锦鲤疱疹病毒-CJ株-i-ORF-_i-81基因的克隆及生物信息学分析

!""# $$$%&'()*+,-%'.第!"卷第#$期$%##年#$月&水&产&学&报'()*+,-(../012*/20(.31/+,4567!" +57#$89:7 $%##文章编号 #%%%;%<#" $%## #$;#=B%;%=8(/ #%7!=$?@0A 7'7#$!#7$%##7#=<!?收稿日期 $%##%=#"&&&修回日期 $%##%>#?资助项目 国家自然科学基金项目 !%<=#<$#o周井祥 李新伟为同等贡献作者通讯作者 周井祥 2E F G H 6 a ]m MJPN#$<7:5F锦鲤疱疹病毒I 0S 株;!<N'基因的克隆及生物信息学分析周井祥 o &李新伟o &王&好 &吕文亮 &朱&霞吉林农业大学动物科技学院 动物生产及产品质量安全教育部重点实验室 吉林长春&#!%##B摘要 为了解锦鲤疱疹病毒中国吉林株 D 14E 3' (*.B#蛋白的结构特征和进化关系 用框镜鲤尾鳍原代细胞增殖D14E 3' 提取其8+, 经A 3*扩增 获得<!A B#基因 将其克隆到SY8#BE T 载体中 构建重组质粒 应用生物信息学方法初步分析D 14E 3'<!A B#基因的结构和功能 并与Z9J[G JV 上已公布的!株D 14构建系统进化树 结果显示 获得了长==#OS 的<!A B#基因 编码$"<个氨基酸 预测<!A B#基因的理论分子量为$B $?<7"%L 等电点为B7?%? 疏水性大于亲水性 信号肽切割部位最可能位于$>位的0 丝氨酸 有?个跨膜区 抗原表位预测显示抗原性良好 结构预测显示 不存在+E 糖基化位点 存在<个(E 糖基化位点和##个磷酸化位点 系统进化树分析显示 与锦鲤疱疹病毒以色列株属同一分支关键词 锦鲤疱疹病毒 <!A B#基因 克隆测序 生物信息学分析中图分类号 0>#= X=B"&&&&&&&文献标志码 ,&&锦鲤疱疹病毒病 V5H ]9Q S9W _H Q LWPH W 9G W 9 D 148 是由锦鲤疱疹病毒 V5H]9Q S9W _H Q LW D 14 感染锦鲤 /=7-)2+'*&-7).B .) 鲤 /=7-)2+'*&-7).*&-7). 及其普通变种如框镜鲤等而导致的一种具有高度传染性和致死性的疾病 #>>B 年D 14首次在以色列的Y G \G J Y H :]G 96地区和美国暴发 # $%%%年传至英国 德国和比利时 $ $%%$年?月 印度尼西亚发生此病 同年中国广东省和台湾省的锦鲤疑似发生此病 !;? $%%!年#%月日本证实该病已在本国存在 " 目前 该病在我国的鲤养殖中频繁发生 造成鲤的大量死亡 给鲤养殖业带来了严重危害 $%%=年国家质检总局发布警示预报 要求将D 14作为必检项目 并加强对其他国家进口的锦鲤和鲤的检测D 14是双股线形8+,病毒 是鱼类疱疹病毒属中基因组最大的病毒 < 目前 Z 9J[G JV 已经公布了!株分别来自日本 美国和以色列锦鲤疱疹病毒的基因序列 = 基因组大小为$>"VO 并含有$$VO 的末端同向重复序列 有#"<个开放性阅读框 (*. B 个末端重复序列 D 14的#"<个(*.的功能只有少数已经确定其功能 <!A $"和<!A >>编码膜糖蛋白 <!A B#和<!A B!编码主要囊膜蛋白 主要在细胞质中合成 B研究发现 <!A B#在大量表达时出现细胞核缩小 细胞从瓶壁脱落的现象 *(02+D *,+g 等 > 对<!A B#重组研究表明 其重组体蛋白的表达可作为免疫荧光试验和2-/0,检测D 14特异性血清抗体的诊断性抗原 还可以用于抗D 14的亚单位或8+,疫苗的研究 <!A =$和<!A >$编码衣壳蛋白 邱芮瑜 #% 研究表明 D 14的<!A =$和<!A >$可分别表达?