卵母细胞的冷冻技术

卵母细胞和胚胎玻璃化解冻方法用途：本品用于卵母细胞和胚胎的玻璃化解冻配套。

安全解冻配套：1.1瓶4ml解冻液（TS）2.1瓶1.5ml稀释液(DS)3.1瓶1.5ml 冲洗液(WS)4.1个25mm 的培养皿(用于解冻液)5.1个6孔生殖板使用说明准备：*用载体和生殖板将解冻液放到37℃的培养箱里加温—将所有解冻液倒入生殖板里。

*用微细管吸取DS,WS1和WS2各300ul，放进培养皿。

注意：用巴斯德管吸取一个大小合适的卵母细胞（直径：140um）或者胚胎(直径：140-180um)解冻：1.迅速地将载体顶放进解冻液中，浸泡1分钟。

（图一）2.用巴斯德管吸取卵母细胞（胚胎），轻轻地将其放入DS底部，浸泡3分钟。

（图二）3.用巴斯德管吸起卵母细胞（胚胎），轻轻地将其放入WS1 底部，浸泡5分钟。

（图三）4.用巴斯德管吸起卵母细胞（胚胎），轻轻地将其放入WS2 顶部，当卵母细胞（胚胎）自动沉到底部的时候，重新再重复这一步骤。

（图四）5.将卵母细胞（胚胎）转移到装有合适培养液的培养皿中。

放进37℃的培养箱中完成恢复。

注意：卵母细胞要放置2小时，胚胎则要3小时。

质量控制测试：每一批安全解冻配套都得到以下测试：*溶液：UPS不孕不育无菌测试（SAL 10-3）LAL拉尔内毒素测试小老鼠胚胎试验（一个细胞）保存方法：*保存于4-8℃*在标签所示有效日期前，本品性质稳定。

成分：*血清替代补充*基本培养基M-199 内含的HEPES*蔗糖参考文件（此部分请看原件）.玻璃化第一部分：所需材料*玻璃化配套No.0 基础液（BS）：1.5ml x1 (只用于卵母细胞玻璃化冷冻)No.1 稀释液（ES）: 1.5ml x1No.2 玻璃化溶液（VS）: 1.5ml x2*冷冻管x4, 建议每个冷冻管最多储存3个卵母细胞或者3个胚胎*复制板x2: 6孔*冷却架(蓝盒液氮，型号：VT-CLB)*巴斯德管（型号：MT-150）*显微镜（关掉加热板）*秒表或计算器（带计算功能）*液氮（消毒过滤功能，聚四氟乙烯滤膜过滤）*镊子*显微针x2: 2-20ul, 100-1000 ul*罐子*储存罐注意：使用的巴斯德管大小要与卵母细胞或胚胎大小合适。

奶牛卵母细胞玻璃化冷冻方法及胚胎程序化冷冻研
究的开题报告
一、研究背景及意义
近年来，随着生殖技术的逐步发展和成熟，胚胎冷冻技术已经成为
了一种有效的保护和利用动物遗传资源的方法。

同时，该技术也被广泛
应用于人类的生殖医学领域，为不孕不育、遗传疾病等问题提供了可行
的解决方案。

在动物领域，奶牛是重要的经济动物之一，其肉、奶、皮毛等多个
产业都拥有广阔的市场。

而胚胎冷冻技术的应用不仅可以为奶牛的优良
种群提供保护，还可以实现对其生产效益的提高。

因此，奶牛胚胎冷冻
技术的研究具有重要的意义和应用价值。

二、研究内容及方法
1. 奶牛卵母细胞玻璃化冷冻方法的研究
卵母细胞玻璃化冷冻是指将卵母细胞置于高浓度保护剂溶液中，使
其渐进性脱水并达到可逆的冷冻/解冻状态，从而实现卵母细胞的保存和
利用。

