―甘露聚糖酶简称β-甘露聚糖酶

甘露聚糖酶活力的测定1.甘露聚糖酶活力单位定义在37℃、pH值为5.5的条件下，每分钟从浓度为3mg/ml的甘露聚糖（Sigma G0753）溶液中降解释放1umol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位u。

2.测定原理甘露聚糖酶能将甘露聚糖降解成寡糖和单糖。

具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色反应。

反应液颜色的强度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中甘露聚糖酶的活力成正比。

因此，通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算反应液中甘露聚糖酶的活力。

3.试剂与溶液除特殊说明外，所用的试剂均为分析纯，水均为符合GB/T6682中规定的三级水。

3.1甘露糖溶液，c（C6H12O6）为10.0mg/ml：称取无水D-甘露糖1.000g，加水溶解，定容至100ml。

3.2乙酸溶液，c（CH3COOH）为0.1mol/L：吸取冰乙酸0.60ml。

加水溶解，定容至100ml。

3.3 乙酸钠溶液，c（CH3COONa）为0.1mol/L：称取三水乙酸钠1.36g。

加水溶解，定容至100ml。

3.4 氢氧化钠溶液，c（NaOH）为200g/L：称取氫氧化鈉20.0g。

加水溶解，定容至100ml。

3.5乙酸——乙酸钠缓冲溶液，c（CH3COOH—CH3COONa）为0.1mol/L，pH值为5.5：称取三水乙酸钠23.14g，加入冰乙酸1.70ml。

再加水溶解，定容至2000ml。

测定溶液的pH值。

如果pH值偏离5.5，再用乙酸溶液（3.2）或乙酸钠溶液（3.3）调节至5.5。

3.6甘露聚糖溶液：0.6%（w/v）称取甘露聚糖（Sigma G0753）0.60g，加入80ml乙酸—乙酸钠缓冲溶液（3.5）。

磁力搅拌，同时缓慢加热，直至甘露聚糖完全溶解（注：在搅拌加热的过程中可以补加适量的缓冲液，但是溶液的总体积不能超过100ml。

）。

然后停止加热，继续搅拌30min，用乙酸—乙酸钠缓冲溶液（3.5）定容至100ml。

收稿日期:２０１９￣１１￣１４基金项目:国家自然科学基金(３１７６０４４９)资助项目.通信作者:王筱兰(１９６５￣)ꎬ女ꎬ江西景德镇人ꎬ教授ꎬ博士ꎬ主要从事食品生物化学及微生物发酵研究.Ｅ￣ｍａｉｌ:ｘｌｗａｎｇ０８＠ａｌｉｙｕｎ.ｃｏｍ文章编号:１０００￣５８６２(２０２０)０２￣０１９６￣０６豆豉中β￣甘露聚糖酶高产菌的分离㊁鉴定及其酶学性质赵文鹏ꎬ李㊀浩ꎬ王筱兰∗(江西师范大学生命科学学院ꎬ江西省亚热带植物资源保护与利用重点实验室ꎬ江西南昌㊀３３００２２)摘要:通过对传统曲霉型豆豉菌群分离纯化ꎬ结合刚果红显色及ＤＮＳ筛选法ꎬ共得到高产β￣甘露聚糖酶且形态学差异较大的细菌４株㊁真菌１株ꎬ其中真菌的酶活力为２０１６Ｕ ｍＬ－１.经过序列鉴定与比对ꎬ细菌鉴定为芽孢杆菌属(Ｂａｃｉｌｌｕｓ)不同种ꎬ真菌为黑曲霉(Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ).酶学性质研究表明:黑曲霉的最适温度和ｐＨ值分别为６０ħ和５.０ꎻ４株芽孢杆菌最适作用温度和ｐＨ值范围为４０~５５ħ和６.