=7<VL 和#?"VL 的蛋白 且二者表达量较大 可用于D 14的快速#$期周井祥"等!锦鲤疱疹病毒E3'株<!A B#基因的克隆及生物信息学分析&&检测)目前国内尚无有效控制D14的方法)本研究以本实验室在国内首次分离到的锦鲤疱疹病毒吉林株#D14E3'$基因组为模板"成功克隆到D14主要囊膜蛋白基因***<!A B#基因"并分析其生物学信息"旨在为锦鲤疱疹病毒的基因背景信息(发病机理(分子流行病学及基因工程疫苗的研究奠定基础)#&材料与方法'(')细胞与病毒锦鲤疱疹病毒中国吉林株#D14E3'$(锦鲤疱疹病毒尾鳍原代细胞由吉林农业大学动物生产及产品质量安全教育部重点实验室分离保存或提供&##')'(*)菌株与载体SY8#BE T载体购自大连宝生物工程有限公司":@*.1)81"!购自北京全式金生物技术有限公司)'(!)主要试剂新生牛血清(Z H O:5Y#>>培养基为/J_H R Q5\9J公司产品%2M8&98+,聚合酶(限制性内切酶#,&)和"%&)(8+,Y G Q V9Q等购自大连宝生物工程有限公司%凝胶回收试剂盒和质粒小提试剂盒购自天根生化有限公司)'(,)引物的设计与合成根据Z9J[G JV上登录的锦鲤疱疹病毒<!A B#基因序列"利用A Q H F9Q A Q9F H9Q W"7%软件设计#对引物"上游引物!A#"U E 333Z Z Z,T Z Z3,Z T3,33,,,Z3T E!U"下游引物!A$"U E T3T,Z,T3,33,3,T3T T Z33Z Z E!U"分别引入#,&)和"%&)限制性酶切位点#划线部位$"由上海生工生物工程技术服务有限公司合成)'(-)锦鲤疱疹病毒中国吉林株 J P T I0S ;!<N'基因的/0+扩增按照1,02Z,i,等&#$'和+2)D/*31等&#!'的方法培养细胞)将D14E3'病毒液接种框镜鲤尾鳍原代细胞单层"逐日观察细胞病变情况"收集细胞病变达=%b`B%b的细胞及上清液"收集病毒后常规方法提取病毒8+,"采用$"$-反应体系进行A3*扩增"反应条件如下!>"c预变性"F H J">?c?%W"">7!c!%W"=$c# F H J"!"个循环)'(L)锦鲤疱疹病毒中国吉林株 J P T I0S ;!<N'基因的克隆及鉴定将目的片段纯化回收后"与SY8#BE T载体连接"转化至81"!感受态细胞"氨苄青霉素筛选单菌落"提取重组质粒后以#,&)和"%&)双酶切鉴定阳性重组质粒"命名为SY8#BE T E B#"送至上海生工生物工程技术服务有限公司测序)'(M)锦鲤疱疹病毒中国吉林株 J P T I0S ;!<N'基因编码蛋白的生物信息学分析利用8+,0R G Q软件翻译出<!A B#基因的核苷酸序列%利用0H J\G6A_!7%#]R R S! f f f7:OW7 PR L7PV@W9Q_H:9W@0H\JG6A@$软件进行氨基酸序列的信号肽分析%利用T Y1YY09Q_9Q_7$7% #]R R S! f f f7:OW7PR L7PV@W9Q_H:9W@T Y1YY@$软件进行跨膜区分析%利用A Q5R0:G69#]R R S!f f f79MSG W K7:]@R556W@SQ5R W:G697]R F6$软件分析蛋白的疏水性%利用[9SH A Q9P#7%09Q_9Q#]R R S!f f f7:OW7PR L7PV@W9Q_H:9W@[9SH A Q9P@$软件和8+,0R G Q<7%#A Q5R9G J$对(*.B#序列编码的蛋白进行抗原表位分析%分别利用+9R+Z6K:#7% #]R R S! f f f7:OW7PR L7PV@W9Q_H:9W@+9R+Z6K:@$和e H J(e G J\#7$#]R R S! f f f7:OW7PR L7PV@ W9Q_H:9W@e H J(e G J\@$在线分析软件进行+E糖基化位点和(E糖基化位点预测"利用+9R A]5W$7% #]R R S! f f f7:OW7PR L7PV@W9Q_H:9W@+9R A]5W@$进行磷酸化位点预测)'(N)锦鲤疱疹病毒中国吉林株 J P T I0S ;!