本研究将对奶牛卵母细胞冷冻的基本条件进行研究，并通过体外
培养和移植实验，测试不同奶牛卵母细胞冷冻方案的效果和适用范围。

2. 奶牛胚胎程序化冷冻技术的研究
程序化冷冻技术是指将胚胎在发育过程中特定阶段静止，并将其置
于保护剂溶液中进行快速冷冻和解冻，以保证胚胎的完整性和发育能力。

本研究将针对奶牛胚胎发育过程中的不同阶段，设计多种具有代表性的
程序化冷冻方案进行研究，并通过移植实验，比较其效果和适用范围。

三、研究预期及意义
通过本研究的开展，可为奶牛胚胎冷冻技术的应用提供更为科学和有效的方法和技术路线，进一步保护和利用奶牛的遗传资源，推动奶牛产业的可持续发展。

同时，该研究在探索动物胚胎冷冻技术的理论和实践方面也将为生殖医学领域的进一步发展提供参考和借鉴。

最新：人类卵母细胞与胚胎玻璃化冷冻中国专家共识（2023年）摘要人类卵母细胞和胚胎玻璃化冷冻是辅助生殖技术的重要组成部分。

由中国医师协会生殖医学专业委员会发起，参考最新国际指南和共识，结合中国临床实践现状，经充分讨论后形成该共识，旨在加强玻璃化冷冻技术质量控制，进一步改善卵母细胞及胚胎冷冻结局，提升辅助生殖服务质量。

卵母细胞和胚胎玻璃化冷冻保存是人类辅助生殖技术（assisted reproductive technology，ART）的重要环节。

相较于传统的程序化冷冻，玻璃化冷冻技术以其简单快速、不依赖昂贵设备，且复苏率极高的显著优点，在国内外各大生殖医学中心迅速普及推广，从而为人类生育力保存、胚胎植入前遗传学检测以及全胚冷冻策略的广泛临床应用，提供了必要的核心技术支持。

卵母细胞及胚胎的冷冻复苏结局受诸多因素影响，包括冷冻保护剂种类、样本平衡时间、降温/升温速率和冷冻载体类型等，造成各生殖中心间冷冻结局的差异。

有鉴于此，参考最新指南和共识［1-7］，结合中国临床实践，由中国医师协会生殖医学专业委员会发起，组织本领域专家对人类卵母细胞与胚胎玻璃化冷冻技术流程和细节进行归纳总结，以期提供一套全面系统的玻璃化冷冻操作规范指导意见，提升生殖医学中心服务质量。

一.人员资质培训初学者培训采用导师负责制，以经验丰富的胚胎学家作为指导老师，由指导老师依据质控指标和经验判断初学者达到标准后，方可进入下一阶段培训。

整个培训过程形成书面记录存档。

1.理论学习：初学者应理解玻璃化冷冻的基本原理，掌握冷冻保护剂浓度、操作温度、降温/升温速率等基本概念及控制方法［8］。

2.动物样本：建议初学者在指导老师监督下使用动物样本进行为期1~2个月的培训。

以小鼠8-细胞胚胎为样本不断练习冷冻和解冻操作，以熟练掌握试剂耗材的使用方法［8］。

鉴于小鼠胚胎对冷冻和解冻操作的敏感性低于人类胚胎［9］，建议对初学者的要求设为操作50例小鼠8-细胞胚胎的复苏率不低于同中心人类卵裂期胚胎（第3天）复苏率，且复苏后的小鼠8-细胞胚胎需继续培养24~48 h，其囊胚形成率应≥80%［10］。

卵母细胞冷冻保存的方法（一）卵母细胞的获取随着哺乳动物胚胎操作技术的成熟和胚胎移植技术商业化的迅猛发展，各领域对卵母细胞的需求量与日俱增。

单纯依赖超数排卵获取卵母细胞的方法费用高、对动物生理功能影响大且获得的数量有限，因此不能满足科学研究和生产的需求。

现在主要有两种获取卵母细胞的途径：一是从活体卵巢采集，二是从屠宰厂废弃卵巢中获取卵母细胞。

1.活体卵巢上采集（1）腹腔镜法：此法在手术部先行局部麻醉，以消毒导管针刺入腹腔并向腹腔内轻轻打气、压迫胃肠前移，从导管内插入内镜进行搜索观察。

另用套有聚四氟乙烯套管的吸卵针在内镜引导下刺入卵泡内吸取卵母细胞。

该法在牛上采集排卵前卵母细胞可达80%～90%回收率。

（2）B型超声波法：此法将带有超声波探头和采卵针的采卵器插入到保定和麻醉母畜阴道子宫颈的一侧弯隆处缓慢移动卵巢，用吸卵针刺入直径大于2mm的卵泡，真空吸入卵母细胞和卵泡液。