０~７.０ꎬ其中１株芽孢杆菌在６５ħ时保温２４０ｍｉｎ或在ｐＨ值为９.０时保留３０ｍｉｎꎬ残留相对酶活仍可达６１.４％或８４.３％.关键词:β￣甘露聚糖酶ꎻ豆豉ꎻ分离筛选ꎻ酶学性质中图分类号:ＴＳ２０１㊀㊀文献标志码:Ａ㊀㊀ＤＯＩ:１０.１６３５７/ｊ.ｃｎｋｉ.ｉｓｓｎ１０００￣５８６２.２０２０.０２.１５０㊀引言豆豉是一种以大豆为主要原料ꎬ经过发酵而制成的传统调味副食品.依据制曲微生物的不同ꎬ豆豉主要可分为曲霉型㊁毛霉型㊁细菌型等类别ꎬ各类豆豉外在呈现为不同的营养风味[１]ꎬ其中一个重要原因是各类豆豉微生物分泌酶系的差异.而豆豉发酵微生物产酶往往以蛋白酶㊁淀粉酶㊁脂肪酶等主酶系为主ꎬ过去许多研究也针对豆豉产主酶系的微生物进行了报道[２￣３].近年来ꎬ一些研究者利用高通量测序技术等研究了豆豉发酵中的微生物区系[４￣５]ꎬ发现豆豉微生物种类往往比预期复杂得多ꎬ这就意味着豆豉发酵中的一些功能酶没有得到充分挖掘.甘露聚糖是半纤维素主要成分之一ꎬ在自然中蕴含丰富.显然ꎬ若能借助β￣甘露聚糖酶使其得到充分开发ꎬ将带来巨大的社会和经济效益.就β￣甘露聚糖酶的来源来看ꎬ虽然植物㊁动物及微生物中都普遍存在ꎬ但微生物来源的β￣甘露聚糖酶具有提取简单㊁低成本㊁高稳定性㊁高活性等诸多优点ꎬ故备受国内外研究者的关注ꎬ而研究的重点领域包括产酶菌株的选育㊁产酶条件的优化及酶基因的克隆表达㊁改造等方面ꎬ其中筛选性能良好的产甘露聚糖酶的菌株一直是探索的重要方向[６]ꎬ如孙会忠等[７]从牡丹内生菌中筛选出１株高酶活的产酶菌株ꎬ也有研究者从碱湖中筛选出产碱性甘露聚糖酶的菌种Ｂａｃｉｌｌｕｓａｇａｒａｄｈａｅｒｅｎｓ.然而ꎬ鲜见关于从豆豉发酵菌群中筛选出产β￣甘露聚糖酶菌株的报道.本文以不同发酵期的豆豉为材料ꎬ基于分离纯化后的微生物ꎬ对其中产β￣甘露聚糖酶的菌株进行了筛选㊁鉴定ꎬ并对高产菌株的粗酶液的基本性质进行了探究ꎬ以期丰富产β￣甘露聚糖酶的微生物遗传资源ꎬ并为后续β￣甘露聚糖酶基因的克隆㊁改造奠定基础.１㊀材料与方法１.１㊀材料与设备１.１.１㊀实验材料㊀豆豉样品采自南昌稻香园调味食品有限公司ꎬ采集阶段为发酵１㊁３㊁６㊁１０ｄꎬ样品采集完毕后装入灭菌自封袋并尽快运回实验室ꎬ于４ħ条件下保存备用.１.１.２㊀实验试剂㊀生理盐水ꎬ刚果红ꎬＤＮＳ试剂ꎬ柠檬酸缓冲液ꎬＮａ２ＨＰＯ４ꎬＮａＨ２ＰＯ４ꎬＫ２ＨＰＯ４.１.１.３㊀培养基㊀筛选平板培养基(ｇ Ｌ－１):魔芋胶５.００ꎬＮＨ４Ｃｌ５.００ꎬＫＨ２ＰＯ４１.００ꎬＭｇＳＯ４０.１０ꎬ琼第４４卷第２期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀江西师范大学学报(自然科学版)㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀Ｖｏｌ.４４Ｎｏ.２㊀２０２０年３月㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀ＪｏｕｒｎａｌｏｆＪｉａｎｇｘｉＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ(ＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅ)㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀Ｍａｒ.２０２０㊀脂２０.００ꎬｐＨ值６.