蛋白质异源表达及其稳定性的定向进化

蛋白异源表达纯化那些事儿研究蛋白质功能、生产功能型蛋白质基本都离不开蛋白质的异源表达及纯化，今天小编将从以下几个方面与大家聊一聊蛋白质表达、纯化的那些事。

1、标签选择目前常见的表达标签有His-tag（组氨酸标签）、GST-tag（谷胱甘肽巯基转移酶标签）、MBP-tag（麦芽糖结合蛋白标签）、CBD-tag（几丁质结合区标签）等。

每种标签都具有独特的性质，比如标签的分子量、对蛋白可溶性的调节能力、对蛋白折叠的影响、是否需切除等。

根据自己要纯化的蛋白的特性，选择合适的标签。

标签选的好，后续的实验事半功倍。

2、载体构建选好要用的标签后，就要准备构建表达载体了。

目前已有很多商品化的载体可供选择，例如带His-tag的pET28系列，带MBP-tag的pMAL系列等。

绝大多数的载体系列，都包含了标签插入N端或C端的形式，可以根据自己的蛋白的特质进行灵活选择。

插入蛋白的编码基因时需要注意，不要出现移码。

如果想要自己从头构建载体，别忘了插入合适的启动子和转录终止序列。

启动子序列一般使用诱导型启动子，组成型启动子会导致外源蛋白过早表达积累，不利于宿主增殖。

3、宿主选择常见的宿主有大肠杆菌、哺乳动物细胞、酵母以及昆虫。

以大肠杆菌来说，最适合做异源表达的菌株为BL21及其衍生菌株，但仍需要根据载体中选择的转录、翻译元件来挑选。

BL21中内源性的蛋白酶基因缺失，因此是一种适合于外源蛋白表达的菌株，但是它没有T7 RNA 聚合酶，所以不能用于含T7启动子蛋白表达；BL21(DE3)，在BL21的基础上整合了T7噬菌体基因组，适合T7表达系统，如pET系列；BL21(DE3)PLySs，在BL21(DE3)基础，附带了T7溶菌酶基因，可以更为严谨控制T7聚合酶的表达。

需要注意的是，由于核酸内切酶（endA1）重组酶（recA1）等基因的存在，质粒在BL21系列菌株中不那么稳定，可能出现整合至基因组、丢失、突变等现象，所以构建好的载体仍需保存在DH5α之类的菌株中。

酶蛋白的异源表达的意义和作用
【实用版】
目录
1.酶蛋白异源表达的定义和意义
2.酶蛋白异源表达的作用
3.酶蛋白异源表达的应用案例
4.酶蛋白异源表达的发展前景
正文
一、酶蛋白异源表达的定义和意义
酶蛋白异源表达是指将外源基因插入到宿主细胞的基因组中，使宿主细胞表达出具有生物活性的外源酶蛋白。

这种技术对于研究基因功能、蛋白质相互作用以及生物技术应用具有重要的意义。

通过异源表达，我们可以在短时间内获得大量具有生物活性的酶蛋白，这对于科研和工业生产具有极大的价值。

二、酶蛋白异源表达的作用
酶蛋白异源表达的作用主要体现在以下几个方面：
1.研究基因功能：通过异源表达，我们可以获得大量具有生物活性的目的酶蛋白，从而可以对目的基因的功能进行深入研究。

2.蛋白质相互作用研究：异源表达技术可以用于研究蛋白质之间的相互作用，揭示生物体内复杂的信号传导途径。

3.生物技术应用：酶蛋白异源表达可以用于制备生物催化剂、生物传感器、药物研发等生物技术领域。

三、酶蛋白异源表达的应用案例
1.伏马毒素解毒酶基因的克隆异源表达及其性质研究：利用异源表达
技术，研究人员成功获得了具有生物活性的伏马毒素解毒酶，并研究了其性质。

2.利用异源表达技术制备生物催化剂：通过异源表达，研究人员获得了具有高活性的乳糖酶，并将其应用于乳糖的水解过程。

四、酶蛋白异源表达的发展前景
随着生物技术的不断发展，酶蛋白异源表达技术在科研和工业生产中的应用将越来越广泛。

未来，随着基因编辑技术的不断完善，异源表达技术的效率和准确性也将得到进一步提升。

蛋白质表达和稳定性研究的新技术探究随着生物技术的发展，越来越多的重大疾病得到了治疗，其中大部分基于研究蛋白质。

在诸多技术中，蛋白质表达和稳定性研究始终是重点和难点。

但现在，一些新技术正在被探究和应用，为蛋白质表达和稳定性研究提供了新的选择。

一、基于DNA编码的蛋白质库传统的蛋白质表达研究主要依靠体外或体内酵母等菌株表达，但这些方法在高通量筛选和大规模构建蛋白质库方面存在问题。

基于DNA编码的蛋白质库则提供了解决方案。

该技术通过化学合成或PCR等方法合成大量DNA序列，每个DNA序列都编码一个蛋白质。

这些DNA序列封装到噬菌体或其他病毒颗粒中，构成了一个蛋白质库。

这种方法可以在短时间内轻松地获得数百万种不同的蛋白质，并且可以通过筛选、分离和鉴定得到特定的蛋白质。

基于DNA编码的蛋白质库不仅提高了研究的效率，还避免了传统蛋白质表达研究中蛋白质无法高效表达的风险。

因此，该技术被广泛应用于药物研究和医学诊断等领域。

二、透明质酸-蛋白质复合物的研究蛋白质表达中的一个难题是如何保持蛋白质的稳定性，防止其在表达过程中、储存过程中或药物输送过程中降解、失活、聚集或与其他分子结合。

这些问题可以通过透明质酸-蛋白质复合物的研究来解决。

透明质酸-蛋白质复合物有多种形式，包括凝胶、微球和纳米粒等。

这些复合物在蛋白质表达和储存中都具有重要作用。

它们能够稳定蛋白质的构象和结构，延长蛋白质的半衰期，提高药物输送的效果。

透明质酸-蛋白质复合物被广泛应用于生物制药和药物研究中。

例如，透明质酸-蛋白质复合物已经被用于制备持续性释放的蛋白质药物，用于治疗癌症和慢性疼痛等疾病。

三、蛋白质工程技术蛋白质工程技术是一种通过人为改变蛋白质分子结构和性质的方法。

蛋白质工程技术不仅可以改变蛋白质在表达过程中的稳定性，还可以增强其活性和特异性，还可以挖掘新的蛋白质功能。

蛋白质工程技术被广泛应用于研究和工业领域。

蛋白质工程技术主要包括以下几种方法：点突变、嵌合蛋白质的构建、蛋白-多肽突变和蛋白质三维结构设计等。

蛋⽩质⼯程蛋⽩质⼯程绪论对已存在的蛋⽩质分⼦进⾏改造蛋⽩质分⼦的稳定性（热稳定性、化学稳定性、压⼒稳定性、催化效率），不良反应，半衰期，免疫原性，⽣物活性发展简史1926 脲酶纯化酶的本质是p，核糖核酸酶1953 ⽜胰岛素肽链结构的解析1965 ⼈⼯合成⽜胰岛素蛋⽩1982 基因定点突变⾸次应⽤（酪氨酰tRNA合成酶）1983 protein engineering 的发表（正式诞⽣）1988 ⾸次从头设计新蛋⽩研究内容1. 蛋⽩质结构分析——基础2. 结构、功能的设计和预测——基础的应⽤与验证3. 创造/改造蛋⽩质——新蛋⽩——终⽬标应⽤：抗病毒药β-⼲扰素稳定性的改进。酪氨酰tRNA合成酶改变酶的专⼀性蛋⽩质的理化性质⼀、热⼒学函数内能：组成物体的所有分⼦的⽆规则运动的动能与分⼦间相互作⽤的势能之和。·焓：是⼀个系统的热⼒学参数。它描述的是体系的⼀个状态性质，它的改变量仅仅取决于系统的始态和终态，⽤符号H表⽰，即： H=E+pV其中，E为系统内能，p为其压强，V则为体积。·熵（S）:是度量体系混乱度的热⼒学函数。

从微观的⾓度来看，熵具有统计意义，它是体系微观状态数(或⽆序程度)的⼀种量度。熵值⼩的状态，对应于⽐较有秩序的状态，熵值⼤的状态，对应于⽐较⽆秩序的状态。

·热⼒学第⼀定律：能量既不能创⽣也不能消灭。⽤数学⽅式表达为：ΔU = 0，其含义是，在任何隔离系统中系统储藏的能量不变。能量守恒·热⼒学第⼆定律：⾃发过程向熵值（宇宙的总的混乱程度）增加的⽅向进⾏。⽤数学⽅式表达为：ΔS ＞ 0，其含义是，在任何隔离系统中，不违背第⼀定律的过程得以进⾏的最起码的条件是该系统的熵值增加。

