变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)new

变性梯度凝胶电泳（DGGE）的研究进展【摘要】DGGE 技术是由Fischer等于1979年提出的一种用于检测DNA 突变的电泳技术[1]，之后Myers等首次在DGGE的引物中使用“GC夹子”，使得突变检出率大大提高，从而进一步完善了该技术。

1993年，Muyzer等将DGGE 技术应用于微生物的生态学研究，并且证实了该技术在研究自然界微生物群落的种群差异性和遗传多样性方面具有突出的优越性[2]。

与传统的菌种分离培养技术及生理生化指标检测相比，DGGE技术通过对微生物群落的核酸信息进行分析，能更准确、更快速的对菌群进行鉴定，同时可鉴定出自然状态下不可培养的菌株。

由于DGGE技术具有重现性高、可靠性强和高效快捷等优点[3]，现以用于微生物群落的复杂性分析、检测微生物种群动态变化、对比细菌的富集培养及分离培养、单基因组中rRNA的多样性分析、DNA提取方法比较等方面，在废水、海洋、森林、土壤等环境样品研究以及发酵工艺、植物内生真菌研究、种群演替规律研究等领域广泛应用。

【关键词】DGGE；微生态；纯培养1.DGGE技术的原理变性梯度凝胶电泳（DGGE）是根据小片段DNA分子（1kb以下）的熔解温度不同来分析DNA分子的多样性，理论上可以检测到单个碱基替换的DNA 分子。

DNA片段在丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于自身的物理性状，熔解状态的DNA分子片段在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速度比双链DNA分子慢[4]。

当DNA片段处在变性剂浓度不断增加的凝胶系统中，随着电泳的迁移就会部分融化，达到一定变性剂浓度时DNA就会熔解为单链的分子，这些离散的碎片集中在一个比较狭窄的变形梯度范围内，这样不同的DNA分子在不同变性剂浓度下熔解，在整个电泳图谱中成楼梯式排列。

通过对比熔解状态下DNA片段的多态性，就可以推测有碱基突变或序列差异的DNA分子片段。

为了提高检出率可在DNA一端加入一个高熔点区—GC夹（GC clamp）；GC夹就是在一侧引物的5′端加上一个30～40bp的连续GC碱基，这样在PCR 产物的一侧可产生一个GC夹的高熔点区，从而使相应的部分序列处于低熔点区而便于检测分析；这样，DGGE的突变检出率可提高到接近于100%[4]。

变性梯度凝胶电泳《变性梯度凝胶电泳》是一种有效的分离技术，它可以帮助科学家快速有效地分离不同类型的分子。

它和其他分离技术相比，有着独特的优势和不可替代的优势。

变性梯度凝胶电泳（DGGE）采用特殊的凝胶在不同变性环境中电泳，以有效地分离不同类型的DNA片段和蛋白质。

正常情况下，由于更多的低能量的片段的存在，特定的变性环境会吸引这些较低能量的片段，并且它们走的路程也会比较短，而其他高能量的片段则会走的路程会更长。

因此，将凝胶改变到一种低能量的片段可以吸引，而走得路程更长的片段，则可以有效地将这些片段分离开来。

DGGE的优点是它可以有效分离不同片段的DNA和蛋白质，并且可以更快地分离出更多的细小片段。

此外，由于DGGE有一个独特的低能量环境，它可以更好的区分不同的片段，而不会受到其他分离技术的限制。

另外，DGGE是一种半定量的分离技术，可以让研究者比较不同片段之间的相对含量。

除了上述优势，DGGE还具有一些缺点。

首先，由于梯度凝胶电泳系统搭建起来比较复杂，使用它来进行分离技术需要比较复杂的实验技术。

其次，由于梯度凝胶电泳系统比较复杂，对系统的调整和控制非常复杂，只有熟练的实验室人员才能处理好这些技术。

变性梯度凝胶电泳的应用非常广泛，它可以用来分离和分析不同类型的DNA片段和蛋白质，甚至可以用来检测细菌的抗药性。

它也可以用来研究基因的多样性，用于癌症和免疫系统的研究，以及对特定疾病的诊断。

最后，它也可以作为一种植物鉴定技术，用于比较不同植物类型间的分子差异。

总之，变性梯度凝胶电泳（DGGE）是一种有效的分离技术，它可以用于研究不同类型的DNA片段和蛋白质，还可以用于分析肿瘤细胞的分子结构，对特定疾病的诊断和植物鉴定。