现在，此法已成为牛活体采卵的主要方法。

（3）活体输卵管采卵法：通过手术方法采集排入输卵管内的卵母细胞。

打开腹部后，找到子宫角和输卵管并牵出腹腔外，自宫管接合部插入注射针、逆向从伞部输卵管腹腔孔冲洗，或者在宫管接合部子宫角尖下1cm处插入接卵管接于平皿中，自伞部输卵管腹腔口顺向注入冲卵液。

该方法目前是猪、绵羊、山羊、兔等动物常用的活体采卵方法。

2.屠宰后卵巢上采集动物屠宰后立即无菌采集卵巢，放入30～39℃灭菌生理盐水或灭菌PBS中，6小时内带回实验室。

尽管有人认为在18～21℃收集和操作牛卵母细胞能提高卵母细胞成熟率，Yang等（1990）的研究结果表明，牛卵巢在24℃保存24小时后收集的卵母细胞体外受精后仍有71.2%的卵裂率，而Solano等1994年的研究更显示将牛卵巢在4℃放置12～24小时后其卵裂率不受任何影响。

卵巢表面卵泡卵母细胞的获得是目前体外成熟培养中卵母细胞的主要来源，其采集方法有如下3种。

（1）抽吸法：用配以16号或18号针头的5ml或10ml注射器从直径2～6mm的卵泡中抽吸卵泡液。

水牛卵母细胞玻璃化冷冻保存的研究的开题报告前言水牛卵母细胞在畜牧业生产中具有重要意义，但其的保存和利用仍然存在许多难题。

冷冻保存是一种常用的保存方法，但卵母细胞的玻璃化冷冻技术还需要进一步研究和优化。

本研究旨在探究水牛卵母细胞玻璃化冷冻保存方法，为卵母细胞的长期保存提供技术支持。

一、研究背景水牛是我国重要的且具有特色的畜牧业生产动物之一，其卵母细胞的保存和利用对于水牛繁殖和生产具有重大意义。

然而，卵母细胞保存存在一些问题，如长期保存难度大、遇到琐碎问题较多、在冷冻及解冻过程中容易发生结晶等。

因此，为了提高卵母细胞保存效果及保存期限，需要对卵母细胞的冷冻保存技术进行进一步研究和改良。

二、研究目的本研究旨在探究水牛卵母细胞的玻璃化冷冻保存技术，对玻璃化冷冻保存条件进行优化，为卵母细胞长期保存提供技术支持。

三、研究内容1.水牛卵母细胞的提取和培养2.卵母细胞玻璃化冷冻保存的方法及条件的确定3.卵母细胞玻璃化冷冻保存后的生存能力检测及效果评估四、研究意义水牛卵母细胞的玻璃化冷冻保存技术研究可以延长细胞保存时间，提高细胞的存活率，使其更好地发挥繁殖生产的作用。

此外，本研究也将为其他动物卵母细胞的保存提供借鉴。

五、研究方案1.实验设计本研究采用完全随机设计，水牛卵母细胞将随机分配到试验组和对照组。

2.实验方法(1)水牛卵母细胞的提取和培养将5-6个月龄的水牛卵巢取出，利用体外切割法分离卵母细胞，分别在含葡萄糖的H-DMEM培养液中培养，并将培养皿放入恒温培养箱中，设置温度和气氛，如需添加生长因素，则在适当时候加入。

(2)卵母细胞玻璃化冷冻保存的方法及条件的确定在培养液中加入适当的保护剂，冷冻过程根据不同的温度和冷却速率确定。

冷冻完成后，将冷冻物样品放入液氮中进行保存。

同时，研究不同玻璃化冷冻保存条件对卵母细胞保存效果的影响，评价不同条件保存的卵母细胞的存活率和活性差异。

(3)卵母细胞玻璃化冷冻保存后的生存能力检测及效果评估在不同时间点(可设置为7、14、28天等时间点)分别取出冷冻保存后的卵母细胞，进行生存能力检测和效果评估，判断卵母细胞的存活率及生殖功能的影响程度，确定不同保存条件的存活率和效果差异。