吉布斯⾃由能(G):亦称吉布斯函数，它是定温定压下系统的状态函数。可以⽤公式表⽰为：G = H - TS 当ΔG＜0 时，⾃发过程，被称为是放能的过程，它们可以⽤来做功；当ΔG＝0 时，反应已达到平衡，即其正向过程和逆向过程正好处于平衡；当ΔG＞0 时，⾮⾃发过程，被称为吸能的过程，必须注⼊⾃由能才能驱动此类过程。稳定蛋⽩质三维结构的作⽤⼒：氢键、范德华⼒、疏⽔作⽤⼒和盐键（离⼦键）及共价⼆硫键。盐桥或离⼦键⼜称盐键，它是正电荷与负电荷之间的⼀种静电相互作⽤。盐键的形成既是静电相互作⽤的过程也是熵增的结果。·范德华⼒有三种来源：取向⼒ :取向⼒是极性分⼦间的固有偶极同极相互排斥异极相互吸引，定向排列，产⽣分⼦间作⽤⼒。诱导⼒ :诱导⼒是极性分⼦与⾮极性分⼦的固有偶极与诱导偶极间的作⽤⼒，它的⼤⼩与分⼦的极性和变形性等有关。⾊散⼒ :⾊散⼒是⾮极性分⼦间瞬时偶极距的相互作⽤⼒。范德华⼒包括吸引⼒和斥⼒。

山东农业大学学报(自然科学版),2008,39(4):653-656Journal of Shandong Agricultural University (Natural Science )　 蛋白质定向进化的高通量筛选方法黄春晓,段学军(中原工学院能源与环境学院,河南郑州　451191)摘要:定向进化是改造蛋白质分子的有效新策略。

创建突变库的方法已经有很多而且比较通用,而建立有效的高通量的筛选方法是蛋白质定向进化成功的关键。

本文综述了近几年发展起来的用于定向进化的高通量的文库筛选方法,介绍了各种展示技术及流式细胞分选技术的原理及其在文库筛选中的应用,分析了存在的问题及发展趋势。

关键词:定向进化;高通量筛选方法;展示技术;流式细胞分选技术中图分类号:Q 93 文献标识码:A 文章编号:1000-2324(2008)04-0653-04收稿日期:2006-07-27基金项目:河南省教育厅自然科学基金作者简介:黃春晓(1968-),女,汉族,河南叶县人,副教授,硕士,主要从事环境生物技术的研究。

HI GH -THR OUGHPUT SCREENI NG M ETH ODS I N THE D I RECTE D EV OLUTI O N OF PR OTEI NSHUANG Chun -xiao,DUAN Xue -jun(College of Energy &Envir onment of Zhongyuan University of Technol ogy ,Zhengzhou 450007,China )Abstract:D irected evoluti on is a ne w po werful strategy f or engineering p r oteins .Many feasible methods f or gen 2erating gene libraries are devel oped .Therefore devel op ing the high -thr oughput screening methods f or desired mutants is the key t o the success in directed evoluti on .I n this article,we summarize the high -thr oughput screening methods devel oped resent years such as F ACS (Fluorescence -activated cell s orting )and the dis p lay technol ogy including phage dis p lay,cell -surface dis p lay,ribos o me dis p lay and mRNA -pep tide fusi on .Their p rinci p les and app licati on in screening for desired mutants fr om mutant libraries are intr oduced .W ediscuss the unres olved questi ons and p r om ising p r os pect in the screening methods .Key words:D irected evoluti on;high -thr oughput screening;method;dis p lay technol ogy;F ACS 定向进化技术可以将自然界漫长的蛋白质改造过程缩短到数年、数月、甚至数天。

异源蛋白表达高拷贝策略
异源蛋白表达高拷贝策略是指通过采用合适的方法和策略，使异源蛋白在宿主细胞中能够高效地表达出来，以获得大量的目标蛋白。

以下是一些常用的异源蛋白表达高拷贝策略：
1. 使用高拷贝数质粒：选择具有高拷贝数的质粒载体，如pUC系列质粒，可以提高目标蛋白的表达水平。

2. 选择适当的宿主细胞：某些宿主细胞具有高表达异源蛋白的能力，例如大肠杆菌（E. coli）BL21(DE3)等。

3. 优化启动子和转录因子：使用强启动子和适当的转录因子可以增强目标蛋白的转录水平，提高表达效率。

4. 调整培养条件：优化培养基组成、温度、pH值、培养时间等条件，可以提高细胞的生长速度和目标蛋白的表达水平。

5. 优化诱导条件：对于适应感受子的异源蛋白表达系统，通过优化诱导剂的浓度、诱导时间等条件，可以提高目标蛋白的表达水平。

6. 利用融合蛋白增加稳定性：将目标蛋白与稳定性较高的蛋白进行融合，可以增加目标蛋白的稳定性和表达水平。

7. 应用外源信号肽：外源信号肽可以将蛋白定位到适当的细胞
区域，如细胞质、内质网、细胞外等，提高蛋白的表达和分泌效率。

总之，通过合理选择质粒载体、宿主细胞和适当的表达调控策略，结合优化培养条件和转化方法，可以实现异源蛋白高拷贝表达。

定向进化技术在蛋白质开发中的应用进展张志来;陈建华【期刊名称】《中国医药生物技术》【年(卷),期】2014(000)006【总页数】4页(P464-466,445)【作者】张志来;陈建华【作者单位】210009 南京，中国药科大学生命科学与技术学院;210009 南京，中国药科大学生命科学与技术学院【正文语种】中文定向进化技术是一种利用实验室手段通过反复改造遗传多样性，结合文库高通量筛选而获得理想性状生物体的过程，现已成为在基础生物学和应用生物学领域应用最广泛和最有效的技术之一。

目前已成功应用于蛋白质的研究和开发。

蛋白质在生物催化、生物医药等领域具有广泛的应用。

如何提高目的蛋白的产量、改善蛋白质的理化特性以及构建具有新催化活性的蛋白质以满足日益增长的需求是亟待解决的问题。

而定向进化技术的发展为实现这样的目的提供了强有力的技术支持。

本文就定向进化技术在蛋白质开发中的应用进行了综述。

与理性突变方法相比，定向进化技术具有独特的优势：突变体的构建无需受蛋白质结构信息的限制。

早先的定向进化技术的靶标多数是单个蛋白，通过随机或定点插入突变，获得稳定性更好或催化活性更高的突变体以适应工业化要求。

而近年来的趋势则转向于对代谢途径甚至是基因组水平进行改造，以创造新型全细胞催化剂用于合成有价值的生物产品[1]。

目前，比较经典的定向进化技术有易错 PCR 技术和 DNA 改组技术等，而新兴的技术则是在这两种技术的基础上改进发展起来的。

易错 PCR 是利用 Taq DNA 聚合酶，或改变 PCR 反应体系的条件，在 DNA 聚合过程中随机引入错配碱基，其突变位点发生在分子内部，是应用最早、最成熟的一种定向进化方法[2]。

