卵母细胞的冷冻技术概要

玻璃化冷冻液为VSI ( TCM199+HEPES+10%FCS+ 10%DMSO + l0%EG)和VSⅡ(TCM199+HEPES+20%FCS+20%DMSO+20%EG+0.5MSUCROSE)。

各种冷冻保护剂均具有保护作用，但效果不一样，甘油的效果较差，EG相对较好。

人卵母细胞在室温放置30 min，纺锤体就完全解聚，复温后仅25%一50%可恢复纺锤体结构，牛体外成熟卵母细胞在4℃保持10-20 min，纺锤体可完全解聚，而猪卵母细胞在4℃仅5 min，就会发生部分或完全解聚。

玻璃化冷冻和解冻冷冻：室温下将卵子在PBS+20％FCS(S)中冲洗2～3次后移入10％乙二醇(EG)+10％二甲基亚砜(DMSO)中停留30 s，然后移入20％EG十20％DMSO+0．5 mol／L糖中，用细麦管通过虹吸作用将卵吸入管中，投入液氮。

解冻：在室温下依次将卵子移入含0．4 mol／L糖、0．2 mol／I．糖、0．1 mol／L糖的S及s中，各停留3 min，再于37。

C中停留5 min，最后移入MEM中，准备体外培养成熟(IVM)当进人渗透压梯度较大的高渗溶液时，卵母细胞和卵丘细胞都大幅度收缩，造成二者牵拉、损伤，破坏了胞间连接。

比较了DPBS和TCM199对冷冻保护效果的影响，试验结果表明，二者在冷冻保护效果上无显著差异。

冷冻损伤包括两个因素:一是胞内冰晶造成的机械损伤;二是细胞在高浓度冷冻保护液中暴露时间过长造成的溶质损伤。

这些损伤的发生多在15℃和一5℃间的温度范围。

玻璃化冷冻胚胎的处理过程是影响玻璃化冷冻效果的重要因素。

冷冻前，先用预热到37 ℃, 1 M的DMSO预先处理胚胎5 min，可以使保护剂充分渗透到细胞内，并且因为保护剂浓度较低所以对胚胎产生的毒性作用小。

玻璃化溶液使用DAP213 (DMSO+丙二醇+乙酞胺)，其中DMSO为主要低温保护剂，促进渗透;丙二醇强化玻璃化形成能力;乙酞胺是毒性中和剂，降低了毒性作用。

辅助生殖技术辅助生育技术(artificial reproductive technology，ART)是指对配子、胚胎或者基因物质等进行操作而获得新生命的技术，它包括各种帮助不孕症患者妊娠的技术，如促排卵[yao]物治疗、人工授精(artificial insemina．tion，AH)和体外受精一胚胎移植(in vitro fertilization&emb~o transfer，IVFET)及其各项衍生技术。

目前在ART中的研究热点是IVF一ET及其各项衍生技术。

常规IVF一ET技术主要解决女性不孕问题，特别是输卵管性不孕；在该技术上结合显微操作技术、分子生物学、细胞遗传学等发展起来的衍生技术主要包括有胞浆内单精子注射(intracytoplasmie sperm injection，ICSI)和胚胎植入前遗传学诊断(preimplantation geneticdiagnosis，PGD)等。

经过近20年的发展，ART已经取得了惊人的进步。

目前，我国大陆临床ART在许多方面基本上与国际水平接轨，不少中心常规IVFET的成功率已稳定在较高的水平[1]。

本文主要阐述近年IVF一ET及其衍生技术中涉及问题的研究进展。

1 常规IVF-ET常规IVF-ET是指从妇女体内取出卵子，体外培养后加入经过处理获能的精子使之受精，受精卵发育成2～8个卵裂球或囊胚后，移植入母体子宫内并使之着床。

它的适应症为女方输卵管性不孕、排卵障碍、子宫内膜异位症、免疫性不孕、男方轻度少精症、弱精症或畸精症、原因不明不孕特别是经过其他助孕方法多次失败。

主要程序包括控制性超促排卵(controlled ovarian hyperstimulation，COH)、手术取卵、体外受精、胚胎体外培养、胚胎移植等步骤。

1．1 COH方案的改进。

IVF能够获得成功的大前提是获得可以进行移植的优质胚胎，COH 的目的就是提供高质量的卵子以获得更多的优质胚胎，从而提高成功率。

OPS法玻璃化冷冻未成熟卵母细胞的效果观察章汉旺;任新玲;魏玉兰【期刊名称】《中国妇幼保健》【年(卷),期】2005(20)20【摘要】目的:探讨OPS(open pu lled straw,开放式拉细麦管)法玻璃化冷冻技术冻存未成熟卵母细胞的效果。

