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变性梯度凝胶电泳在微生物生态学中的应用李德斌;杨洪一;卢磊【摘要】变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)是目前在微生物生态学上应用比较广泛的技术之一,具有简便、准确可靠和重复性好等优点.对DGGE的原理、流程、各项技术要点和在微生物生态学上的应用等方面进行了详细地论述,同时归纳和总结了DGGE的优缺点和局限性.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2010(000)012【总页数】5页(P88-92)【关键词】DGGE;微生物生态学;PCR【作者】李德斌;杨洪一;卢磊【作者单位】东北林业大学生命科学学院,哈尔滨,150040;东北林业大学生命科学学院,哈尔滨,150040;东北林业大学生命科学学院,哈尔滨,150040【正文语种】中文微生物生态学 (microbial ecology)是研究微生物与其周围生物和非生物环境之间相互关系的一门科学。
微生物作为自然环境的重要组成部分之一,发挥着重要的作用,是微生物微生态研究的主体。
但人们对环境中的微生物了解却很少,主要是因为传统的方法是利用微生物形态、培养特性、生理生化特性、生态特性和遗传特性等作为依据对微生物进行鉴定和分类。
其工作繁复、分析速度慢,制约因素多。
然而,在自然环境中能够纯培养的微生物菌株的数量还不到自然界微生物总数的 1%-15%[1] ,这极大地限制了微生物微生态学的发展。
近年来,一些分子生物学方法逐渐被应用在微生物学的各个领域中,其中变性梯度凝胶电泳 (denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)[2] 由于其可靠性强、重现性好和方便简洁等优点而逐渐显露出来。
DGGE技术是 DNA指纹技术,是多态性分析技术的一种,该技术是 1979年由 Fischer等[3] 最先提出的用于检测DNA突变的一种电泳技术。
1993年Muyzer[2] 等首次将 DGGE用于微生物生态学研究,更加完整和准确地描述了微生物种群多样性、数量比例和系统进化等。
变性梯度凝胶电泳在环境微生物研究中的应用详解王小芬1 王伟东2 高丽娟1 崔宗均1(11中国农业大学农学与生物技术学院,北京100094;21黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院,黑龙江大庆163319)收稿日期:20060509基金项目:国家自然科学基金资助项目(30571088)作者简介:王小芬,讲师;崔宗均,教授,通讯作者,主要从事环境微生物与生物质利用研究,E 2mail :acuizj @摘 要 结合笔者等多年积累的经验详细介绍环境微生物学研究中变性梯度凝胶电泳(D GGE )技术应用全步骤:从环境样品中直接提取总DNA ,利用5′端含GC 夹子的引物PCR 16S rDNA 的部分片段,将PCR 产物在含有浓度线形递增的变性剂的聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分析,使不同来源的DNA 片段在电泳胶中分离,从胶中切出分离的DNA 片段测定碱基序列,进行分类分析。
PCR-D GGE 技术能够检测不可培养的微生物基因,而D GGE 技术与克隆等其他技术结合更能发挥其分离作用。
关键词 环境微生物;变性梯度凝胶电泳;聚合酶链式反应;方法详解;酒精沉淀法;细菌中图分类号 Q-33 文章编号 10074333(2006)05000107 文献标识码 AProtocols of applification of denaturing gradient gel electrophore sis(DGGE )in studie s of environmental microorganismWang X iaofen 1,Wang Weidong 2,Gao Lijuan 1,Cui Zongjun 1(11College of Agronomy and Biotechnology ,China Agricultural University ,Beijing 100094,China ;21College of Biological Science and Technology ,Heilongjiang August First Land Reclamation University ;Daqing 163319,China )Abstract The aim is to introduce detailed procedures for the application denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE )in the study of environmental microorganisms bas ed on our current exp erience in molecular ecology.The pro 2cedure for DGGE includes :Extracting DNA directly from environmental s amples ;PCR in the re gion of 16S rDNA using a primer with GC clamp in 5′;analyzing the PCR products in a p olyacrylamide gel with a chemical denaturing gradient which could s ep arate the different DNA fragments and then extracting bands from the gel and p erforming s equencing and phylogenetic analysis.PCR 2DGGE could detect the gene of unculturable microoganisms ,and the combination of DGGE with clone library and other molecular techniques is more appropriate to exert its predominance in s ep arating DNA.K ey words environmental microorganism ;denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE );PCR;protocol ;ethanol precipitation methods ;bacteria 变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis ,D GGE )技术应用于微生物生态学已经历10多年,它对各种环境中的微生物群体研究起到了重要作用。
电泳高考知识点总结电泳是一种常见的生物技术实验方法，广泛应用于基因分析、蛋白质研究以及法医学等领域。
在高考生物考试中，电泳是一个重要的知识点。
本文将对电泳的相关知识进行总结，以帮助考生更好地掌握这一内容。
一、电泳的基本原理电泳是利用物质在电场作用下的迁移运动的原理，通过电场的引导，使待分离的生物分子在凝胶中迁移，从而实现分离和检测。
电泳过程中，需要考虑电场强度、凝胶类型以及DNA的大小等因素。
1. 凝胶电泳凝胶电泳是最常见的电泳方法之一。
凝胶中含有孔隙结构，根据分子的大小差异，使得分子在凝胶中的迁移速度不同，从而实现分离。
常用的凝胶有瓊脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶等。
2. 离子电泳离子电泳是利用溶液中带电粒子在电场中的迁移来实现分离的方法。
它主要应用于离子的检测和分离，如常见的离子交换色谱。
二、电泳的应用领域电泳在生物学和医学领域有着广泛的应用。
主要包括基因分析、蛋白质研究和法医学等方面。
1. 基因分析基因电泳是研究DNA序列和变异的重要方法之一。
通过对DNA片段的分离，可以实现基因突变的检测、亲子鉴定等应用。
2. 蛋白质分析蛋白质电泳是研究蛋白质的结构和功能的重要手段。
通过对蛋白质的分离和鉴定，可以了解其复杂的结构和功能特点。
3. 法医学应用电泳在法医学中也有重要应用。
例如，通过DNA电泳可以进行犯罪嫌疑人的DNA比对，从而确定罪犯。
三、常见的电泳技术电泳技术发展迅速，现在有多种不同的电泳方法，常见的有聚合酶链式反应（PCR）电泳、蛋白质凝胶电泳和全基因组扩增片段长度多态性（AFLP）等。
1. PCR电泳PCR电泳是将PCR扩增得到的目的序列通过凝胶电泳进行分离和检测的方法。
它可以用于基因检测、突变鉴定等。
2. 蛋白质凝胶电泳蛋白质凝胶电泳是通过凝胶电泳的方式对蛋白质进行分离和检测的方法。
根据蛋白质的大小和电荷，可以实现对蛋白质的精确分离。
3. AFLPAFLP是一种用于检测DNA序列差异的分子生物学技术。
凝胶电泳名词解释凝胶电泳(Gel Electrophoresis)将带电的颗粒(如细胞等)沉积在凝胶表面上，形成一层带电的区带。
由于该区带中含有的电荷不同，故可对组分的性质加以区别。
实验证明，带负电的蛋白质，可与相邻带正电的区带互相吸引，从而使这些区带结合在一起;不带电的组分，则各自与带相反电荷的区带结合，这样通过电泳，便可把分子量不同的蛋白质、 DNA、 RNA等区分开来。