易错 PCR 无需改变基因的长度，突变频率可以根据反应条件进行相应的控制，并且能有效地获得理想突变体，在蛋白质定向进化中得到了广泛的应用。

但是易错 PCR 只能发生点突变，而且获得活性突变体的效率比较低，因此其应用受到了一定的限制。

人类异源蛋白的表达和功能研究异源蛋白是指从不同物种中提取出来的蛋白质或通过基因工程等方式制造出来的蛋白质。

人类的研究发现，异源蛋白在很多方面都具有重要的应用价值，因此对人类异源蛋白的表达和功能进行研究，对生命科学领域的发展具有重要的意义。

一、异源蛋白的表达异源蛋白的合成受到物种、基因、环境等因素的影响。

因此，在研究异源蛋白的表达过程中，需要考虑到这些因素对蛋白表达的影响。

基因工程技术是目前研究异源蛋白表达的主要方法之一。

例如，通过将人类源和动物源的基因重组，最终得到与人类蛋白质相同或类似的蛋白质，以满足各种需求。

基因重组的方式可以大致分为两种：一种是将异源DNA序列嵌入表达蛋白的载体中，由宿主菌体培养并表达。

通常利用能表达高含量蛋白质的细胞系（如CHO细胞）或真核系统（如哺乳动物肝脏细胞）来表达。

另外一种是通过利用指定的启动子、转录因子和蛋白质论破酶等调控因子，在宿主组织中表达并制备目标蛋白质。

二、异源蛋白的功能1. 生物医学领域异源蛋白在生物医学领域具有广泛的应用。

例如，转化人类肝素治疗血栓疾病的药物等，都是由异源蛋白质制备而成。

此外，一些疫苗和制剂也是由异源蛋白制备而成，如人乳头瘤病毒疫苗、重组乙型肝炎疫苗等。

2. 农业领域异源蛋白在农业领域中也得到了广泛的应用。

例如，在水稻中大量表达胰岛素样生长因子1（IGF1），可以增加作物的光合作用和产量，同时还可以提高可食部分蛋白的含量。

通过研究异源蛋白的应用，我们可以找到更多的方法和途径来提高农作物的生产效益，以满足人类不断增长的粮食需求。

3. 工业领域异源蛋白在工业领域也具有潜在的应用价值。

目前在很多领域中都有广泛的应用，如制药、化妆品、食品等。

异源蛋白可以用于改进或开发新的功能性制品，新材料、甚至可用于细胞器重组等。

4. 环境领域随着环境污染和能源危机的加剧，异源蛋白也开始在环境领域中得到广泛的应用。

例如，通过利用装有重组异源菌群的全自动或半自动设备，可以减少工业废水中有毒物质的含量。

动物营养学报２０２１，３３（１０）：５８８７⁃５８９４ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｉｍａｌＮｕｔｒｉｔｉｏｎ㊀ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００６⁃２６７ｘ．２０２１．１０．０４７通过定向进化技术提高角蛋白酶的热稳定性研究傅㊀岩１㊀张铁鹰１∗㊀孙英霞１㊀李松育２（１．中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，动物营养学国家重点实验室，北京１００１９３；２．山西农业大学动物科学学院，太原０３０８０１）摘㊀要：本试验旨在通过定向进化技术提高角蛋白酶的热稳定性，以拓展角蛋白酶在饲料工业的适用性㊂试验采用易错ＰＣＲ方法对地衣芽孢杆菌ＣＰ⁃１６的角蛋白酶进行定向进化，筛选获得耐温性好的突变体，并对其进行酶学性质研究与结构功能分析㊂结果表明，从５０００个突变体中获得３株正向角蛋白酶突变体Ａ３０７Ｖ／Ｓ３４６Ｔ㊁Ｒ７０Ｇ㊁Ｎ２４５Ｋ，其角蛋白酶热稳定性得到了提高㊂酶学性质研究发现，角蛋白酶突变体Ｒ７０Ｇ热稳定性最强，在７５ħ热处理５ｍｉｎ后残留酶活性达３０．６５％，而野生型角蛋白酶热处理５ｍｉｎ后残留酶活性仅１．０６％㊂由此可见，本研究成功获得热稳定性较好的角蛋白酶突变体，拓展了角蛋白酶的适用性，为耐热角蛋白酶开发和相关基因信息探索提供了参考㊂关键词：角蛋白酶；定向进化；热稳定性中图分类号：Ｓ８１６．７㊀㊀㊀㊀文献标识码：Ａ㊀㊀㊀㊀文章编号：１００６⁃２６７Ｘ（２０２１）１０⁃５８８７⁃０８收稿日期：２０２１－０３－３０基金项目：国家自然科学基金面上项目（３１４７０１２２）；中国农业科学院科技创新工程专项经费（ＡＳＴＩＰ⁃ＩＡＳ０８）作者简介：傅㊀岩（１９９６ ），女，重庆人，硕士研究生，研究方向为酶与抗营养因子㊂Ｅ⁃ｍａｉｌ：５６４１３６２７４＠ｑｑ．ｃｏｍ∗通信作者：张铁鹰，副研究员，硕士生导师，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｚｈｔｙ９９９＠１６３．ｃｏｍ㊀㊀角蛋白结构稳定㊁疏水性极强［１－２］，动物内源蛋白酶难以将其有效降解［３］㊂家禽屠宰副产物羽毛中粗蛋白质含量在９０％以上，若能高效利用可有助于缓解我国蛋白质饲料资源供需矛盾㊂传统物理㊁化学方法处理角蛋白存在诸多不足，产品氨基酸营养品质差，且易产生环境污染［４－５］㊂目前，已经发掘出多种角蛋白降解菌，包括细菌［６－９］㊁真菌［１０－１２］㊁放线菌等［１３－１４］，这些菌株均可分泌能特异性降解角蛋白的蛋白酶 角蛋白酶㊂角蛋白酶可水解不溶性角蛋白［１５－１６］，是处理羽毛等角蛋白资源的较优的生物制品［５，１７］，可用于处理羽毛，提高其营养价值［１８－１９］，或直接用作饲料添加剂［２０］㊂㊀㊀角蛋白热稳定性强，可耐受饲料制粒温度，在高温条件下可提高其酶促反应速率㊂本实验室前期研究发现，地衣芽孢杆菌ＣＰ⁃１６角蛋白酶的热稳定性不佳［１５］㊂因此，改善角蛋白酶热稳定性，对提高其酶解羽毛角蛋白效率和在畜禽饲粮中应用具有重要意义㊂目前有关角蛋白酶结构与功能的研究报道较少，大多设计均参考同源性较高的其他类型蛋白酶［２１］㊂易错ＰＣＲ无需了解蛋白酶结构功能关系，可快速建立突变体文库，实现角蛋白酶分子改良［２２－２３］㊂因此，本研究拟通过易错ＰＣＲ构建角蛋白酶突变体文库，以期获得活力高㊁耐温性好的角蛋白酶突变体，提高其在饲料工业中的适用性㊂１㊀材料与方法１．１㊀主要试剂㊁质粒和培养基㊀㊀易错ＰＣＲ试剂盒（北京天恩泽基因科技有限公司）；ＰｒｉｍｅＳＴＡＲＭａｘＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝日医生物技术有限公司）；地衣芽孢杆菌ＣＰ⁃１６为本实验室前期筛选保存，并获得了其角蛋白酶基因全长序列［１５］；ｐＷＢ９８０⁃Ｋ⁃Ｈｉｓ为本实验室保藏㊂㊀㊀筛选培养基：脱脂奶粉２０ｇ／Ｌ，琼脂粉１５ｇ／Ｌ，高压灭菌１５ｍｉｎ后，加入卡那霉素至终浓度５０μｇ／ｍＬ，制作平板，冷却备用㊂㊀动㊀物㊀营㊀养㊀学㊀报３３卷㊀㊀发酵培养基：ＬＢ液体培养基（５０μｇ／ｍＬ卡那霉素）㊂１．２㊀角蛋白酶突变文库的构建㊀㊀以含角蛋白酶基因的重组质粒ｐＷＢ９８０⁃Ｋ⁃Ｈｉｓ为模板，使用特异基因的上游㊁下游引物对角蛋白酶基因进行易错ＰＣＲ扩增，使用引物对载体ｐＷＢ９８０⁃Ｋ⁃Ｈｉｓ进行线性化扩增㊂表１㊀引物序列Ｔａｂｌｅ１㊀Ｐｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅｓ引物Ｐｒｉｍｅｒｓ序列Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ（５ᶄң３ᶄ）ＫＦ：ＡＡＧＧＡＧＡＣＡＴＧＡＡＣＧＡＴＧＡＴＧＡＧＧＡＡＡＡＡＧＡＧＴＫＲ：ＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＴＴＧＡＧＣＧＧＣＡＧＣＴＴＣＧＡＣＡＶＦ：ＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＴＡＡＴＴＣＡＧＣＡＣＡＡＴＴＣＣＡＶＲ：ＣＴＣＴＴＴＴＴＣＣＴＣＡＴＣＡＴＣＧＴＴＣＡＴＧＴＣＴＣＣＴＴ㊀㊀Ｋ表示角蛋白酶基因，Ｖ表示载体，下划线部分为目的基因与载体的同源重叠序列㊂㊀㊀Ｋｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄｋｅｒａｔｉｎａｓｅｇｅｎｅ，Ｖｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄｖｅｃｔｏｒ，ａｎｄｔｈｅｕｎｄｅｒｌｉｎｅｄｐａｒｔｗａｓｔｈｅｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｔｈｅｔａｒｇｅｔｇｅｎｅａｎｄｖｅｃｔｏｒ．㊀㊀参考Ｚｈａｎｇ等［２４］的方法，将纯化后的线性化载体和角蛋白酶基因片段进行延长重叠延伸ＰＣＲ（ＰＯＥ⁃ＰＣＲ），以实现质粒多聚化㊂ＰＣＲ产物转入枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＳＣＫ６感受态细胞，稀释涂布于牛奶筛选平板㊂１．３㊀突变体初筛与复筛㊀㊀为同时获得活性高㊁热稳定性好的突变体，挑选水解圈与菌落直径比值大于野生型的阳性转化子，摇瓶发酵，检测粗酶液角蛋白酶活性和热稳定性，进行复筛㊂以１００目脱脂羽毛粉（０．