<N'基因的系统进化树分析从Z9J[G JV上分别下载锦鲤疱疹病毒日本株(美国株和以色列株的基因序列"利用8+,0R G Q<7%#Y9\,6H\9J$构建不同锦鲤疱疹病毒株的<!A B#基因进化树"分析其进化关系)$&结果*(')框镜鲤尾鳍原代细胞 =;0 接种J P T后细胞病变Y.3接种D14后""`<P出现细胞体积增大及少量的细胞空泡化"#%P后病变更加明显"且$(#$!""#! $$$%&'()*+,-%'.!""# $$$%&'()*+,-%'.&&&水&产&学&报!"卷细胞开始从瓶壁脱落图')J P T 在=;0产生的细胞病变;5<(')0E?A@2?D 5#7B B 7#?5:98#793E J P T*(*);!<N'基因的/0+扩增和鉴定A 3*扩增出一条与目的片段大小相符的8+,片段 图$ SY8#BE T E B#用#,&)和"%&)进行双酶切 获得一段约==#OS 的片段 图! 说明<!A B#基因片段已成功克隆至载体中*(!)锦鲤疱疹病毒中国吉林株 J P T I 0S ;!<N'基因的生物信息学分析基因的序列测定和编码蛋白质分子特征&测序结果表明 <!A B#基因长==#OS 为一完整的开放阅读框 编码$"<个氨基酸 预测(*.B#的理论分子量为$B $?<7"%L 等电点为B7?%? 含有$"个强碱性氨基酸 D * $#个强酸性氨基酸 8 2 #%"个疏水氨基酸 , / - . i 4 <!个极性氨基酸 + 3 X 0 T e信号肽分析&&将测得的(*.B#氨基酸序列在丹麦技术大学生物序列分析中心 3[0 的网站]R R S f f f 7:OW 7PR L7PV @W 9Q _H :9W @0H \JG 6A 进行在线分析 通过0H J\G 6A _!7%进行信号肽切割位点的预测 使用+9LQ G 6J9R E f 5Q V ++ 和1H PP9J YG Q V5_ 1YY 两种模型进行预测 前者能够对信号肽的分泌途径以及切割位点进行预测 预测值标示为0F 9G J 后者主要是对该氨基酸序列是否具有信号肽进行分析和预测 同时也对信号肽切割位点及分布进行预测 预测值表示为0SQ 5O 结果显示 图? ++和1YY 显示信号肽切割部位最可能位于$>位的0 丝氨酸图*)锦鲤疱疹病毒中国吉林株 J P T I 0S;!<N'基因的/0+扩增Y 8+,分子量标准 # $ A 3*产物;5<(*)/0+26@>5B 5#2?5A:AB U A5D 74@7.H548.0D 5:2S5>5:.?425:;!<N'<7:7Y 8-$%%%8+,Y G Q V9Q W # $ SQ 5PL:R 5^A 3*7图!)锦鲤疱疹病毒中国吉林株 J P T I 0S;!<N'基因的双酶切鉴定Y 8+,分子量标准 # SY 8#BE T E B#的双酶切产物;5<(!)1D 7597:?5B 5#2?5A:AB U A5D 74@7.H548.0D 5:2S5>5:.?425:;!<N'<7:78.5:<9A83>747.?45#?5A:7:V E67.95<7.?5A:Y B%%%8+,Y G Q V9Q W # SQ 5PL:R ^Q 5FSY 8#BE T E B#PH \9W R 9P OK #,&)G JP "%&)&&跨膜区分析&&T Y 1Y Y 预测(*.B#分别在??