树突状细胞培养方法

一、实验目的1. 了解树突状细胞（Dendritic Cells，DCs）的基本特性及其在免疫调节中的作用。

2. 掌握DCs的分离、培养和鉴定方法。

3. 学习利用DCs进行免疫调节实验。

二、实验原理树突状细胞是机体免疫系统中重要的抗原提呈细胞，具有摄取、加工和呈递抗原的能力。

DCs在启动、调控和维持免疫应答中发挥着关键作用。

本实验通过分离、培养和鉴定DCs，探讨DCs在免疫调节中的作用。

三、实验材料1. 试剂：胎牛血清、RPMI 1640培养基、DMEM培养基、双抗、TNF-α、IL-4、抗鼠CD14抗体、FITC标记的羊抗鼠IgG抗体等。

2. 仪器：CO2培养箱、倒置显微镜、流式细胞仪等。

四、实验方法1. DCs分离与培养（1）取健康小鼠脾脏，置于DMEM培养基中，剪碎后用200目筛网过滤。

（2）将滤液加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，在37℃、5%CO2条件下培养。

（3）培养3天后，加入TNF-α和IL-4，继续培养至第7天。

2. DCs鉴定（1）收集培养的细胞，用抗鼠CD14抗体进行标记。

（2）用FITC标记的羊抗鼠IgG抗体进行二次染色。

（3）流式细胞仪检测细胞表面CD14的表达情况。

3. 免疫调节实验（1）将分离得到的DCs与抗原共同培养，观察DCs对抗原的摄取和呈递能力。

（2）将DCs与T细胞共同培养，观察DCs对T细胞的激活作用。

五、实验结果1. DCs分离与培养：培养7天后，观察到细胞形态呈树突状，符合DCs的形态特征。

2. DCs鉴定：流式细胞仪检测结果显示，细胞表面CD14的表达率为（95±3）%，说明成功分离出DCs。

3. 免疫调节实验：（1）DCs对抗原的摄取和呈递：在抗原刺激下，DCs能够摄取并呈递抗原，说明DCs具有抗原摄取和呈递能力。

（2）DCs对T细胞的激活作用：在DCs与T细胞共同培养条件下，观察到T细胞增殖，说明DCs具有激活T细胞的作用。

树突状细胞培养方法树突状细胞（Dendritic Cells，DCs）是一类免疫细胞，主要负责识别和激活T细胞，发挥着重要的免疫调节和抗肿瘤等作用。

为了进行树突状细胞的研究，科研人员需要对其进行体外培养。

本文将介绍常用的树突状细胞培养方法。

1.制备树突状细胞前驱细胞：树突状细胞前驱细胞主要存在于外周血和骨髓中。

首先，采集外周血或骨髓，并将其进行红细胞裂解。

然后，用PBS洗涤样品，离心沉淀细胞。

最后，将细胞进行培养。

2.培养基的选择：培养树突状细胞需要选择适宜的培养基。

目前常用的培养基有RPMI1640、DMEM等。

添加10-20%的胎牛血清（FBS）可以提供必要的生长因子和营养物质。

3.添加生长因子：在培养树突状细胞的过程中，可能需要添加一些生长因子来促进细胞的分化和增殖。

常见的生长因子包括GM-CSF（粒细胞巨噬细胞集落刺激因子）和IL-4（白细胞介素4）。

可以将这些生长因子添加到培养基中，以达到最佳生长条件。

4.细胞培养条件的控制：树突状细胞对培养条件非常敏感。

因此，需要对温度、湿度、CO2浓度等参数进行严格控制。

一般来说，将细胞培养在37摄氏度、5%CO2的培养箱中。

5.细胞的分离和传代：在树突状细胞培养过程中，细胞会不断增殖。

为了保证细胞的活力和稳定性，需要定期分离和传代细胞。

可以使用胰酶等消化酶将细胞从培养瓶中剥离，然后进行细胞计数并按照一定比例进行传代。

6.细胞质量的评估：在培养树突状细胞的过程中，需要对细胞质量进行评估。

可以通过使用流式细胞仪等设备来检测细胞表面标记物的表达情况，以及细胞活力、树突状突起的形态等指标来评估细胞的质量。

7.树突状细胞的激活：树突状细胞的主要功能是激活T细胞。

为了使树突状细胞具备充分的抗原递呈能力，可以使用多种促进细胞激活的方法，如脂多糖、TNF-α等。

总结：树突状细胞培养方法包括制备前驱细胞、培养基选择、生长因子添加、细胞培养条件控制、细胞分离和传代、细胞质量评估以及细胞的激活等步骤。

小鼠骨髓来源树突状细胞（BMDC）的培养1、取骨髓，对倍稀释2、用滴管沿管壁缓慢加入淋巴细胞分离液(45度角倾斜，尽量产生气泡，起到缓冲作用)3、2000转，离心30分钟4、吸取白膜层，（沿管壁）交替多次吸取，加入5倍体积以上的PBS液5、1500转，离心15分钟（洗掉血小板）6、弃掉上清，留少许回流液，轻弹管壁，加入PBS液至50ml7、800转，离心10分钟，（洗掉红细胞）8、重复两至三次9、加入PBS液至50ml，计数:？个细胞离心后铺板，1X1076孔板培养液，共铺20板。