５％）为底物，测定经７０ħ热处理５ｍｉｎ后的粗酶液残留酶活性（以未经处理的粗酶液酶活性为１００％）㊂角蛋白酶活性测定参考王德山［１５］的方法㊂１．４㊀野生型和突变型角蛋白酶的纯化㊀㊀以复筛后的正向突变菌株为出发菌，制备粗酶液，经超滤浓缩㊁镍柱纯化获得目的蛋白，十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ）验证纯化后酶蛋白纯度及分子质量㊂１．５㊀野生型和突变型角蛋白酶的酶学性质研究㊀㊀真实底物羽毛粉为不溶底物，为保证数据的精准性，酶学性质测定均使用可溶性蛋白－酪蛋白为底物［１５］，所有处理均设置３个重复㊂㊀㊀分别于不同ｐＨ（７．０㊁８．０㊁８．５㊁９．０㊁９．５㊁１０．０㊁１１．０㊁１２．０㊁１３．０）缓冲液体系，５５ħ，测定野生型和突变型角蛋白酶活性，确定适宜ｐＨ㊂以最高酶活性为１００％，绘制酶活性随ｐＨ变化曲线㊂所用缓冲体系：Ｔｒｉｓ⁃ＨＣＬ缓冲体系（２００ｍｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ７．０ ９．０），硼砂－氢氧化钠缓冲体系（１００ｍｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ９．５ １２．０），氯化钾－氢氧化钠缓冲体系（ｐＨ１３．０）㊂㊀㊀在适宜ｐＨ和不同反应温度（４０㊁４５㊁５０㊁５５㊁６０㊁６５㊁７０㊁７５ħ）条件下，测定野生型和突变型角蛋白酶活性，确定适宜反应温度，最高的酶活性定义为１００％，绘制相对酶活性随反应温度变化曲线㊂㊀㊀纯酶液分别在５５㊁６５㊁７５㊁８５ħ下热处理５ｍｉｎ，适宜条件下测定酶活性，以未经处理的酶活性为１００％，计算不同温度处理后的酶活性残留率㊂㊀㊀配制不同浓度（０．５㊁０．８㊁１．０㊁１．３㊁１．５㊁２．０㊁２．５㊁５．０㊁８．０㊁１０．０㊁１２．０ｍｇ／ｍＬ）酪蛋白底物溶液，适宜条件下反应１０ｍｉｎ，测定酶活性㊂利用双倒数法作图，计算动力学参数㊂１．６㊀野生型和突变型角蛋白酶晶体结构模型构建与分析㊀㊀运用ＳＷＩＳＳ⁃ＭＯＤＥＬ［２４］和ＤｉｓｃｏｖｅｒｙＳｔｕｄｉｏＶｉｓｕａｌｉｚｅｒ４．０对野生型和突变型角蛋白酶晶体进行同源建模及三维结构分析㊂２㊀结㊀果２．１㊀突变型角蛋白酶初筛与复筛㊀㊀经易错ＰＣＲ成功构建出角蛋白酶突变体文库（图１），在牛奶平板挑选水解圈与菌落直径比值不小于野生型的转化子共５６４株进行摇瓶发酵，测定角蛋白酶的热处理后残留酶活性，获得３株正向突变体㊂由表２可知，角蛋白酶突变体８８８５１０期傅㊀岩等：通过定向进化技术提高角蛋白酶的热稳定性研究Ａ３０７Ｖ／Ｓ３４６Ｔ㊁Ｒ７０Ｇ㊁Ｎ２４５Ｋ热处理后残留酶活性分别为７２．１２％㊁８６．１２％㊁７４．８２％，均高于野生型角蛋白酶（５０．３２％）㊂图１㊀阳性转化子在牛奶平板上产生的水解圈Ｆｉｇ．１㊀Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓｃｉｒｃｌｅｆｏｒｍｅｄｂｙｐｏｓｉｔｉｖｅｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓｏｎｍｉｌｋｐｌａｔｅ２．２㊀野生型和突变型角蛋白酶纯化后酶蛋白ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ分析㊀㊀野生型和突变型角蛋白酶纯化后酶蛋白的ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ分析结果见图２，目的蛋白条带分子质量与预期一致，单一㊁无杂带，可用于下一步分析㊂２．３㊀野生型和突变型角蛋白酶酶学性质分析㊀㊀经不同ｐＨ条件下蛋白酶活性测定分析，野生型角蛋白酶和角蛋白酶突变体Ａ３０７Ｖ／Ｓ３４６Ｔ适宜ｐＨ为１０，角蛋白酶突变体Ｒ７０Ｇ㊁Ｎ２４５Ｋ适宜ｐＨ为１１（图３）㊂这说明突变位点影响了其适宜ｐＨ㊂㊀㊀不同温度条件下，角蛋白酶突变体Ａ３０７Ｖ／Ｓ３４６Ｔ㊁Ｒ７０Ｇ㊁Ｎ２４５Ｋ适宜反应温度相较野生型发生偏移（图４）；同时，角蛋白酶突变体Ａ３０７Ｖ／Ｓ３４６Ｔ㊁Ｒ７０Ｇ㊁Ｎ２４５Ｋ的热稳定性也相应提升（表３）㊂这说明突变位点均影响了其适宜反应温度和热稳定性㊂表２㊀野生型与突变型角蛋白酶发酵液酶活性及热处理后残留酶活性Ｔａｂｌｅ２㊀Ｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｂｒｏｔｈａｎｄｒｅｓｉｄｕａｌｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙａｆｔｅｒｈｅａｔｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｗｉｌｄ⁃ｔｙｐｅａｎｄｍｕｔａｎｔ⁃ｔｙｐｅｋｅｒａｔｉｎａｓｅ菌株Ｓｔｒａｉｎｓ发酵液酶活性Ｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｂｒｏｔｈ／（Ｕ／ｍＬ）热处理后残留酶活性Ｒｅｓｉｄｕａｌｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙａｆｔｅｒｈｅａｔｔｒｅａｔｍｅｎｔ／％野生型Ｗｉｌｄ⁃ｔｙｐｅ５０．７４５０．３２突变型Ｍｕｔａｎｔ⁃ｔｙｐｅＡ３０７Ｖ／Ｓ３４６Ｔ４５．５５７２．１２Ｒ７０Ｇ４５．４０８６．１２Ｎ２４５Ｋ６０．６０７４．８２㊀㊀Ｍ：中分子质量蛋白ｍａｒｋｅｒ；１：野生型ｗｉｌｄ⁃ｔｙｐｅ；２：突变体Ａ３０７Ｖ／Ｓ３４６ＴｍｕｔａｎｔＡ３０７Ｖ／Ｓ３４６Ｔ；３：突变体Ｒ７０ＧｍｕｔａｎｔＲ７０Ｇ；４：突变体Ｎ２４５ＫｍｕｔａｎｔＮ２４５Ｋ㊂图２㊀ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ分析Ｆｉｇ．２㊀ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥａｎａｌｙｓｉｓ图３㊀野生型与突变型角蛋白酶适宜ｐＨＦｉｇ．３㊀ＯｐｔｉｍｕｍｐＨｏｆｗｉｌｄ⁃ｔｙｐｅａｎｄｍｕｔａｎｔ⁃ｔｙｐｅｋｅｒａｔｉｎａｓｅ９８８５㊀动㊀物㊀营㊀养㊀学㊀报３３卷图４㊀野生型与突变型角蛋白酶适宜反应温度Ｆｉｇ．４㊀Ｏｐｔｉｍｕｍｒｅａｃｔｉｏｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｏｆｗｉｌｄ⁃ｔｙｐｅａｎｄｍｕｔａｎｔ⁃ｔｙｐｅｋｅｒａｔｉｎａｓｅ２．４㊀野生型和突变型角蛋白酶动力学参数㊀㊀采用双倒数法作图计算角蛋白酶动力学参数，与野生型角蛋白酶相比，角蛋白酶突变体Ａ３０７Ｖ／Ｓ３４６Ｔ㊁Ｒ７０Ｇ㊁Ｎ２４５Ｋ对底物的亲和力与催化效率均有所提升（表４）㊂２．５㊀野生型和突变型角蛋白酶晶体结构模型构建及分析㊀㊀角蛋白酶突变体Ａ３０７Ｖ／Ｓ３４６Ｔ㊁Ｎ２４５Ｋ的突变位点位于成熟肽区域，直接以成熟肽氨基酸序列建模，以地衣芽孢杆菌的枯草菌溶素（ＰＤＢ蛋白质数据库ＩＤ：３ｕｎｘＡ）为模板得到野生型角蛋白酶和角蛋白酶突变体Ａ３０７Ｖ／Ｓ３４６Ｔ㊁Ｎ２４５Ｋ晶体的三维结构模型图（图５）㊂角蛋白酶突变体Ｒ７０Ｇ的突变位点位于前导肽区域，用前导肽与成熟肽氨基酸序列建模，以枯草蛋白酶Ｅ（ＰＤＢ蛋白质数据库ＩＤ：３ｗｈｉ．１．Ａ）为模板进行同源建模得到野生型角蛋白酶和角蛋白酶突变型Ｒ７０Ｇ前导肽的三维结构模型图（图６）㊂角蛋白酶突变体Ａ３０７Ｖ／Ｓ３４６Ｔ㊁Ｎ２４５Ｋ㊁Ｒ７０Ｇ突变位点分析如图７所示㊂据结构模型显示，３种突变型角蛋白酶突变前后的蛋白质结构均无明显变化㊂表３㊀野生型与突变型角蛋白酶５ｍｉｎ热处理后残留酶活性Ｔａｂｌｅ３㊀Ｒｅｓｉｄｕａｌｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙａｆｔｅｒｈｅａｔｔｒｅａｔｍｅｎｔ５ｍｉｎｏｆｗｉｌｄ⁃ｔｙｐｅａｎｄｍｕｔａｎｔ⁃ｔｙｐｅｋｅｒａｔｉｎａｓｅ％菌株Ｓｔｒａｉｎｓ热处理温度Ｈｅａｔｔｒｅａｔｍｅｎｔｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ／ħ５５６５７５８５野生型Ｗｉｌｄ⁃ｔｙｐｅ６７．０９５．６７突变型Ｍｕｔａｎｔ⁃ｔｙｐｅＡ３０７Ｖ／Ｓ３４６Ｔ８０．０５４８．７４１０．０６Ｒ７０Ｇ７６．８１３．０１３０．６５Ｎ２４５Ｋ７１．８１７．１１表４㊀野生型与突变型角蛋白酶动力学参数Ｔａｂｌｅ４㊀Ｋｉｎｅｔｉｃｐａｒａｍｅｔｅｒｓｏｆｗｉｌｄ⁃ｔｙｐｅａｎｄｍｕｔａｎｔ⁃ｔｙｐｅｋｅｒａｔｉｎａｓｅ菌株Ｓｔｒａｉｎｓ米氏常数Ｋｍ／（ｍｇ／ｍＬ）催化常数ｋｃａｔ／（ｓ－１）专一性常数ｋｃａｔ／Ｋｍ／［ｓ－１／（ｍｇ／ｍＬ）］野生型Ｗｉｌｄ⁃ｔｙｐｅ１０．０４ʃ０．９２６８．８８ʃ０．１０６．