`<<位 B#`#%!位 #$%`#?$位 #<$`#B?位有?个跨膜区 图" 其中+末端和3末端都位于病毒膜内区疏水性分析&&通过A Q 5R 0:G 69在线分析表明 该蛋白具有一定疏水性 提示该蛋白高疏水性区与膜蛋白跨膜区有明显相关性 图<!(#$!""# $$$%&'()*+,-%'.#$期周井祥 等 锦鲤疱疹病毒E 3'株<!A B#基因的克隆及生物信息学分析&&图,)锦鲤疱疹病毒中国吉林株 J P T I 0S ;!<N'的信号肽预测G 0H \JG 6A ;++预测 9LV 在线分析 序列 O 0H \JG 6A ;11Y 预测 9LV 在线分析 序列;5<(,)1D 7@4795#?5A:AB .5<:2>@7@?597AB U A5D 74@7.H548.0D 5:2S5>5:.?425:;!<N'<7:7G 0H \JG 6A ;++SQ 9PH :R H 5J 9LV J9R f 5Q VW W 9IL9J:9 O 0H \JG 6A ;11Y SQ 9PH :R H 5J 9LV J9R f 5Q VW W 9IL9J:97图-)锦鲤疱疹病毒中国吉林株 J P T I 0S;!<N'的跨膜区分析序列的T Y 1Y Y 预测后概率;5<(-)142:.676342:79A625:2:2>E.5.AB U A5D 74@7.H548.0D 5:2S5>5:.?425:;!<N'<7:7T Y 1Y Y S5W R K9Q H 5Q SQ 5OG OH 6H R H 9W ^5Q W 9IL9J:97&&抗原表位分析&&用]R R S f f f 7:OW 7PR L7PV @W 9Q _H :9W @[9SH A Q 9P @在线软件及8+,0R G Q <7% A Q 5R 9G J 对锦鲤疱疹病毒<!A B#基因编码的蛋白进行抗原表位分析得出其抗原表位主要集中图L)锦鲤疱疹病毒中国吉林株 J P T I 0S;!<N'基因的疏水性分析序列的A Q 5R W :G 69分析输出信息;5<(L)P E94A@D A35#5?E 2:2>E.5.ABU A5D 74@7.H548.0D 5:2S5>5:.?425:;!<N'<7:7A Q 5R W :G 695LR SLR ^5Q LW 9Q W 9IL9J:97%(#$!""# $$$%&'()*+,-%'.&&&水&产&学&报!"卷在第=`#? $#`$B <B `== #%"`### #B?`$#$ $#B `$!>和$?"`$"?位氨基酸 图= 表明该蛋白的表面抗原决定簇主要位于这些区域 预示这些抗原表位可能与该病毒的致病性有关图M)锦鲤疱疹病毒中国吉林株 J P T I 0S ;!<N'基因的抗原表位分析;5<(M)1D 7@4795#?5A:AB ?D 72:?5<7:5#97?7465:2:?.AB U A5D 74@7.H548.0D 5:2S5>5:.?425:;!<N'<7:7&&糖基化及磷酸化位点的预测&&分别通过+9R +Z 6K:#7%在线分析软件和e H J(e G J\#7$在线分析软件对锦鲤疱疹病毒中国吉林株 D 14E 3' <!A B#进行+E 糖基化位点和(E 糖基化位点预测 结果表明 其氨基酸序列不存在潜在的+E 糖基化位点 分别在? #?B #"= $"$位存在?个潜在的(E 糖基化位点 用+9R A ]5W $7%在线分析软件对锦鲤疱疹病毒中国吉林株 D14E 3' (*.B#进行磷酸化位点进行预测 结果显示 当阈值取%7"时 其氨基酸存在##个潜在的磷酸化位点 包括?个09Q E 丝氨酸 #个T ]Q E 苏氨酸和<个T KQ E 酪氨酸位点*(,)锦鲤疱疹病毒中国吉林株 J P T I 0S ;!