它具有独特的低能量环境，可以更好的区分不同的片段，而不会受到其他分离技术的限制。

它具有快速、高效和半定量的优势，是研究DNA分子和蛋白质的有效分离技术。

变性梯度凝胶电泳摘要：变性梯度凝胶电泳（DenaturingGradientGelE1ectrophoresiS，DGGE）是由Fisher 和Lerman发明用于检测DNA突变的技术，其主要是基于突变型和野生型棱酸序列的不同而导致其变性浓度的差异，利用变性梯度凝胶进行分离, 该手段分辨率达一个碱基。

恒定变性凝胶电泳(CDGE)、瞬时温度梯度电泳(TTGE)和温度梯度凝胶电泳(TGGE)是由DGGE经改进而成。

它们在突变分析上都有着重要的作用。

关键词：变性梯度凝胶电泳、恒定变性凝胶电泳、瞬时温度梯度电泳、温度梯度凝胶电泳1、前言：随着结构基因组计划接近尾声，人类基因神秘的面纱已逐步揭开，GenBank中已知基因的数目也与日俱增，各种遗传病的相关基因也了解得越来越多。

但是，在找到了候选基因后，还需要在相关的遗传病病人中进行突变检测，只有找到了相应的突变。

才能真正确定该基因与疾病的关系，从而服务于临床。

变性梯度凝胶电泳就是一种很有实用价值的突变分析方法。

该方法经改进，又发展出了恒定变性凝胶电泳(constant denaturant gel elec—trophoresis，CDGE)、瞬时温度梯度电泳(temporaltemperature gradient electrophoresis，TTGE)和温度梯度凝胶电泳(temperature gradient gel elec—trophoresis，TGGE)。

现在上述方法已经广泛应用于遗传病的诊断、突变分析和肿瘤相关基因的筛查等许多方面。

2、基本原理2.1变性梯度凝胶电泳由Fisher和Izrman口3于1983年创立，以后该技术和PCR技术相结合被广泛应用于各种突变分析。

它主要是利用梯度变性胶来分离DNA片段。

电泳开始时，DNA在胶中的迁移速率仅与分子太小有关，而一旦DNA泳动到某一点时，即到达该DNA变性浓度位置时，使得DNA双链开始分开，从而大大降低了迁移速率。

变性梯度凝胶电泳（DGGE）和温度梯度凝胶电泳（TGGE）变性梯度凝胶电泳（DGGE）产品说明DGGE变性梯度凝胶电泳系统包括内置式温度控制系统、可编程控电源、梯度凝胶生成器、内置式缓冲液循环泵及搅拌桨、电泳槽、梯度生成器、制胶配件及玻璃板等。

DGGE介绍：变性梯度凝胶电泳法（denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE）分析PCR产物，如果突变发生在最先解链的DNA区域，检出率可达100％，检测片段可达1kb，最适围为100bp-500bp。

基本原理基于当双链DNA 在变性梯度凝胶中进行到与DNA变性温度一致的凝胶位置时，DNA发生部分解链，电泳迁移率下降，当解链的DNA链中有一个碱基改变时，会在不同的时间发生解链，因影响电泳速度变化的程度而被分离。

由于变性梯度凝胶电泳法是利用温度和梯度凝胶迁移率来检测，需要一套专用的电泳装置，合成的PCR引物最好在5`末端加一段40bp-50bp的GC夹，以利于检测发生于高熔点区的突变。

DGGE原理：变性梯度凝胶电泳系统(denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)的原理是使用一对特异性引物，PCR扩增微生物自然群体的16s rRNA基因，产生长度相同但序列有异的DNA片段的混合物。