８６突变型Ｍｕｔａｎｔ⁃ｔｙｐｅＡ３０７Ｖ／Ｓ３４６Ｔ７．３１ʃ０．２５５９．２７ʃ２．７０８．１１Ｒ７０Ｇ７．３５ʃ０．１７５４．６２ʃ０．６３７．４３Ｎ２４５Ｋ６．３６ʃ０．６２５０．１６ʃ２．６４７．８９３㊀讨㊀论㊀㊀本试验利用易错ＰＣＲ方法，对角蛋白酶进行定向进化，获得了３株耐温性较好的角蛋白酶突变体Ａ３０７Ｖ／Ｓ３４６Ｔ，Ｒ７０Ｇ㊁Ｎ２４５Ｋ，反映出易错ＰＣＲ在酶分子改造方面具有较好的便捷性㊂初筛所选转化子水解圈均不小于野生型，但角蛋白酶突变体Ａ３０７Ｖ／Ｓ３４６Ｔ㊁Ｒ７０Ｇ的粗酶液角蛋白酶活性为野生型角蛋白酶的８９％左右，仅角蛋白酶突变体Ｎ２４５Ｋ的发酵液酶活性相对野生型角蛋白０９８５１０期傅㊀岩等：通过定向进化技术提高角蛋白酶的热稳定性研究酶提升了１９．４３％，这说明水解圈与发酵酶活性水平间存在不一致性，复筛十分必要㊂图５㊀野生型角蛋白酶（ａ）和角蛋白酶突变体Ａ３０７Ｖ／Ｓ３４６Ｔ（ｂ）㊁Ｎ２４５Ｋ（ｃ）晶体的三维结构模拟示意图Ｆｉｇ．５㊀３Ｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｄｉａｇｒａｍｏｆｃｒｙｓｔａｌｏｆｗｉｌｄ⁃ｔｙｐｅｋｅｒａｔｉｎａｓｅ（ａ）ａｎｄｋｅｒａｔｉｎａｓｅｍｕｔａｎｔＡ３０７Ｖ／Ｓ３４６Ｔ（ｂ），Ｎ２４５Ｋ（ｃ）图６㊀野生型角蛋白酶（ａ）和角蛋白酶突变体Ｒ７０Ｇ（ｂ）前导肽的三级结构模拟示意图Ｆｉｇ．６㊀３Ｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｄｉａｇｒａｍｏｆｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅｏｆｗｉｌｄｔｙｐｅｋｅｒａｔｉｎａｓｅ（ａ）ａｎｄｋｅｒａｔｉｎａｓｅｍｕｔａｎｔＲ７０Ｇ（ｂ）㊀㊀Ｖａｌ：缬氨酸ｖａｌｉｎｅ；Ｔｈｒ：苏氨酸ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ；Ｌｙｓ：赖氨酸ｌｙｓｉｎｅ；Ｇｌｕ：谷氨酸ｇｌｕｔａｍａｔｅ；Ｇｌｙ：甘氨酸ｇｌｙｃｉｎｅ㊂图７㊀角蛋白酶突变体Ａ３０７Ｖ／Ｓ３４６Ｔ（ａ，ｂ）㊁Ｎ２４５Ｋ（ｃ）㊁Ｒ７０Ｇ（ｄ）突变位点分析Ｆｉｇ．７㊀ＡｎａｌｙｓｉｓｏｆｍｕｔａｎｔｓｉｔｅｓｏｆｋｅｒａｔｉｎａｓｅｍｕｔａｎｔｓＡ３０７Ｖ／Ｓ３４６Ｔ（ａ，ｂ），Ｎ２４５Ｋ（ｃ）ａｎｄＲ７０Ｇ（ｄ）㊀㊀野生型角蛋白酶与３个突变型角蛋白酶在ｐＨ８ １２的缓冲体系中酶活性变化趋势平稳㊂角蛋白酶突变体Ｒ７０Ｇ㊁Ｎ２４５Ｋ的适宜ｐＨ后移至１１，在ｐＨ１２表现出比野生型更高的相对活性，在碱性ｐＨ宽泛性增加，利于在碱性条件下快速处理羽毛角蛋白，在洗涤与纺织业也有较好利用前景㊂但在畜禽小肠ｐＨ（６．０ ７．０）条件下，野生型和突变型角蛋白酶活性均大幅降低，影响其作用发挥，后续研究需进一步通过定向进化㊁Ｃ端截短㊁结构域重组等分子改造手段提高其ｐＨ稳定性［２１－２２］㊂㊀㊀根据纯化酶蛋白热处理后酶活性残留情况可见，部分突变型角蛋白酶出现７５ħ组活性高于６５ħ组的现象，这可能与在特定条件下出现蛋白酶自溶现象有关［２５－２６］㊂与此同时还发现，纯酶热稳定性明显低于粗酶液，可能是粗酶液中细菌代谢产生的蛋白与角蛋白酶结合暂时形成酶－底物复合物［２７］，构象相对稳定㊂以上现象产生的原因与机制尚需进一步深入研究㊂㊀㊀本研究共获得４个角蛋白酶突变位点㊂角蛋白酶突变体Ａ３０７Ｖ／Ｓ３４６Ｔ的３０７位的丙氨酸（Ａｌａ）位于２个β折叠之间的ｌｏｏｐ区域，Ａｌａ的构象不稳定，被替换为缬氨酸（Ｖａｌ）后，构象的稳定性和氨基酸的疏水性均有所增强㊂疏水作用是蛋白质折叠主要驱动力［２８－２９］，有利于蛋白质三级结构稳定㊂Ｖａｌ疏水性增强有助于反应区疏水环境的形成，降低结合状态的自由能，有利于底物与酶的结合，促进催化反应进行，这可能是角蛋白酶突变体Ａ３０７Ｖ／Ｓ３４６Ｔ在适宜反应温度与热稳定性提升的同时，还保留了较高活性的主要原因㊂而３４６位氨基酸丝氨酸（Ｓｅｒ）与苏氨酸（Ｔｈｒ）的结构功能均较为接近，可能不是影响酶学性质改变的主要突变因素㊂角蛋白酶突变体Ｎ２４５Ｋ的２４５位氨基酸天冬酰胺（Ａｓｎ）位于α螺旋，Ａｓｎ在高温下易发生脱酰胺作用，不利于蛋白质的热稳定性，嗜热蛋白中一般含有较少的Ａｓｎ和谷氨酰胺［３０－３２］㊂同时，已有研究揭示增加蛋白质表面负电荷氨基酸可提高酶稳定性［３３］，Ａｓｎ被替换为赖氨酸（Ｌｙｓ）后可能更有利于α螺旋的稳定㊂Ｌｙｓ在蛋白表面引入负电荷可能通过静电作用力，形成离子键，稳定了蛋白质结构㊂角蛋白酶突变体Ｒ７０Ｇ的７０位氨基酸位于酶前导肽２个β折叠间的ｌｏｏｐ上，由精氨酸（Ａｒｇ）变为结构最为简单的甘氨酸（Ｇｌｙ），侧链仅有１个氢原子，空间位阻小㊂空间位阻的１９８５㊀动㊀物㊀营㊀养㊀学㊀报３３卷改变可能对前导肽结构起优化作用，并进一步影响成熟肽空间结构，从而提升了突变体的热稳定性㊂已有研究探明前导肽与脂肪酶的热稳定性相关［３４］，但在角蛋白酶的研究中多将前导肽与酶活性进行关联分析，前导肽与蛋白酶稳定性间的关系尚无相关报道，该研究结果或许可为今后耐热蛋白酶理性设计提供新的思路㊂４㊀结㊀论㊀㊀本试验通过易错ＰＣＲ成功对地衣芽胞杆菌ＣＰ⁃１６来源的角蛋白酶进行了定向进化，筛选到热稳定性提升的角蛋白酶突变体，拓展了角蛋白酶的适用性，并分析了其热稳性提高的分子基础，为耐热蛋白酶理性设计提供新思路㊂参考文献：［１］㊀ＳＵＺＵＫＩＹ，ＴＳＵＪＩＭＯＴＯＹ，ＭＡＴＳＵＩＨ，ｅｔａｌ．Ｄｅ⁃ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｏｆｅｘｔｒｅｍｅｌｙｈａｒｄ⁃ｔｏ⁃ｄｅｇｒａｄｅａｎｉｍａｌｐｒｏ⁃ｔｅｉｎｓｂｙｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃｂａｃｔｅｒｉａ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｓｃｉ⁃ｅｎｃｅａｎｄＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２００６，１０２（２）：７３－８１．［２］㊀ＫＲＥＰＬＡＫＬ，ＤＯＵＣＥＴＪ，ＤＵＭＡＳＰ，ｅｔａｌ．Ｎｅｗａｓ⁃ｐｅｃｔｓｏｆｔｈｅａｌｐｈａ⁃ｈｅｌｉｘｔｏｂｅｔａ⁃ｓｈｅｅｔｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｉｎｓｔｒｅｔｃｈｅｄｈａｒｄａｌｐｈａ⁃ｋｅｒａｔｉｎｆｉｂｅｒｓ［Ｊ］．ＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌＪｏｕｒｎａｌ，２００４，８７（１）：６４０－６４７．［３］㊀ＪＡＧＡＤＥＥＳＡＮＹ，ＭＥＥＮＡＫＳＨＩＳＵＮＤＡＲＡＭＳ，ＳＡＲＡＶＡＮＡＮＶ，ｅｔａｌ．Ｓｕｓｔａｉｎａｂｌｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ｂｉｏ⁃ｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｒｍｏ⁃ａｎｄ⁃ｓｏｌｖｅｎｔｓｔａｂｌｅａｌｋａｌｉｎｅｓｅｒｉｎｅｋｅｒａｔｉｎａｓｅｆｒｏｍｎｏ⁃ｖｅｌＢａｃｉｌｌｕｓｐｕｍｉｌｕｓＡＲ５７ｆｏｒｐｒｏｍｉｓｉｎｇｐｏｕｌｔｒｙｓｏｌｉｄｗａｓｔｅｍａｎａｇｅｍｅｎｔ［Ｊ］．ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏ⁃ｌｏｇｉｃａｌＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２０２０，１６３：１３５－１４６．［４］㊀ＳＨＡＲＭＡＳ，ＧＵＰＴＡＡ．Ｓｕｓｔａｉｎａｂｌｅｍａｎａｇｅｍｅｎｔｏｆｋｅｒａｔｉｎｗａｓｔｅｂｉｏｍａｓｓ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓａｎｄｆｕｔｕｒｅｐｅｒｓｐｅｃ⁃ｔｉｖｅｓ［Ｊ］．ＢｒａｚｉｌｉａｎＡｒｃｈｉｖｅｓｏｆＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏ⁃ｇｙ，２０１６，５９：１－１４．［５］㊀ＢＲＡＮＤＥＬＬＩＡ，ＳＡＬＡＬ，ＫＡＬＩＬＳＪ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｎ⁃ｚｙｍｅｓｆｏｒｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎｏｆｐｏｕｌｔｒｙｗａｓｔｅｉｎｔｏａｄｄｅｄ⁃ｖａｌｕｅｐｒｏｄｕｃｔｓ［Ｊ］．ＦｏｏｄＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，２０１５，７３：３－１２．