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《胚胎工程实验技术》讲义一、胚胎工程的概念与发展胚胎工程是指对动物早期胚胎或配子所进行的多种显微操作和处理技术。
它是在胚胎学基础上发展起来的一门新兴学科，主要包括体外受精、胚胎移植、胚胎分割、胚胎冷冻保存、胚胎性别鉴定等技术。
胚胎工程的发展可以追溯到上世纪初。
随着显微镜技术的不断进步，人们对生殖细胞和胚胎的结构与功能有了更深入的了解。
20 世纪 50 年代，科学家成功实现了家兔的胚胎移植，标志着胚胎工程技术开始走向实用化。
此后，各种胚胎工程技术不断涌现和完善，为畜牧业、医学等领域带来了巨大的变革。
二、体外受精技术（一）基本原理体外受精是指将哺乳动物的精子和卵子在体外人工控制的环境中完成受精过程的技术。
其基本原理是模拟体内受精的环境，使精子和卵子在适宜的条件下结合形成受精卵。
（二）操作步骤1、卵母细胞的采集卵母细胞的采集方法主要有两种：一种是从卵巢中直接采集未成熟的卵母细胞，然后在体外培养成熟；另一种是通过超数排卵技术，使雌性动物排出更多的卵子，再从输卵管中采集成熟的卵母细胞。
2、精子的采集与获能精子的采集通常通过人工采精的方法获得。
采集后的精子需要在体外进行获能处理，使其具备受精能力。
获能的方法有化学诱导法和培养法等。
3、受精将成熟的卵母细胞和获能的精子在体外共同培养，使精子穿过卵母细胞的透明带和卵膜，完成受精过程。
（三）应用体外受精技术在畜牧业和人类辅助生殖领域都有广泛的应用。
在畜牧业中，可以快速扩繁优良家畜品种；在人类辅助生殖领域，为不孕不育夫妇带来了生育的希望。
三、胚胎移植技术（一）基本原理胚胎移植是指将雌性动物体内的早期胚胎，或者通过体外受精及其他方式得到的胚胎，移植到同种的、生理状态相同的其他雌性动物体内，使之继续发育为新个体的技术。
（二）操作步骤1、供体和受体的选择供体应选择具有优良遗传性状和生产性能的个体，受体则要求具有良好的繁殖性能和健康状况。
2、同期发情处理对供体和受体进行同期发情处理，使它们的生殖生理状态同步化，为胚胎移植创造适宜的条件。
卵母细胞和胚胎玻璃化解冻方法用途：本品用于卵母细胞和胚胎的玻璃化解冻配套。
安全解冻配套：1.1瓶4ml解冻液（TS）2.1瓶1.5ml稀释液(DS)3.1瓶1.5ml 冲洗液(WS)4.1个25mm 的培养皿(用于解冻液)5.1个6孔生殖板使用说明准备：*用载体和生殖板将解冻液放到37℃的培养箱里加温—将所有解冻液倒入生殖板里。
*用微细管吸取DS,WS1和WS2各300ul，放进培养皿。
注意：用巴斯德管吸取一个大小合适的卵母细胞（直径：140um）或者胚胎(直径：140-180um)解冻：1.迅速地将载体顶放进解冻液中，浸泡1分钟。
（图一）2.用巴斯德管吸取卵母细胞（胚胎），轻轻地将其放入DS底部，浸泡3分钟。
（图二）3.用巴斯德管吸起卵母细胞（胚胎），轻轻地将其放入WS1 底部，浸泡5分钟。
（图三）4.用巴斯德管吸起卵母细胞（胚胎），轻轻地将其放入WS2 顶部，当卵母细胞（胚胎）自动沉到底部的时候，重新再重复这一步骤。
（图四）5.将卵母细胞（胚胎）转移到装有合适培养液的培养皿中。
放进37℃的培养箱中完成恢复。
注意：卵母细胞要放置2小时，胚胎则要3小时。
质量控制测试：每一批安全解冻配套都得到以下测试：*溶液：UPS不孕不育无菌测试（SAL 10-3）LAL拉尔内毒素测试小老鼠胚胎试验（一个细胞）保存方法：*保存于4-8℃*在标签所示有效日期前，本品性质稳定。