然后用变性梯度凝胶电泳分离产物混合物。

变性梯度凝胶电泳DGGE胶是在6％聚丙烯酰胺胶中添加线性梯度的变性剂，变性剂的浓度由上到下，从低到高成线性梯度。

在一定温度下，在同一浓度的变性剂浓度下，序列不同的产物，其部分解链程度也不同，而产物解链程度又直接影响其电泳迁移率，结果不同的产物在凝胶上分离开来。

在引物的5’端加上40个碱基左右的G-C串可使变性梯度凝胶电泳DGGE对序列差异的分辨率提高到近100％。

所以变性梯度凝胶电泳法可用于微生物群落结构的研究、微生物种群动态的分析、富集培养物及分离物的分析、核糖体RNA同源性的分析。

变性梯度凝胶电泳（DGGE）的溶液配制、操作步骤及注意事项一、实验试剂及配置1、40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺（37.5：1）试剂用量丙烯酰胺38.93g双丙烯酰胺 1.07gMilliQ 水加到100mL 溶液采用0.45µm滤膜过滤，储存在4℃2、0％的变性储存液凝胶梯度6％8％10％12％40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺15mL 20mL 25mL 30mL 50×TAE缓冲液2mL 2mL 2mL 2mL MilliQ 水83mL 78mL 73mL 68mL总容积100mL 100mL 100mL 100mL3、100％的变性储存液凝胶梯度6％8％10％12％40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺15mL 20mL 25mL 30mL 50×TAE缓冲液2mL 2mL 2mL 2mL去离子甲酰胺40mL 40mL 40mL 40mL 尿素42g 42g 42g 42g MilliQ 水加到100mL 加到100mL 加到100mL 加到100mL4、50×TAE缓冲液试剂用量终浓度Tris碱242.0g 2M冰乙酸57.1 1M 0．5M EDTA，pH8.0 100.0mL 50mM MilliQ 水加到1000.0mL将溶液混合溶解，121℃下蒸汽灭菌20-30min,储存在室温5、银染液的配制:原液：8×固定液（250 ml）：乙醇200 ml冰乙酸10mlMilliQ 水40ml（A）：1×固定液（400 ml）：8×固定液50mlMilliQ 水350ml（B）银染溶液(400ml)：AgNO3 0.8 g8×固定液50mlMilliQ 水350ml（C）：显影剂（500ml）：NaOH 7.5gMilliQ 水500 ml甲醛 1.5ml6、10％过硫酸铵（AP）：过硫酸胺0.3g超纯水 3.0ml溶解后使用0.45µm微孔滤膜过滤，4℃保存，保存时间为1周。

变性梯度凝胶电泳DGGE刘琳 1131428 环境科学一、 实验目的1． 学习掌握变性梯度凝胶电泳的原理和方法。

2． 练习变性梯度凝胶电泳的操作步骤。

3． 分析并掌握变性梯度凝胶电泳的思路，并了解其在微生物群落研究中的地位。

二、 实验原理双链DNA 分子在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，其迁移行为决定于其分子大小和电荷。

不同长度的DNA 片段能够被区分开，但同样长度的DNA 片段在凝胶中的迁移行为一样，因此不能被区分。

DGGE 技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上，加入了变性剂（尿素和甲酰胺）梯度，从而能够把同样长度但序列不同的DNA 片段区分开来。

不同的双链DNA 片段因为其序列组成不一样，所以其解链区域及各解链区域的解链温度也是不一样的。

同样长度但序列不同的DNA 片段会在胶中不同位置处达到各自最低解链区域的解链温度，因此它们会在胶中的不同位置处发生部分解链导致迁移速率大大下降，从而在胶中被区分开来。

然而，一旦温度（或变性剂浓度）达到DNA 片段最高的解链区域温度时，DNA 片段会完全解链，成为单链DNA分子，此时它们又能在胶中继续迁移。

因此，如果不同DNA 片段的序列差异发生在最高的解链区域时，这些片段就不能被区分开来。

DNA 片段在DGGE 胶中的迁移行为（如下图）：变性剂LowHigh在DNA 片段的一端加入一段富含GC 的DNA 片段（一般30-50个碱基对），使DNA 片段最高的解链区域在GC 夹子这一段序列处，它的解链温度很高，可以防止DNA 片段在DGGE/TGGE 胶中完全解链。

当加了GC 夹子后，DNA 片段中基本上每个碱基处的序列差异都能被区分开（Myers, 1985)。

DGGE 有两种电泳形式：垂直电泳和水平电泳。

垂直电泳是为了确定变性剂梯度；而水平电泳则是对比分析不同样品的微生物差异。

本次试验做的是水平电泳，主要对比分析不同样品的微生物差异。

三、 实验器材与药剂器材：DGGE system (D-Code, Bio-Rad)、移液管、移液枪、枪头、制胶设备、30ml 针筒、聚乙烯细管、电泳仪试剂：16s rDNA V3区PCR 扩增产物、胶浓度为8%变性剂浓度分别为0%和90%丙烯酰胺胶、50×TAE buffer、去离子甲酰胺、尿素、去离子水、10%过硫酸铵(Aps)、TEMED 、sDNA 染料 变性剂Low high四、实验步骤1．首先按照实验要求将50x TAE buffer稀释为1×TAE buffer，并利用90%和0%的变性胶分别配置15.5ml的35%和55%的变性胶溶液。