这种依据所带电荷不同进行分离的方法称为凝胶电泳法。
凝胶电泳法是根据在电场作用下的泳动原理来进行电泳操作的。
电泳槽中装有固定或移动的阳极和阴极，两极间施加一定的电压，使它们产生向相反方向的定向电流，形成电场。
带电的颗粒(如细胞等)在电场作用下沿着与电场方向垂直的电泳轴前进，聚集成一个个电泳带。
带电颗粒在电场力的作用下，速度逐渐增加，并经过一段距离，最后保持匀速泳动，便形成了电泳。
将电泳图像按照特定的数学关系变换成数字，即成为电泳图。
人们很早就注意到生物大分子和有机小分子的电泳现象。
直至十九世纪末才开始对电泳现象进行研究。
发现了同号电荷相互排斥，异号电荷相互吸引的基本规律，奠定了电泳法的理论基础。
但是，由于在实验上对电场的控制非常困难，实验效率不高，这一技术未能得到实际应用。
二十世纪50年代初，荷兰物理学家Selten和Coricq在第一次尝试使用电渗技术时，获得了不带电的分子运动的实验结果。
从此揭开了凝胶电泳法研究的序幕。
60年代以后，凝胶电泳技术取得长足的发展，广泛地应用于生物化学、生物物理、生物医学、微生物学、药学、法医学和刑事科学等领域，并在生命科学中获得越来越广泛的应用。
(1)凝胶电泳装置和方法(2)凝胶类型及电泳条件(3)影响电泳的因素及其控制技术(4)凝胶电泳法的应用电泳基本方程为： E－泳动颗粒电荷;3。
工作曲线绘制原理：从工作曲线上可以看出凝胶电泳法的分辨率。
当凝胶中带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度不变时，分辨率则随凝胶的带电量、颗粒的大小和电泳电压的增加而提高。
变性梯度凝胶电泳变性梯度凝胶电泳原著：Jeroen H. Roelfsema and Dorien J. M. Peters1.翻译：小高1.简介变性梯度凝胶电泳是人们多年来广泛使用的一种健全的检测点突变的方法（1）。
它是一种基于PCR的方法，其原理是，与野生型基因相比，改变了PCR产物中突变序列的解链温度。
通过PCR，致使DNA两个基因其中一个中的点突变变成不同的DNA的混合体。
PCR 后的产物中包括野生型基因和突变型基因。
即同源二聚体。
然而这两种产物的解链温度差别不大。
在PCR反应的最后一个循环，形成另外一种产物，即异源双链DNA，它包括一条野生型的链和一条突变的链。
DGGE的原理就在于同源PCR产物的解链温度远远低于异源PCR的产物，因为异源双链有一个错配(see Fig. 1)。
为了看到同源和异源DNA的解链温度之间的差别，只要让其在含有变性剂尿素和甲酰胺的丙烯酰胺梯度凝胶上电泳即可。
仅仅靠这些变性剂本身是不够的。
另外，跑电泳的胶的温度也比较高，通常在60℃。
电泳过程中，PCR产物在变性以前一直保持双链DNA的形式。
一旦变性后，PCR产物将以单链DNA的形式继续跑，但是片段则会保留在变性的地方。
为了达到这个目的，需要连上一个所谓的GC夹子以阻止完全变性。
这个GC夹子是由40-60个单纯的鸟嘌呤和胞嘧啶核苷酸构成的一条链，然后连接在其中的一种PCR引物上。
加上GC夹子进行PCR后的产物其一端具有很高的变性温度。
因此，PCR产物在DGGE的胶上将部分变性。
GC夹子保持双链。
其余的片段形成“Y”形继续保留在胶上原来的地方。
2.操作步骤2.1.设计PCR引物对于DGGE来说，用于筛选点突变的PCR引物的解链特性是很关键的。
当片段到达凝胶的临界点时，应该及时地变性，而不是在一端开始随着电泳的进行逐渐的慢慢的变性。
这种慢性解链会形成模糊的条带或者斑点，将导致很难检测出突变。
因为解链特性对于实验的成败至关重要，所以选取用来扩增目标产物的引物时必须格外小心。
变性梯度凝胶电泳及其在法医学中的应用变性梯度凝胶电泳及其在法医学中的应用【关键词】变性梯度凝胶电泳；法医学应用【中图分类号】r919．2【文献标识码】b【文章编号】1007—9297(20xx)02—0063—04随着人类基因组计划的实施和迅速发展．人类基因的神秘面纱已逐步揭开，越来越多的疾病或基因多样性均与基因的突变有关。
因此，对基因突变的筛选或诊断无论对基础研究还是临床研究均具有重要意义。
近年来，一系列新的基因突变检测方法层出不穷的同时，经典的方法也不断得到改进。
其中。
由fischer和lerman[ ，2】创立的变性梯度凝胶电泳(denaturing gra— dient gel electrophoresis，dgge)历经多次改良，已发展成一类极具实用价值的常规突变检测技术．被广泛应用于疾病的诊断或相关基因的筛查、人类基因多态性分析、微生物种群研究等各个领域。
一、dgge基本原理dgge是利用dna的物理性质进行突变分析的。