［６］㊀ＣＨＥＮＧＳＷ，ＨＵＨＭ，ＳＨＥＮＳＷ，ｅｔａｌ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｋｅｒａｔｉｎａｓｅｏｆａｆｅａｔｈｅｒ⁃ｄｅｇｒａｄ⁃ｉｎｇＢａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓＰＷＤ⁃１［Ｊ］．Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｉｏ⁃ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｎｄＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９５，５９（１２）：２２３９－２２４３．［７］㊀ＥＬ⁃ＲＥＦＡＩＨＡ，ＡＢＤＥＬＮＡＢＹＭＡ，ＧＡＢＡＬＬＡＡ，ｅｔａｌ．ＩｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｏｆｔｈｅｎｅｗｌｙｉｓｏｌａｔｅｄＢａｃｉｌｌｕｓｐｕｍｉ⁃ｌｕｓＦＨ９ｋｅｒａｔｉｎｏｌｙｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｙ［Ｊ］．ＰｒｏｃｅｓｓＢｉｏｃｈｅｍｉｓ⁃ｔｒｙ，２００５，４０（７）：２３２５－２３３２．［８］㊀ＭＡＣＥＤＯＡＪ，ＢＥＹＳＤＡＳＩＬＶＡＷＯ，ＴＥＲＭＩ⁃ＧＮＯＮＩＣ．Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆａｎｏｎｃｏｌｌａｇｅｎ⁃ｄｅｇｒａｄｉｎｇＢａ⁃ｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓｋｅｒａｔｉｎａｓｅ［Ｊ］．ＣａｎａｄｉａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｉ⁃ｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００８，５４（３）：１８０－１８８．［９］㊀ＳＵＨＨＪ，ＬＥＥＨＫ．ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｋｅｒａｔｉｎｏｌｙｔｉｃｓｅｒｉｎｅｐｒｏｔｅａｓｅｆｒｏｍＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＫＳ⁃１［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｒｏｔｅｉｎＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００１，２０（２）：１６５－１６９．［１０］㊀ＡＳＡＨＩＭ，ＬＩＮＤＱＵＩＳＴＲ，ＦＵＫＵＹＡＭＡＫ，ｅｔａｌ．ＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｍａｊｏｒｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓｆｒｏｍＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎｒｕｂｒｕｍ［Ｊ］．ＴｈｅＢｉｏ⁃ｃｈｅｍｉｃａｌＪｏｕｒｎａｌ，１９８５，２３２（１）：１３９－１４４．［１１］㊀ＦＡＲＡＧＡＭ，ＨＡＳＳＡＮＭＡ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒ⁃ｉｚａｔｉｏｎａｎｄｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｆａｋｅｒａｔｉｎａｓｅｆｒｏｍＡｓｐｅｒ⁃ｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ［Ｊ］．ＥｎｚｙｍｅａｎｄＭｉｃｒｏｂｉａｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００４，３４（２）：８５－９３．［１２］㊀ＡＮＢＵＰ，ＧＯＰＩＮＡＴＨＳＣＢ，ＨＩＬＤＡＡ，ｅｔａｌ．Ｐｕｒｉｆｉ⁃ｃａｔｉｏｎｏｆｋｅｒａｔｉｎａｓｅｆｒｏｍｐｏｕｌｔｒｙｆａｒｍｉｓｏｌａｔｅ⁃Ｓｃｏｐｕ⁃ｌａｒｉｏｐｓｉｓｂｒｅｖｉｃａｕｌｉｓａｎｄｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｅｎ⁃ｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙ［Ｊ］．ＥｎｚｙｍｅａｎｄＭｉｃｒｏｂｉａｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００５，３６（５／６）：６３９－６４７．［１３］㊀ＧＵＳＨＴＥＲＯＶＡＡ，ＶＡＳＩＬＥＶＡ⁃ＴＯＮＫＯＶＡＥ，ＤＩ⁃ＭＯＶＡＥ，ｅｔａｌ．Ｋｅｒａｔｉｎａｓｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｂｙｎｅｗｌｙｉｓｏｌａ⁃ｔｅｄＡｎｔａｒｃｔｉｃａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓｔｒａｉｎｓ［Ｊ］．ＷｏｒｌｄＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００５，２１（６／７）：８３１－８３４．［１４］㊀ＢＲＡＮＤＥＬＬＩＡ，ＤＡＲＯＩＴＤＪ，ＲＩＦＦＥＬＡ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉ⁃ｃａｌｆｅａｔｕｒｅｓｏｆｍｉｃｒｏｂｉａｌｋｅｒａｔｉｎａｓｅｓａｎｄｔｈｅｉｒｐｒｏｄｕｃ⁃ｔｉｏｎａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ［Ｊ］．ＡｐｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１０，８５（６）：１７３５－１７５０．［１５］㊀王德山．地衣芽孢杆菌ＣＰ⁃１６降解羽毛角蛋白相关蛋白酶的分离㊁表达和相互关系［Ｄ］．硕士学位论文．北京：中国农业科学院，２０１４．㊀㊀㊀ＷＡＮＧＤＳ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｏｆｆｅａｔｈｅｒｋｅｒａｔｉｎｄｅｇｒａｄｉｎｇｐｒｏｔｅａｓｅｆｒｏｍＢａｃｉｌｌｕｓｌｉ⁃ｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓＣＰ⁃１６［Ｄ］．Ｍａｓｔｅｒ ｓＴｈｅｓｉｓ．Ｂｅｉｊｉｎｇ：Ｃｈｉ⁃ｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，２０１４．（ｉｎＣｈｉ⁃ｎｅｓｅ）［１６］㊀廖朝勇．地衣芽孢杆菌ＣＰ⁃１６降解羽毛关键酶高效表达研究［Ｄ］．硕士学位论文．北京：中国农业科学院，２０１９．㊀㊀㊀ＬＩＡＯＣＹ．Ｓｔｕｄｙｏｎｔｈｅｈｉｇｈ⁃ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｋｅｙｅｎｚｙｍｅｓｉｎｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｏｆｆｅａｔｈｅｒｂｙＢａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒ⁃ｍｉｓＣＰ⁃１６［Ｄ］．Ｍａｓｔｅｒ ｓＴｈｅｓｉｓ．Ｂｅｉｊｉｎｇ：ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅ⁃ｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，２０１９．（ｉｎＣｈｉｎｅｓｅ）２９８５１０期傅㊀岩等：通过定向进化技术提高角蛋白酶的热稳定性研究［１７］㊀ＳＲＩＶＡＳＴＡＶＡＢ，ＫＨＡＴＲＩＭ，ＳＩＮＧＨＧ，ｅｔａｌ．Ｍｉ⁃ｃｒｏｂｉａｌｋｅｒａｔｉｎａｓｅｓ：ａｎｏｖｅｒｖｉｅｗｏｆｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｃｈａｒ⁃ａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎａｎｄｉｔｓｅｃｏ⁃ｆｒｉｅｎｄｌｙａｐｐｒｏａｃｈｆｏｒｉｎｄｕｓｔｒｉａｌａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｌｅａｎｅｒＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，２０２０，２５２：１１９８４７．