变性梯度凝胶电泳变性梯度凝胶电泳原著：Jeroen H. Roelfsema and Dorien J. M. Peters1.翻译：小高1.简介变性梯度凝胶电泳是人们多年来广泛使用的一种健全的检测点突变的方法（1）。

它是一种基于PCR的方法，其原理是，与野生型基因相比，改变了PCR产物中突变序列的解链温度。

通过PCR，致使DNA两个基因其中一个中的点突变变成不同的DNA的混合体。

PCR 后的产物中包括野生型基因和突变型基因。

即同源二聚体。

然而这两种产物的解链温度差别不大。

在PCR反应的最后一个循环，形成另外一种产物，即异源双链DNA，它包括一条野生型的链和一条突变的链。

DGGE的原理就在于同源PCR产物的解链温度远远低于异源PCR的产物，因为异源双链有一个错配(see Fig. 1)。

为了看到同源和异源DNA的解链温度之间的差别，只要让其在含有变性剂尿素和甲酰胺的丙烯酰胺梯度凝胶上电泳即可。

仅仅靠这些变性剂本身是不够的。

另外，跑电泳的胶的温度也比较高，通常在60℃。

电泳过程中，PCR产物在变性以前一直保持双链DNA的形式。

一旦变性后，PCR产物将以单链DNA的形式继续跑，但是片段则会保留在变性的地方。

为了达到这个目的，需要连上一个所谓的GC夹子以阻止完全变性。

这个GC夹子是由40-60个单纯的鸟嘌呤和胞嘧啶核苷酸构成的一条链，然后连接在其中的一种PCR引物上。

加上GC夹子进行PCR后的产物其一端具有很高的变性温度。

因此，PCR产物在DGGE的胶上将部分变性。

GC夹子保持双链。

其余的片段形成“Y”形继续保留在胶上原来的地方。

2.操作步骤2.1.设计PCR引物对于DGGE来说，用于筛选点突变的PCR引物的解链特性是很关键的。

当片段到达凝胶的临界点时，应该及时地变性，而不是在一端开始随着电泳的进行逐渐的慢慢的变性。

这种慢性解链会形成模糊的条带或者斑点，将导致很难检测出突变。

因为解链特性对于实验的成败至关重要，所以选取用来扩增目标产物的引物时必须格外小心。

【实验目的】掌握变性梯度凝胶电泳检测新的突变，以及测定高度多态基因的基因型的技术方法。

【实验原理】在现代遗传学中DNA 序列突变的分析占有十分重要的地位。

由于在较大DNA 序列中检测一个细微的突变非常困难，因而现在人们建立了几种方法来解决这一难题。

变性梯度凝胶电泳(DGGE)能把长度相同而核苷酸顺序不同的双链DNA 片段分开。

这种方法利用了DNA 分子从双螺旋型变成局部变性型时电泳迁移率会下降的现象。

不同的DNA 片段发生这种变化所需梯度不同。

DGGE 的凝胶中沿电场方向变性剂(甲醛和尿素)含量递增，当DNA 片段通过这种变性剂递增的凝胶时，不同分子的电泳迁移率在不同区域会发生降低。

这就可使核苷酸顺序不同DNA 片段分开。

此方法可作为测序的初始步骤在杂合个体中分离等位基因。

许多研究表明变性递度凝胶电泳分离能力很强，它可以把相差仅1bp 的DNA 片段分开。

【仪器、材料与试剂】1.50×TAE 缓冲液(2mol/LTris 乙酸盐，0.05mol/L EDTA pH8.0)1L 体积：242gTris碱，57.1mL 冰醋酸，100mL 0.5mol/L EDTA pH8.0，加水至lL。

2.丙烯酰胺贮存液：40%丙烯酰胺(38:2 丙烯酰胺:双丙烯酰胺)。

3.过硫酸铵贮存液(10%)：10mL 配制：1g 过硫酸铵加水至10mL。

TEMED(N，N，N＇，N＇，—四甲基乙二胺)。

（生物秀实验频道）4.变性剂贮存液：(0%)6%丙烯酰胺TAE 溶液。

250mL 溶液：37.5mL 丙烯酰胺贮存液，5mL50×TAE 缓冲液，加水至250mL，过滤和排气。

5.变性剂贮存液(100%)：6%丙烯酰胺，7mol/L 尿素，40%甲醛TAE 溶液。

250mL配制：37.5mL 丙烯酰胺贮存液，5mL50×TAE 缓冲液，105g 尿素，100mL 甲醛，加水至750mL，过滤并排气。