其原理是基于待测dna 片段双螺旋的解链温度(melting temperature。
tm)。
tm值由dna片段的碱基数目和碱基组成共同决定。
主要引起低温解链区域解链。
当dna片段在变性剂(尿素和甲酰胺)浓度呈线性梯度增加的凝胶中电泳时。
起初双螺旋dna片段以恒定的速率(由分子量决定)向前迁移，在抵达变性效果相当于其tm值的变性剂浓度点时．双链dna开始部分解链．部分解链后的dna分子呈分枝状使其迁移速度极度减缓．几乎处于“停顿”状态。
长度相同但序列不同的dna片段。
即使仅存在单个碱基改变。
也将影响邻近碱基间的相互作用．导致tm值的改变．从而在不同的变性剂浓度点解链、“停顿”．这样dna片段由于相同电泳时间内的不同位移而得以分离。
上述原理仅能检测dna片段中低温解链区存在的序列差异或突变．而位于高温解链区的则无法检出．因高温解链区解链的变性条件可使整个双链完全解开导致序列依赖的凝胶迁移特性丧失。
基于此．可通过克隆或pcr方法在待检目的片段的5 端引入3o 5o个gc碱基组成的寡核苷酸链．即gc—clamp。
使其成为片段中tm最高的区域，从而使目的片段高温解链区解链时dna双螺旋不至于完全解链成单链，极大增加dgge的突变检出率。
[3]变性梯度凝胶是有方向性的，据此可将dgge分为两类：垂直dgge和平行dgge。
垂直dgge的变性剂梯度方向与电泳方向垂直，可用于确定同一dna片段上不同的解链区域、优化样本的分离条件或分析pcr产物的组成；平行dgge的变性剂梯度方向与电泳方向一致，在所检测的dna解链区域和温度已知的情况下可用于多个样本的同时分析。
二、dgge衍生技术圈i t 曩(一)恒定变性凝胶电泳(constant denaturant gelelectrophoresis，cdge)由hovig等嗍(1991年)在dgge的基础上发展而来．它是通过预试验或理论计算预先精确确定待测dna片段的tm值后即采用相当于该tm值的单一变性剂浓度的凝胶电泳．使不同的dna片段各自以不同但恒定的速度迁移。
cdge避免了化学变性剂梯度的应用．且选择特定的最佳变性剂浓度可获得最好的分辨效果。
同时克服了dgge电泳时间长的缺点，使其变得更加简单快速。
但对含有多个解链区域的目的片段需选择不同浓度的变性凝胶以提高检测效率。
因需事先精确确定待测片段的tm值。
故该法主要用于已知突变的检测。
【基金项目l 国家自然科学基金资助(no．30300399)【作者简介l 黄代新(1969一)，男，湖北松滋人，博士，副教授，主要从事法医分子遗传学研究。
· 146 ·(二)温度梯度凝胶电泳(temperature gradient gelelectrophoresis，tgge)tgge凝胶中含有固定浓度的化学变性剂，在电泳过程中．通过微处理器控制从凝胶的顶端到底端形成一线性增加的温度梯度，以此取代dgge中的化学变性剂浓度梯度。
变性环境由凝胶中恒定浓度的变性剂和温度梯度共同构成。
[5,61由于无需制备变性梯度胶，tgge较dgge更加简单稳定。
但目前大多tgge仪器所允许的温度范围为15℃～80℃ ，较大片段的tm值会因接变性梯度凝胶电泳及其在法医学中的应用第2页近8o℃从而增加了检测的困难。
(三)瞬时温度梯度凝胶电泳(temporal tempera—ture gradient gel electrophoresis，ttge)由日本学者yoshino等同于1991年建立．最初称为温度掠扫凝胶电泳(temperature sweep gel electrophoresis，tsge)，后改称为tyge。
其原理类似于tgge，是在加有一定浓度化学变性剂的聚丙烯酰胺凝胶电泳过程中，使凝胶板的温度以恒定速度逐渐升高，从而在跑胶的过程中形成一个温度梯度，这样整个凝胶中任何位置的温度在任何特定的时间点都是相同的，但随着时间的改变而变化。
凝胶的温度条件可用相关软件(如macmelt、winmelt软件等)从相应序列的理论解链曲线获得，而无需通过大量实验摸索。
]~fge无需制备变性梯度凝胶，随时间而调整温度也较tgge更易操作．同时在不降低灵敏度的前提下．其分离范围更宽，可检测长达lkb的片段。
尤其是通过调节温度范围(窄或宽)及升温速度可以很灵活地调节tyge的分离范围[81。
三、dgge的主要技术特点作为常规突变检测技术．dgge具有以下优点：(1)高检测率和灵敏度。
对几百bp长的dna片段，使用带gc—clamp的pcr—dgge技术．突变检出率接近100％。
在tgge中，一般2ram可对应0．6℃温差，而在ti~ge中．每小时升温可控制为0．1℃ ．极小的tm值差异也可被检出，尤其适用于单碱基突变个体的筛查。
在含量方面，dgge的检测灵敏度可达1％。
(2)检测片段长，可达1 kb。