［１８］㊀ＮＮＯＬＩＭＮ，ＵＤＥＮＩＧＷＥＣ，ＯＫＯＨＡ，ｅｔａｌ．Ｍｉｃｒｏ⁃ｂｉａｌｋｅｒａｔｉｎａｓｅ：ｎｅｘｔｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｇｒｅｅｎｃａｔａｌｙｓｔａｎｄｐｒｏ⁃ｓｐｅｃｔｉｖｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ［Ｊ］．ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０２０．ＤＯＩ：１０．３３８９／ｆｍｉｃｂ．２０２０．５８０１６４．［１９］㊀ＥＡＫＳＵＲＥＥＷ，ＰＲＡＣＨＡＹＡＫＩＴＴＩＡ，ＵＰ⁃ＡＴＨＡＮＰＲＥＥＣＨＡＴ，ｅｔａｌ．Ｉｎｖｉｔｒｏａｎｄｉｎｖｉｖｏｅｖａｌｕ⁃ａｔｉｏｎｏｆｐｒｏｔｅｉｎｑｕａｌｉｔｙｏｆｅｎｚｙｍａｔｉｃｔｒｅａｔｅｄｆｅａｔｈｅｒｍｅａｌｓ［Ｊ］．ＳｐｒｉｎｇｅｒＰｌｕｓ，２０１６，５（１）：９７１．［２０］㊀谭权，赵剑，陶青燕，等．外源性蛋白酶在饲料工业中的应用［Ｊ］．中国畜牧杂志，２０２０，５６（５）：３２－３５．㊀㊀㊀ＴＡＮＱ，ＺＨＡＯＪ，ＴＡＯＱＹ，ｅｔａｌ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｅｘ⁃ｏｇｅｎｏｕｓｐｒｏｔｅａｓｅｉｎｆｅｅｄｉｎｄｕｓｔｒｙ［Ｊ］．ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅ，２０２０，５６（５）：３２－３５．（ｉｎＣｈｉｎｅｓｅ）［２１］㊀方真．Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ角蛋白酶的分子改造［Ｄ］．博士学位论文．无锡：江南大学，２０１７．㊀㊀㊀ＦＡＮＧＺ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＳｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａｋｅｒａｔｉｎａｓｅ［Ｄ］．Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ．Ｗｕｘｉ：Ｊｉａｎｇ⁃ｎａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２０１７．（ｉｎＣｈｉｎｅｓｅ）［２２］㊀ＧＯＮＧＪＳ，ＷＡＮＧＹ，ＺＨＡＮＧＤＤ，ｅｔａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉ⁃ｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｎｅｘｔｒｅｍｅａｌｋａｌｉｎｅａｎｄｓｕｒｆａｃ⁃ｔａｎｔ⁃ｓｔａｂｌｅｋｅｒａｔｉｎａｓｅｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍａｎｅｗｌｙｉｓｏｌａｔｅｄａｃ⁃ｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓＫ１３［Ｊ］．ＲＳＣＡｄｖａｎｃｅｓ，２０１５，５（３１），２４６９１－２４６９９．［２３］㊀王海燕．脱毛蛋白酶产生菌的选育及其碱性蛋白酶基因的克隆与表达［Ｄ］．博士学位论文．成都：四川大学，２００６．㊀㊀㊀ＷＡＮＧＨＹ．Ｂｒｅｅｄｉｎｇｏｆｕｎｈａｉｒｉｎｇｐｒｏｔｅａｓｅｐｒｏｄｕｃｉｎｇｓｔｒａｉｎａｎｄｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆａｌｋａｌｉｎｅｐｒｏｔｅａｓｅｇｅｎｅ［Ｄ］．Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ．Ｃｈｅｎｇｄｕ：ＳｉｃｈｕａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２００６．（ｉｎＣｈｉｎｅｓｅ）［２４］㊀ＺＨＡＮＧＸＺ，ＺＨＡＮＧＹＨＰ．Ｓｉｍｐｌｅ，ｆａｓｔａｎｄｈｉｇｈ⁃ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｆｏｒｄｉｒｅｃｔｅｄｅｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆｃｅｌｌｕｌａｓｅｉｎＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ［Ｊ］．ＭｉｃｒｏｂｉａｌＢｉｏｔｅｃｈ⁃ｎｏｌｏｇｙ，２０１１，４（１）：９８－１０５．［２５］㊀刘柏宏．Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ角蛋白酶的高效表达㊁热稳定性及底物特异性改造［Ｄ］．博士学位论文．无锡：江南大学，２０１５．㊀㊀㊀ＬＩＵＢＨ．Ｈｉｇｈｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｔｈｅｒｍａｌｓｔａｂｉｌｉｔｙａｎｄｓｕｂ⁃ｓｔｒａｔｅｓｐｅｃｉｆｉｃｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＢａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓｋｅｒａｔｉｎａｓｅ［Ｄ］．Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ．Ｗｕｘｉ：ＪｉａｎｇｎａｎＵｎｉｖｅｒｓｉ⁃ｔｙ，２０１５．（ｉｎＣｈｉｎｅｓｅ）［２６］㊀ＶＲＩＥＮＤＧ，ＥＩＪＳＩＮＫＶ．Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎａｎｄａｎａｌｙｓｉｓｏｆｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｓｔａｂｉｌｉｔｙａｎｄｕｎｆｏｌｄｉｎｇｏｆｔｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎ⁃ｌｉｋｅｐｒｏｔｅａｓｅｓ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｏｍｐｕｔｅｒ⁃ＡｉｄｅｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｓｉｇｎ，１９９３，７（４）：３６７－３９６．［２７］㊀ＮＯＰＰＥＮＢ，ＦＯＮＴＥＹＮＬ，ＡＥＲＴＳＦ，ｅｔａｌ．Ａｕｔｏｌｙｔｉｃｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｏｆｏｃｒｉｐｌａｓｍｉｎ：ａｃｏｍｐｌｅｘｍｅｃｈａｎｉｓｍｕｎ⁃ｒａｖｅｌｅｄｂｙｍｕｔａｔｉｏｎａｌａｎａｌｙｓｉｓ［Ｊ］．ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒ⁃ｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２０１４，２７（７）：２１５－２２３．［２８］㊀王镜岩，朱圣庚，徐长法．生物化学：上册［Ｍ］．３版．北京：高等教育出版社，２００２．㊀㊀㊀ＷＡＮＧＪＹ，ＺＨＵＳＧ，ＸＵＣＦ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：ｖｏｌ⁃ｕｍｅⅠ［Ｍ］．３ｒｄｅｄ．Ｂｅｉｊｉｎｇ：ＨｉｇｈｅｒＥｄｕｃａｔｉｏｎＰｒｅｓｓ，２００２．（ｉｎＣｈｉｎｅｓｅ）［２９］㊀ＣＨＡＮＭＫ，ＭＵＫＵＮＤＳ，ＫＬＥＴＺＩＮＡ，ｅｔａｌ．Ｓｔｒｕｃ⁃ｔｕｒｅｏｆａｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃｔｕｎｇｓｔｏｐｔｅｒｉｎｅｎｚｙｍｅ，ａｌ⁃ｄｅｈｙｄｅｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９５，２６７（５２０３）：１４６３－１４６９．［３０］㊀王珏，胡丽丽，张育敏，等．基于前导肽和成熟区共进化提高米黑霉脂肪酶热稳定性研究［Ｊ］．生物学杂志，２０２１，３８（１）：４１－４５．㊀㊀㊀ＷＡＮＧＪ，ＨＵＬＬ，ＺＨＡＮＧＹＭ，ｅｔａｌ．ＥｎｈａｎｃｉｎｇｔｈｅｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｔｙｏｆＲｈｉｚｏｍｕｃｏｒｍｉｅｈｅｉｌｉｐａｓｅｔｈｒｏｕｇｈｃｏｅｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆｔｈｅｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅａｎｄｔｈｅｍａｔｕｒｅｒｅｇｉｏｎ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｙ，２０２１，３８（１）：４１－４５．（ｉｎＣｈｉ⁃ｎｅｓｅ）［３１］㊀ＴＩＮＡＫＧ，ＢＨＡＤＲＡＲ，ＳＲＩＮＩＶＡＳＡＮＮ．ＰＩＣ：ｐｒｏ⁃ｔｅｉｎｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓｃａｌｃｕｌａｔｏｒ［Ｊ］．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅ⁃ｓｅａｒｃｈ，２００７，３５（ＷｅｂＳｅｒｖｅｒＩｓｓｕｅ）：Ｗ４７３－Ｗ４７６．［３２］㊀ＧＲＡＺＩＡＮＯＧ，ＭＥＲＬＩＮＯＡ，ｅｔａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｂａｓｅｓｏｆｐｒｏｔｅｉｎｈａｌｏｔｏｌｅｒａｎｃｅ［Ｊ］．ＢｉｏｃｈｉｍｉｃａｅｔＢｉｏｐｈｙｓｉｃａＡｃｔａ，２０１４，１８４４（４）：８５０－８５８．［３３］㊀ＣＨＡＫＲＡＶＡＲＴＹＳ，ＶＡＲＡＤＡＲＡＪＡＮＲ．Ｅｌｕｃｉｄａ⁃ｔｉｏｎｏｆｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙｔｈｒｏｕｇｈｇｅ⁃ｎｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓ［Ｊ］．ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ，２０００，４７０（１）：６５－６９．［３４］㊀ＬＩＵＹ，ＸＩＥＷＰ，ＹＵＨＷ．ＥｎｈａｎｃｅｄａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＲｈｉ⁃ｚｏｍｕｃｏｒｍｉｅｈｅｉｌｉｐａｓｅｂｙｄｅｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎｏｆｉｔｓｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅｉｎＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ［Ｊ］．ＣｕｒｒｅｎｔＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏ⁃ｇｙ，２０１４，６８（２）：１８６－１９１．３９８５㊀动㊀物㊀营㊀养㊀学㊀报３３卷∗Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ，ａｓｓｏｃｉａｔｅｐｒｏｆｅｓｓｏｒ，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｚｈｔｙ９９９＠１６３．ｃｏｍ（责任编辑㊀武海龙）ＥｎｈａｎｃｉｎｇＴｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｔｙｏｆＫｅｒａｔｉｎａｓｅｂｙＤｉｒｅｃｔｅｄＥｖｏｌｕｔｉｏｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＦＵＹａｎ１㊀ＺＨＡＮＧＴｉｅｙｉｎｇ１∗㊀ＳＵＮＹｉｎｇｘｉａ１㊀ＬＩＳｏｎｇｙｕ２（１．ＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＡｎｉｍａｌＮｕｔｒｉｔｉｏｎ，ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１００１９３，Ｃｈｉｎａ；２．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅ，ＳｈａｎｘｉＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔａｉｙｕａｎ０３０８０１，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｉｓｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｗａｓａｉｍｅｄｔｏｉｍｐｒｏｖｅｔｈｅｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｔｙｏｆｋｅｒａｔｉｎａｓｅ，ａｎｄｔｏｅｘｐａｎｄｔｈｅａｐｐｌｉｃａ⁃ｂｉｌｉｔｙｏｆｋｅｒａｔｉｎａｓｅｉｎｔｈｅｆｅｅｄｉｎｄｕｓｔｒｙ．Ｔｈｅｅｒｒｏｒ⁃ｐｒｏｎｅＰＣＲｍｅｔｈｏｄｗａｓｕｓｅｄｔｏｃａｒｒｙｏｕｔｄｉｒｅｃｔｅｄｅｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆｔｈｅｋｅｒａｔｉｎａｓｅｏｆＢａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓＣＰ⁃１６，ｔｈｅｍｕｔａｎｔｓｗｉｔｈｇｏｏｄｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｔｏｌｅｒａｎｃｅｗｅｒｅｓｃｒｅｅｎｅｄ，ａｎｄｔｈｅｅｎｚｙｍａｔｉｃｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓａｎｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｗｅｒｅｐｅｒｆｏｒｍｅｄ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｒｅｅｐｏｓｉｔｉｖｅｋｅｒａｔｉｎａｓｅｍｕｔａｎｔｓＡ３０７Ｖ／Ｓ３４６Ｔ，Ｒ７０ＧａｎｄＮ２４５Ｋｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄｆｒｏｍ５０００ｍｕｔａｎｔｓ，ａｎｄｔｈｅｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｔｙｏｆｋｅｒａｔｉｎａｓｅｗａｓｉｍｐｒｏｖｅｄ．Ｔｈｅｓｔｕｄｙｏｆｔｈｅｅｎｚｙｍａｔｉｃｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｆｏｕｎｄｔｈａｔｔｈｅｋｅｒａｔｉｎａｓｅｍｕ⁃ｔａｎｔＲ７０Ｇｈａｄｔｈｅｓｔｒｏｎｇｅｓｔｔｈｅｒｍａｌｓｔａｂｉｌｉｔｙ，ａｎｄｒｅｔａｉｎｅｄ３０．６５％ｏｆｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｙａｆｔｅｒｈｅａｔｔｒｅａｔｍｅｎｔａｔ７５ħｆｏｒ５ｍｉｎ，ｗｈｉｌｅｔｈｅｗｉｌｄ⁃ｔｙｐｅｋｅｒａｔｉｎａｓｅｏｎｌｙｈａｄ１．０６％ｏｆｔｈｅｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙａｆｔｅｒｈｅａｔｔｒｅａｔｍｅｎｔａｔ７５ħｆｏｒ５ｍｉｎ．Ｔｈｉｓｓｔｕｄｙｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｏｂｔａｉｎｅｄｔｈｅｋｅｒａｔｉｎａｓｅｍｕｔａｎｔｓｗｉｔｈｇｏｏｄｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｔｙ，ｅｘｐａｎｄｔｈｅａｐｐｌｉ⁃ｃａｂｉｌｉｔｙｏｆｋｅｒａｔｉｎａｓｅ，ａｎｄｐｒｏｖｉｄｅａｒｅｆｅｒｅｎｃｅｆｏｒｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｈｅａｔ⁃ｒｅｓｉｓｔａｎｔｋｅｒａｔｉｎａｓｅａｎｄｔｈｅｅｘｐｌｏｒａ⁃ｔｉｏｎｏｆｒｅｌａｔｅｄｎｅｗｇｅｎｅｔｉｃｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ．［ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｉｍａｌＮｕｔｒｉｔｉｏｎ，２０２１，３３（１０）：５８８７⁃５８９４］Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｋｅｒａｔｉｎａｓｅ；ｄｉｒｅｃｔｅｄｅｖｏｌｕｔｉｏｎ；ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｔｙ４９８５。