<N'基因的系统进化树分析从Z 9J[G JV 上分别下载锦鲤疱疹病毒日本株 D 14E ' 美国株 D 14E ) 和以色列株 D 14E / 的<!A B#基因 和中国吉林株 D 14E 3' <!A B#基因构建了系统进化树 图B 结果显示 D 14E 3'与D 14E /处于一个分支图N)锦鲤疱疹病毒中国吉林株 J P T I 0S;!<N'基因的系统进化树;5<(N)/D E>A<7:7?5#?477AB U A5D 74@7.H548.0D 5:2S5>5:.?425:;!<N'<7:7!&讨论锦鲤疱疹病毒病是由锦鲤疱疹病毒 D 14 引起的锦鲤和鲤的一种高致病性疾病 该病多发生在水温为#B `$B c 的春秋季节 具有高度传染性 发病率和死亡率均可高达B%b `#%%b B 目前 锦鲤疱疹病毒病已在多国爆发 造成了巨大的经济损失 防治病毒性传染病的有效方法是疫苗免疫 目前 该病较为有效的疫苗是减毒疫苗 免疫锦鲤和鲤 免疫保护率可达B%b 以上 #? 但是弱毒苗存在散播病毒和病毒变异的可能 而且在国内还没有研制出有效的弱毒疫苗 因此 需要进一步研究安全有效的基因工程疫苗 避免病毒的散播并消除病毒变异的可能性 并填补目前国内没有有效疫苗的空白 控制D14在我国暴发流行 而本研究选用D14E 3'<!A B#基因进行克隆和生物信息学分析 正是为基因工程疫苗的研制打下基础本实验成功获得了长==#OS 的<!A B#基因 生物信息学分析表明 其编码的蛋白具有?个跨膜区 抗原表位预测显示抗原性良好 使用+9LQ G 6J9R E f 5Q V ++ 和1H PP9J Y G Q V5_ 1Y Y 两种模型对其信号肽进行预测 显示信号肽切割部位最可能位于$>位的0 丝氨酸 氨基酸 信号肽是引导翻译出的前体蛋白通过细胞膜分泌到胞外的一段序列 只有切除信号肽序列后前体蛋白才能进入到分泌信号区 变成具有正常功能的成熟蛋白 #" 因此预测信号肽切割位点 可以对进行表达研究的引物设计和表达载体的构建提供有价值的信息 另外 含有信号肽的蛋白质一般都是分泌到细胞外 可能作为重要的细胞因子起作用 从而具有潜在的应用价值 通过分析软件分析表明 其氨基酸序列不存在潜在的+E 糖基化位点 具有?个潜在的(E 糖基化位点 糖基化是真核生物蛋白质翻译前或翻译后的一个重要修饰过程 并可提高蛋白基因组的多样性 #< 其中+E 糖基化作用位点与抗原性和免疫原性有关 #=系统进化树分析表明 锦鲤疱疹病毒中国吉林株 D 14E 3' <!A B#基因与以色列株的进化关系最近 同源性为#%%b 所以可怀疑D 14是由以色列等欧美国家传播至我国 这为D 14有效疫苗的引进 以及研究资料的参考提供了依据本研究以在我国首次分离到的锦鲤疱疹病毒&(#$#$期周井祥 等 锦鲤疱疹病毒E3'株<!A B#基因的克隆及生物信息学分析&&中国吉林株的8+,作为模板 成功将其<!A B#基因克隆 并采用生物信息学方法对<!A B#的结构和功能进行了分析 为我国锦鲤疱疹病毒的基因背景信息 发病机理 分子流行病学及基因工程疫苗的研究奠定了基础参考文献# &128*/3D*A Z/-,8( e)+0 $(&17, ]9Q S9W_H Q LW G W W5:H G R9P f H R]F G W W F5Q R G6H R K5^m L_9JH69G JP G PL6R V5H G W R Q G H J5^:5F F5J:G Q S ' 7'5LQ JG65^,ILG R LQ96,JH F G619G6R] $%%% #$ # ??;"=7$ &1,2+2+(Y i,e D [2*Z Y,++0Y $(&17 T]99F9Q\9J:95^V5H]9Q S9W_H Q LW G JP H R W W H\JH^H:G J:9R52LQ5S9G J G ILG:L6R LQ9 ' 7[L669R H J5^R]92LQ5S9G J,W W5:H G R H5J5^.H W]A G R]565\H W R W $%%? $? <$>!;!