方法:小鼠GV期卵母细胞用OPS法玻璃化冷冻复苏后行体外成熟培养(in-vitro m aturation,IVM)或直接行IVM,所获成熟卵行体外受精(IVF)和胚胎的体外培养(IVC)。

以体内成熟卵行IVF/IVC作为in-vivo对照组。

结果:GV期卵冻融后65.11%存活,IVM后成熟率为52.86%,其成熟率显著低于IVM对照组。

冻融卵成熟后受精、卵裂率(33.78%、76.00%)低于IVM对照组和in-vivo对照组,培养后未见囊胚形成。

结论:OPS法玻璃化冷冻技术可有效冻存GV 期卵母细胞,复苏后可发育成熟,但卵的受精和继续发育能力欠佳。

【总页数】3页(P2633-2635)【关键词】玻璃化冷冻;未成熟卵母细胞;体外成熟培养【作者】章汉旺;任新玲;魏玉兰【作者单位】华中科技大学同济医学院附属同济医院妇产科生殖医学中心【正文语种】中文【中图分类】R711【相关文献】1.OPS法及自制冷冻叶法玻璃化冷冻小鼠MⅡ期卵母细胞的研究 [J], 高静;胡泊;徐华;巩小芸;蔡霞2.冷冻平衡液及保护剂的不同组合对小鼠未成熟卵母细胞OPS法冷冻效果的影响[J], 袁水桥;杨瑞峰;周生来;孙绪磊;郑志红3.小鼠卵母细胞的OPS法玻璃化冷冻保存技术 [J], 李秀伟;吴通义;侯云鹏;周光斌;朱士恩4.绵羊体外成熟卵母细胞OPS法玻璃化冷冻保存试验 [J], 田树军;闫长亮;杨慧欣;杨中强;朱士恩5.小鼠未成熟卵母细胞OPS法冷冻保存技术的研究 [J], 罗光彬;朱增娟;袁水桥;张晓华;李东全因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

卵母细胞和胚胎玻璃化解冻方法用途：本品用于卵母细胞和胚胎的玻璃化解冻配套。

安全解冻配套：1.1瓶4ml解冻液（TS）2.1瓶1.5ml稀释液(DS)3.1瓶1.5ml 冲洗液(WS)4.1个25mm 的培养皿(用于解冻液)5.1个6孔生殖板使用说明准备：*用载体和生殖板将解冻液放到37℃的培养箱里加温—将所有解冻液倒入生殖板里。

*用微细管吸取DS,WS1和WS2各300ul，放进培养皿。

注意：用巴斯德管吸取一个大小合适的卵母细胞（直径：140um）或者胚胎(直径：140-180um)解冻：1.迅速地将载体顶放进解冻液中，浸泡1分钟。

（图一）2.用巴斯德管吸取卵母细胞（胚胎），轻轻地将其放入DS底部，浸泡3分钟。

（图二）3.用巴斯德管吸起卵母细胞（胚胎），轻轻地将其放入WS1 底部，浸泡5分钟。

（图三）4.用巴斯德管吸起卵母细胞（胚胎），轻轻地将其放入WS2 顶部，当卵母细胞（胚胎）自动沉到底部的时候，重新再重复这一步骤。

（图四）5.将卵母细胞（胚胎）转移到装有合适培养液的培养皿中。

放进37℃的培养箱中完成恢复。

注意：卵母细胞要放置2小时，胚胎则要3小时。

质量控制测试：每一批安全解冻配套都得到以下测试：*溶液：UPS不孕不育无菌测试（SAL 10-3）LAL拉尔内毒素测试小老鼠胚胎试验（一个细胞）保存方法：*保存于4-8℃*在标签所示有效日期前，本品性质稳定。

成分：*血清替代补充*基本培养基M-199 内含的HEPES*蔗糖参考文件（此部分请看原件）.玻璃化第一部分：所需材料*玻璃化配套No.0 基础液（BS）：1.5ml x1 (只用于卵母细胞玻璃化冷冻)No.1 稀释液（ES）: 1.5ml x1No.2 玻璃化溶液（VS）: 1.5ml x2*冷冻管x4, 建议每个冷冻管最多储存3个卵母细胞或者3个胚胎*复制板x2: 6孔*冷却架(蓝盒液氮，型号：VT-CLB)*巴斯德管（型号：MT-150）*显微镜（关掉加热板）*秒表或计算器（带计算功能）*液氮（消毒过滤功能，聚四氟乙烯滤膜过滤）*镊子*显微针x2: 2-20ul, 100-1000 ul*罐子*储存罐注意：使用的巴斯德管大小要与卵母细胞或胚胎大小合适。