无血清1640+DNA酶12h后轻晃培养液，洗板后加入完全培养基和GM—CSF(1000U/ml)和IL—4(500U/lml) 10、第三天每孔补加等体积的完全培养基和GM—CSF(1000U/ml)和IL—4(500U/lml) ，这时细胞部分悬浮11、第五天为imDC，+1LPS(1ug/ml),诱导至第七天，为mDC。

参考Inaba等人的方法，并根据本实验室的经验稍作改进。

即：1. 颈椎脱位法处死C57BL/6小鼠，无菌状态下取股骨和胫骨，浸泡在RPMI-1640培养基中。

2. 用1ml注射器吸取RPMI-1640培养液，从骨干的一端刺入骨髓腔，将骨髓冲洗到一无菌培养皿中，每根骨头反复4～6遍，收集培养皿中的骨髓细胞悬液，离心，1500 rpm×10min。

3. 弃去上清，加入5 ml无菌Tris-NH4Cl溶液悬浮细胞溶解红细胞，于室温下静置2分钟溶解红细胞后，再次离心，1500 rpm×5min，弃上清。

4. 用RPMI-1640培养液洗涤后将细胞用完全培养基悬浮，分至6孔培养板中，并在每孔中加入完全培养基至4 ml，再加入rmGM-CSF至终浓度10 ng/ml，IL-4终浓度10ng/ml。

5. 将细胞培养板放入37℃，含5% CO2的孵箱中培养48小时。

6. 轻轻吹打细胞后，连同培养液一起吸去悬浮细胞，仅保留贴壁细胞。

大鼠骨髓树突状细胞的分离和培养杨贺勤;张震宇【期刊名称】《现代妇产科进展》【年(卷),期】2009(18)7【摘要】目的:探讨体外分离和培养大鼠源性树突状细胞的方法,及其经卵巢肿瘤提取物致敏后在体内诱发抗肿瘤免疫效应。

方法:(1)取大鼠骨髓悬液,经Tris-NH4Cl裂解红细胞后得到大鼠骨髓单个核细胞;(2)应用大鼠重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rrGM-CSF)、大鼠重组白细胞介素4(rrIL-4)、大鼠重组肿瘤坏死因子-α(rrTNF-α)进行体外培养;(3)培养第5天时加入NuTu-19 Fischer 344大鼠卵巢肿瘤细胞提取物,获得负载卵巢肿瘤提取物的树突状细胞;(4)体内实验检测DC诱发抗肿瘤免疫效力。

结果:(1)大鼠骨髓来源的骨髓单个核细胞(bone marrow mononuclear cells,BMMNC)在相关细胞因子作用下可培养出成熟的树突状细胞;(2)体内实验表明,预先免疫的大鼠肿瘤出现时间较晚,肿瘤生长速度较慢,与对照组有显著差异(P<0.05),抑瘤率59.4%;治疗组大鼠在实验过程中肿瘤体积小,最终肿瘤质量轻,与对照组有显著差异(P<0.05),与先行免疫组无明显差异(P>0.05),抑瘤率69.3%。

结论:大鼠骨髓来源的BMMNC可培养出成熟的树突状细胞。

DC可负载并提呈肿瘤提取物,体内实验显示肿瘤提取物致敏的树突状细胞可以杀伤肿瘤细胞。

【总页数】4页(P486-489)【关键词】树突状细胞;大鼠,近交F344;肿瘤提取物;细胞培养【作者】杨贺勤;张震宇【作者单位】首都医科大学宣武医院妇产科;首都医科大学附属北京朝阳医院妇产科【正文语种】中文【中图分类】R737.33【相关文献】1.大鼠骨髓来源树突状细胞的体外分离培养鉴定初步研究 [J], 黄江波;罗志刚;刘宇明;刘利;何群君;言彩红;李建军;龙向阳2.大鼠骨髓来源树突状细胞的分离、培养及鉴定 [J], 张升宁;李立;冉江华;邵剑春;李铸;刘静3.大鼠骨髓树突状细胞的分离培养及HMGB1/TLR4信号通路的调控作用 [J], 王涵磊;薛继阳;葛捍伟;夏杰;林炜;赵琦峰4.大鼠骨髓树突状细胞的体外分离培养及生物学特性研究 [J], 叶建新;陈卫昌;黄小平;高楠5.大鼠骨髓树突状细胞的分离培养及HMGB1/TLR4信号通路的调控作用 [J], 王涵磊;薛继阳;葛捍伟;夏杰;林炜;赵琦峰;因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

bmdc培养方法BMDC培养方法是一种常用的小鼠树突状细胞(Dendritic Cell, DC)培养方法，主要用于研究DC的功能和调控机制。

以下是关于BMDC 培养方法的详细介绍：1. 实验材料准备：小鼠骨髓细胞RPMI-1640培养基小鼠GM-CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)和IL-4(白细胞介素-4)无菌培养箱、离心机、显微镜等实验设备2. BMDC的获取：从小鼠的股骨和胫骨中提取骨髓细胞，用RPMI-1640培养基洗涤并悬浮。