%=7! &刘荭 史秀杰 高隆英 等7进口锦鲤暴发病病原的J9W R9PE A3*鉴定 ' 7华中农业大学学报 $%%$ $#" ?#?;?#B7? &徐达 涂坚7锦鲤疱疹病毒传播媒介之探讨 ' 7台湾兽医志 $%%= !! $ BB;>"7" &//8,T 0,+(Y7D5H]9Q S9W_H Q LWPH W9G W9 ' 7 )H Q LW L $%%" "" # #?";"#7< &A/D,*0D e2 *(+2+, ,[*,Y(i/T g' $(&17A G R]5\9J9W H W5^G:LR9_H Q G6PH W9G W9H JPL:9P H J^H W]OK:G Q S H JR9Q W R H R H G6J9S]Q H R H W G JP\H66J9:Q5W H W_H Q LW ' 7'5LQ JG65^4H Q565\K $%%? =B #= >"??;>""#7= &,(D/T 1/*(+(/ D)*(D,i,D $(&17 Z9J5F9W9IL9J:9W5^R]Q99V5H]9Q S9W_H Q LWH W56G R9WQ9SQ9W9JR H J\R]99MSG JPH J\PH W R Q H OLR H5J5^G J9F9Q\H J\PH W9G W9R]Q9G R9JH J\V5H G JP:5F F5J:G Q Sf5Q6Pf H P9 ' 7'5LQ JG65^4H Q565\K $%%= B# #%"%"B;"%<"7B &朱霞 王好 李新伟 等7锦鲤疱疹病毒病的研究进展 ' 7中国兽医科学 $%## ?# # #%<;##%7 > &*(02+D*,+g8 D-)A A[Z T2/.D2'A $(&17 /P9JR H^H:G R H5J5^9J_965S9SQ5R9H J S(*.B#5^V5H]9Q S9W_H Q LW ' 7'5LQ JG65^Z9J9Q G64H Q565\K $%%BB> ? B><;>%%7#% &邱芮瑜7锦鲤疱疹病毒结构蛋白之表现 ' 7家畜卫试所学术研讨专讯 $%%B $ =;#%7## &朱霞 李新伟 王好 等7一株锦鲤疱疹病毒的分离与鉴定 ' 7中国预防兽医学报 $%## !! "!?%;!?!7#$ &1,02Z,i,0 0(Y,Y(T(T +,D,e,0)3 $(&17,:9666H J9 3.D ^Q5F^H J5^H W5\9J9H:\H JOLJG:Q LW H G J:G Q S ' 7.H W]A G R]565\K #>>= !$ $#$=;#$B7#! &+2)D/*31Y [(T T312*D [)++,'/*,D)-07/W56G R H5J5^G_H Q LW^Q5F D5H f H R]G6R9Q9P\H66W' 7[L669R H J5^R]92LQ5S9G J,W W5:H G R H5J5^.H W]A G R]565\H W R W #>>> #> " $$#;$$?7#? &A2*2-[2*Z, *(+2+, 8/01(+, $(&17 3]G Q G:R9Q H a G R H5J5^R]9_H Q LW:G LW H J\:G Q S F G W WF5Q R G6H R K 3K14E! 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