成分：*血清替代补充*基本培养基M-199 内含的HEPES*蔗糖参考文件（此部分请看原件）.玻璃化第一部分：所需材料*玻璃化配套No.0 基础液（BS）：1.5ml x1 (只用于卵母细胞玻璃化冷冻)No.1 稀释液（ES）: 1.5ml x1No.2 玻璃化溶液（VS）: 1.5ml x2*冷冻管x4, 建议每个冷冻管最多储存3个卵母细胞或者3个胚胎*复制板x2: 6孔*冷却架(蓝盒液氮，型号：VT-CLB)*巴斯德管（型号：MT-150）*显微镜（关掉加热板）*秒表或计算器（带计算功能）*液氮（消毒过滤功能，聚四氟乙烯滤膜过滤）*镊子*显微针x2: 2-20ul, 100-1000 ul*罐子*储存罐注意：使用的巴斯德管大小要与卵母细胞或胚胎大小合适。
博士生入学考试动物胚胎生物工程复习提纲要求了解动物胚胎工程的研究内容、发展动态及其在畜牧生产和生物医学中的作用和地位，掌握卵子发生、精子获能、受精、激活、早期胚胎发生和分化的理论、并对动物胚胎移植、胚胎分割、胚胎冷冻保存、体外受精、性别控制、嵌合体、干细胞、核移植和转基因技术的研究历史、现状和动态有一全面的了解。
1、动物胚胎工程技术的研究现状及其与人类健康的关系。
2、初级卵母细胞的来源及其在生长过程中所经历的主要变化。
3、卵母细胞成熟分裂的调控机理。
4、卵母细胞成熟分裂过程中核质的主要变化。
5、精子的获能及其机理。
6、受精过程中精卵识别的机理及其所发生的主要变化。
7、胚胎早期发生过程中的基因表达及其形态和细胞生物学变化。
8、胚胎发生过程中的细胞分化及其发育潜能的变化。
9、胚胎移植的意义和研究历史。
10、胚胎移植的生理学基础。
11、胚胎移植的原则和基本程序。
12、胚胎分割的原理、意义和研究现状。
13、卵母细胞和胚胎冷冻保存研究的历史和现状。
14、卵母细胞和胚胎冷冻保存的方法及其原理。
15、体外受精技术研究的历史和现状。
16、影响卵母细胞体外成熟的主要因素。
17、如何检查卵母细胞体外成熟的情况。
18、如何判定卵母细胞的细胞质成熟情况？19、卵母细胞第一次成熟分裂为何都在双线期？20、精子体外获能的方法及其原理。
21、影响体外受精的主要因素。
22、体外受精质量与胚胎发育有何关系？如何提高体外受精质量？23、胚胎体外培养系统的研究历史及现状。
24、体外受精技术的应用前景和展望。
25、动物性别控制研究的历史和现状。
(过时)26、动物嵌合体技术研究的历史和现状。
27、嵌合体的制作方法和应用前景。
核移植技术28、核移植技术的原理和意义。
29、核移植研究的历史和现状。
30、卵母细胞激活的机理和方法。
31、核移植的主要影响因素。
32、受体卵母细胞的去核和融合的方法。
33、供体细胞核周期的调控方法。
34、核移植技术的应用前景。
1.绪论动物胚胎工程就是以胚胎为研究对象，为了加速繁育经济动物，培育动物的优良品种，或挽救濒危动物使用的一系列工程技术方法，一般来说包括胚胎移植、试管动物（体外受精）、胚胎冷冻、胚胎分割、胚胎干细胞、核移植（克隆）技术等。
动物胚胎工程又称胚胎生物工程或胚胎生物技术，主要是对动物的卵子、精子和胚胎在体外条件下进行各种操作，以加速繁育经济动物，培育优良品种，或挽救濒危动物而使用的一系列工程技术方法。
生物工程包括基因工程、细胞工程、酶工程和发酵工程。
胚胎工程是细胞工程中的分支。
繁殖技术：同期发情、超数排卵、人工授精胚胎移植、体外受精、胚胎冷冻、胚胎分割、性别控制、动物克隆、发情鉴定、妊娠诊断、生殖免疫、助产技术、生殖疾病控制技术繁殖管理：从群体角度研究提高动物繁殖效率的理论与技术措施繁殖障碍及其防治：从畜牧学的角度分析动物繁殖障碍的发病率和病因，探讨防治繁殖障碍的方法与技术措施。
动物胚胎工程的研究内容：胚胎移植，胚胎分割，胚胎冷冻，体外受精，胚胎干细胞技术，转基因技术，动物克隆，性别控制，嵌合体技术胚胎移植：是指将一头良种母畜配种后的早期胚胎取出，移植到另外一头或数头同种的、生理状况相同或相似的母畜生殖道的适当部位，使之继续发育成新个体的过程。
胚胎分割技术：通过对胚胎进行显微操作，将一枚胚胎用显微手术等方法分割成二分、四分甚至八分胚，经体内或体外培养,然后移植入受体中，以得到同卵双生或同卵多生后代的技术。
其理论依据是早期胚胎的每一个卵裂球都具有独立发育成个体的全能性胚胎冷冻：胚胎的冷冻保存，是将胚胎贮存在－196℃，超低温下长期保存的方法。
胚胎的冷冻方法大体分为常规冷冻方法（慢速冷冻法）和玻璃化冷冻法两种。
胚胎干细胞技术：胚胎干细胞（embryonic stem cells，ES细胞）主要来自囊胚的内细胞团、早期胚胎的种细胞或胎儿的原始生殖细胞。
转基因技术：转基因动物就是用实验室方法将人们需要的目的基因导入动物的受精卵，使外源基因与动物本身的基因整合在一起，并随细胞的分裂而增殖，在动物体内得到表达，并能稳定地遗传给后代。
畜禽细胞与胚胎冷冻保种技术规范 NY T 1900-2010ICS 65.020.30B 43 NY中华人民共和国农业行业标准NY/ T 1900-2010畜禽细胞与胚胎冷冻保种技术规范Procedures for cell and embryo cryopreservation of domestic animals 2010-07-08 发布 2010-09-01 实施中华人民共和国农业部发布NY/T 1900-2010前古目本标准遵照 GB/T 1. 1-2009 给出的规则起草。
本标准由中华人民共和国农业部畜牧业司提出。
本标准由全国畜牧业标准化技术委员会(SAC/TC 274)归口。
本标准起草单位:全国畜牧总站。
本标准主要起草人:xiJ丑生、王志刚、赵俊金、史建民、孟飞、于福清、孙飞舟、邱小田。
INY/T 1900-2010畜禽细胞与胚胎冷冻保种技术规范1 范围本标准规定了用于保种的家畜精液、家畜卵母细胞、家畜胚胎和畜禽成纤维细胞冷冻保存技术要求。
本标准适用于家畜精液、家畜卵母细胞、家畜胚胎和畜禽成纤维细胞等遗传物质冷冻保存和检验人库。
2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。
凡是注日期的引用文件，仅注目期的版本适用于本文件。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB 4143 .牛冷冻精液GB 20557 山羊冷冻精液NY/T 1234 牛冷冻精液生产技术规程NY/T 1674 牛羊胚胎质量检测技术规程3 术语及定义下列术语和定义适用于本文件。
3. 1超低温保存 cryopreservation在液氮中冷冻保存遗传物质的技术。
3. 2卵母细胞 oocyte来源于有腔卵泡具有繁殖能力的细胞。
3. 3成纤维细胞 fibroblast以畜禽组织或胎儿为材料，体外培养、分离出的梭形或不规则形细胞。
胞质近中央处有椭圆形胞核，胞体→般铺展很开，细胞之间排列疏松，有较大细胞间隙。