但其最适分离范围为100～500 bp，随着片段长度增加．其检出率相应降低。
(3)简单快速。
主要电泳条件均由微处理器控制。
如用bio—rad公司的dcode突变检测系统最快可在2小时内检测64个样品。
(4)可从凝胶中分离回收片段直接用于测序。
当然．该技术也存在一些不足之处：(1)实验之初需进行计算机分析或预试验以确定最佳的分离条件。
(2)使用带gc—clamp的引物增加了实验费用。
(3)gc含量较高的片段用dgge不易分析。
(4)制备精确的梯度凝胶需法律与医学杂志20xx年第12卷(第2期)要熟练的操作技巧及复杂的仪器设备。
(5)仅能检测突变的存在但不能确定突变类型，需进一步测序确定。
四、法医学应用(一)在法医dna 分型中的应用dgge及相关衍生技术高效率的突变检测能力使其在法医dna多态性分型中具有极大的应用潜能。
1991年。
burmeister等[91采用类似rflp的基因组dgge(genomic dgge，gdgge)技术分析人类21号染色体长臂近侧区的序列多态性取得良好的效果。
与rflp不同的是，即使限制性内切酶消化后片段长度相同的消化产物gdgge也能分离。
在蛋白遗传标记的基因分型方面，1991年，johnson等【 ol用dgge技术成功检测出人类f一1一抗胰蛋白酶基因的所有主要等位基因(m1ala、m1val、m2、m3、s和z)以及存在于内含子3和4中的大量遗传多态性。
次年，johnson等【l】1又用pcr—dgge技术尝试对abo血型进行基因分型．一次扩增即可成功检测6种主要基因型，同时还发现了未曾报道过的o和b等位基因中包含的序列多态性，在95个无关欧洲个体中共检出4个不同的o等位基因和2个不同的b等位基因，从而使该系统的法医学应用价值大为提高。
takahashi等【 21(1991年)在分析日本人群人类f-球蛋白基因5 侧翼区a 兀’rr串联重复多态性时．以rna ：dna形成异源双链方式采用dgge技术，除成功检出已报道的重复次数为5和6的两个等位基因外．还检出了重复次数为7和第5个重复单位中形成a／g替换的2个新等位基因。
chen等【 31(1994年)用tgge技术对hla—drb3第二外显子271bp的扩增片段采用35℃ ～7o℃ 的温度梯度进行分析．在hla—drb3的4个等位基因drb3*0101、"0201、*0202和"0301中可成功检出3 个同源双链片段．其中"0201和*0202因具有相同的热稳定性无法区分，但可通过人工形成异源双链的方法加以区分．证实了tgge技术是检测hla基因型的有效手段。
steers等【 (1996年)用pcr—dgge技术通过扩增分析rhd和rhce基因的第2、第5外显子成功地从基因组dna实现了rh表型分型。
日本学者matsuzaki—takada和mukaidat 5】通过精心设计引物和优化实验条件．采用pcr—dgge技术实现了在同一凝胶板上同时进行红细胞血型mn、dufy和kidd以及血清型gc的基因型分型。
mtdna多态性多表现为不同核苷酸的替换，故pcr—dgge这种灵敏高效的突变筛选技术非常适于mtdna的突变筛选或检测．对此已有较多的研究报道r 7j。
利用dgge技术进行mtdna分析不仅可以同时法律与医学杂志20xx年第l2卷(第2期)进行多个样本的检测比对．而且还可应用于mtdna异质性分析。
1999年，steighner等[181在评估pcr— dgge技术检测mtdna高变区l(hv1)序列多态性的可靠性时，所有设计的49对配对序列(每对仅存在1个碱基差异)用该技术可全部有效加以区分。
次年．该研究小组又用dgge技术对253个随机个体的mtdna hv1进行了分析，发现35个个体存在异质性，其中33个为单核苷酸异质，2个为二核苷酸异质，进一步证实了mtdna异质性存在的普遍性，而且该技术检测异质性的灵敏度高达1o~[19]。
(二)在法医病理学研究中的应用法医病理学中dgge技术的应用相对较少。
1999年，opdal等用pcr—ti’ge技术对158例婴幼儿猝死综合征(sids)和97例正常对照的mtdna 3230～3330nt区域进行分析．从4例sids中检出3个不同的点突变(t3290c、t3308c和t3308g)．而对照组未检出．同时发现这4例sids的mtdna d一环区碱基替换率较高，提示mtdna的突变在部分sids中起作用。
nobel等用pcr—dgge技术对蓝藻和硅藻群落的16s rdna进行研究，发现不同时间、不同环境的水体或土壤，其蓝藻和硅藻群体的电泳图谱构成均不相同，形成高度特异的“群落指纹”。
基于此，作者设计课题将该技术引入法医学用于溺死的诊断研究，以期建立一种特异性好、灵敏度高，既能定性诊断溺死，同时又能提示溺死地点的全新的分子生物学鉴定方法，且初步的研究结果较为理想。
