制胶板，剥离下聚丙烯酰胺凝胶置于EB（0.5 μg/ml）溶液中染色15 min，AlpHa Innotech(San Leandro, California)凝胶成像系统照像。

变性梯度凝胶电泳变性梯度凝胶电泳是一种比较新型的电泳技术，它可以有效地用于分离和分析复杂的蛋白质组。

变性梯度凝胶电泳的原理是建立一种特殊的梯度，使用不同的离子强度来分离和收集分子。

由于离子强度是一个逐步变化的量，可以提供不同的环境条件，从而形成分子的各种簇，并将其运转至电泳柱的不同部位。

变性梯度凝胶电泳技术主要用于蛋白质分离和分析。

它可以更好地分离具有相似分子量的蛋白质，因为它可以根据溶解度，分子大小和芳香性等其他因素来调节电泳条件来实现有效的分离。

因此，变性梯度凝胶电泳技术可以用于解决较难分离的蛋白质，因为它可以根据空间分布来分辨蛋白质，并且实验结果更精确。

另外，变性梯度凝胶电泳可以应对大量的样品，更有效地分离出病毒感染的蛋白质，便于研究蛋白质的分子结构、活性和功能等相关信息。

变性梯度凝胶电泳的实验操作非常简单，准备一个用于变性梯度凝胶电泳的实验室，需要一台变性梯度凝胶电泳仪，并准备一种特殊的凝胶，可以在改变离子强度的基础上建立梯度。

然后将样品和标准样品混合后，放入变性梯度凝胶电泳仪中，开始电泳，随着离子强度的不断改变，蛋白质分子会呈现出不同的分布状态，最后在合适的时间内收集电泳带，完成变性梯度凝胶电泳的实验。

由于变性梯度凝胶电泳技术是一种比较新型的分析技术，所以也可以用于核酸分离和定量鉴定。

这种技术可以检测DNA和RNA的结构和数目，并可以调整梯度条件以更好地分离反应物，以达到最佳测定结果。

此外，变性梯度凝胶电泳技术还可以用于生物分子组学研究，以充分发挥它的作用。

总的来说，变性梯度凝胶电泳是一种新型的分析技术，可用于蛋白质和核酸的分离、定量和分析，以及组学研究，具有习惯性，灵敏度和效率高等特点，已经成为了当今生物分析中常用的分析手段。