将骨髓细胞以1×10^6/mL的密度接种到无菌的培养瓶中，加入GM-CSF和IL-4，使其终浓度分别为50ng/mL和20ng/mL。

将培养瓶置于37℃，5%CO2的培养箱中，每两天更换一次培养基。

3. BMDC的成熟：在BMDC培养的第5天，用GM-CSF和IL-4继续诱导BMDC的成熟。

此时，GM-CSF的浓度可以降低至25ng/mL，而IL-4的浓度可以维持在20ng/mL。

在BMDC培养的第7天，观察BMDC的形态变化，成熟的BMDC 呈树突状，表面有丰富的毛刺状突起。

此时，可以收集成熟的BMDC 进行后续实验。

4. BMDC的功能检测：将成熟的BMDC与抗原提呈细胞(如B细胞、T细胞等)共培养，观察BMDC对抗原提呈细胞的激活作用。

将成熟的BMDC与特异性抗体结合，观察BMDC对抗原的识别和摄取能力。

将成熟的BMDC与免疫细胞(如T细胞、NK细胞等)共培养，观察BMDC对免疫细胞的调节作用。

5. BMDC的应用：用于研究DC的功能和调控机制，如DC的抗原提呈、共刺激信号传导、凋亡抑制等。

用于制备疫苗，通过激活T细胞和B细胞，提高机体对病原体的免疫力。

用于研究免疫耐受、自身免疫性疾病等疾病模型。

总之，BMDC培养方法是一种常用的小鼠树突状细胞培养方法，通过诱导骨髓细胞分化为成熟的树突状细胞，可以用于研究DC的功能和调控机制，以及制备疫苗等应用。

树突状细胞的培养与鉴定【摘要】目的研究利用磁珠分离方法获取单核细胞，用细胞因子gm-csf和il-4联合诱导使之分化为树突状细胞（dendritic cells, dcs）的方法，并对培养的细胞从形态，表型，功能等三个方面进行鉴定，从而探索出一套较成熟的dcs的培养方法。

方法通过密度梯度离心的方法获取白细胞悬液中的白膜层，然后通过磁珠分离的方法，收集高纯度的单核细胞。

在细胞因子gm-csf和il-4的刺激下，将细胞培养至7天左右，收集细胞进行流式分析，并进行淋巴细胞增殖实验，鉴定细胞是否为树突状细胞。

结果在倒置显微镜下观察，细胞培养第7天，大部分细胞呈单个悬浮，并有明显的毛刺样突起。

流式分析发现细胞高表达dc表面特异性抗原cd80，cd86，hla-dr，并且不再表达单核细胞表面抗原cd14，细胞纯度约为93.12%。

淋巴细胞增殖实验显示dcs可明显刺激初始型淋巴细胞增殖。

结论通过磁珠分离的方法获得单核细胞并利用gm-csf和il-4细胞因子诱导可成功培养出纯度高的树突状细胞。

【关键词】树突状细胞；磁珠；流式molecular and functional characteristics of dendritic cells differentiated from highly purified blood monocytes. 【abstract】 objectives：to develop a simple and efficient method to generate human dendritic cells (dcs) from highly purified cd14 + monocytes from human peripheral blood. methods：monocytes were purified by negatively sortingperipheral blood mononuclear cells (pbmc) with dynal magnetic negative isolation kit. monocytes were then differentiated into immature dendritic cells stimulated by the combination of interleukin-4 (il-4) and granulocyte-macrophagecolony-stimulating factors (gm-csf) for 7days. cells were analyzed for phenotype by flow cytometry。

专利名称：一种小鼠骨髓来源树突状细胞的培养方法专利类型：发明专利
发明人：国林沛,解晖,杨宪法,王准,彭双鹤,唐慧琴
申请号：CN202111468217.1
申请日：20211203
公开号：CN114058585A
公开日：
20220218
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及细胞培养领域，特别是小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDC)的原代培养。

该细胞培养步骤，包括：步骤A：获取小鼠完整的股骨；步骤B：获取股骨中的骨髓干细胞；步骤C：将骨髓干细胞接种于细胞培养板中，并加入细胞因子，刺激分化为树突状细胞。

本发明提供了一种经济高效的培养小鼠骨髓来源树突状细胞的方法，数十分钟即可获得大量的骨髓干细胞，加入少量的细胞因子培养6‑8天即可获得2×107以上成熟的树突状细胞。

申请人：无锡市第二人民医院
地址：214001 江苏省无锡市梁溪区中山路68号
国籍：CN
代理机构：天津佳盟知识产权代理有限公司
代理人：林玉慧
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