０ꎻ细菌种子培养基(ｇ Ｌ－１):魔芋胶５.００ꎬ酵母抽提物５０.００ꎬ蛋白胨１０.００ꎬ氯化钠５.００ꎬ自然ｐＨ值ꎻ细菌发酵培养基(ｇ Ｌ－１):魔芋胶５.００ꎬ酵母抽提物５０.００ꎬ蛋白胨１０.００ꎬＫＨ２ＰＯ４５.００ꎬＭｇＳＯ４０.２５ꎬ自然ｐＨ值[９]ꎻ真菌种子培养基(ｇ Ｌ－１):魔芋胶５.００ꎬ酵母提取物５.００ꎬ蛋白胨１０.００ꎬ葡萄糖１０.００ꎬｐＨ值６.０ꎻ真菌发酵培养基(ｇ Ｌ－１):酵母膏１３.００ꎬ(ＮＨ４)２ＳＯ４４.００ꎬ魔芋胶５.００ꎬＦｅＳＯ４ ７Ｈ２Ｏ０.０１ꎬＣａＣｌ２０.５０ꎬＫ２ＨＰＯ４７.５４ꎬＫＨ２ＰＯ４０.２３ꎬｐＨ值６.０[１０]ꎻＢＨＩ培养基与ＰＤＡ培养基为购置的成品ꎬ灭菌后分别添加纳他霉素(０.１ｇ Ｌ－１)及氯霉素(０.０２５ｇ Ｌ－１)[１１].１.１.４㊀实验仪器㊀电子天平ꎬｐＨ计ꎬ移液器ꎬ酶标仪ꎬ电泳仪ꎬ凝胶成像仪ꎬ超净工作台ꎬ高压蒸汽灭菌锅ꎬ恒温培养箱ꎬ恒温水浴锅ꎬ恒温摇床ꎬＰＣＲ仪ꎬ高速离心机.１.２㊀方法１.２.１㊀菌株的分离纯化㊀称取４个发酵阶段的豆豉各５ｇꎬ分别加入５０ｍＬ生理盐水ꎬ摇床振荡３０ｍｉｎꎬ取适宜稀释度的菌液分别涂布在ＢＨＩ或ＰＤＡ固体培养基上ꎬ用于细菌或真菌的分离.细菌于３６ħ培养２４ｈꎬ真菌３０ħ培养７２ｈ.挑出若干单菌落再次分离划线ꎬ直至得到单菌落.１.２.２㊀菌株的初筛与复筛㊀将各阶段的细菌点接于筛选平板中ꎬ另按同一布局点接于ＢＨＩ平板中备用.培养１６ｈ后ꎬ对筛选平板进行刚果红染色及生理盐水脱色.按形态差异ꎬ每个形态各挑选出透明圈直径(Ｈ)与菌落直径(Ｃ)比值较大的４~５株ꎬ再次点接筛选平板复筛ꎬ确定同一形态中最高酶活的细菌株.由于真菌种类较少且大多数都有扩散生长㊁产色素的特性ꎬ故采用种子液的摇瓶发酵法对其筛选.１.２.３㊀产酶菌株的摇瓶发酵㊀挑取复筛后的细菌株及分离得到的真菌ꎬ分别接入不同的种子培养基.细菌于种子液中培养１２ｈ后ꎬ接入发酵培养基继续发酵１６ｈ后离心得到粗酶液.真菌于种子培养基中培养７２ｈ后离心得到上清ꎬ在按下述方法测定酶活力后ꎬ选取最高酶活的菌株转入真菌发酵培养基培养９６ｈꎬ离心后得到发酵上清液.１.２.４㊀β￣甘露聚糖酶活力的测定㊀(ｉ)甘露糖标准曲线的绘制:参照文献[１２]的方法绘制标准曲线ꎬ每组３个平行.以甘露糖浓度(ｍｇ ｍＬ－１)为横坐标ｘꎬ吸光度值为纵坐标ｙꎬ绘制标准曲线ꎻ(ｉｉ)β￣甘露聚糖酶活力测定:参照文献[１３]的方法适当修改ꎬ取粗酶液２０μＬ与８０μＬ０.５％的魔芋胶溶液(Ｎａ２ＨＰＯ４￣柠檬酸缓冲液配制ꎬｐＨ值为６.０)充分混匀并短暂离心ꎬ置于５５ħ水浴反应３０ｍｉｎ加入１００μＬＤＮＳ沸水浴１０ｍｉｎꎬ冷却后定容至１.０ｍＬ测定ＯＤ５４０ꎬ以蒸馏水代替酶液作为对照组ꎻ(ｉｉｉ)β￣甘露聚糖酶活力计算:酶活力定义为在所选取的反应条件下ꎬ以每分钟水解底物产生相当１μｍｏｌＤ￣甘露糖所需要的酶液量定义为１个酶活力单位(Ｕ ｍＬ－１)ꎬ具体计算方法参照文献[１４].１.２.５㊀高酶活菌株的鉴定㊀利用试剂盒提取复筛得到的各菌株的基因组ＤＮＡꎬ通过２７Ｆ/１４９２Ｒ及ＩＴＳ１/ＩＴＳ４２对引物分别对细菌㊁真菌的基因保守片段进行ＰＣＲ扩增ꎬ具体条件参照文献[１５]ꎬ扩增完毕使用１％的琼脂糖凝胶电泳检查ＰＣＲ产物质量后ꎬ送至上海生工测序.同源性序列比对分析用ＮＣＢＩ中的ＢＬＡＳＴ软件进行分析ꎬ采用ＭＥＧＡ软件对各菌株进行系统发育分析ꎬ系统发育树的构建采用Ｎｅｉｇｈｂｏｒ￣ｊｏｉｎｉｎｇ法.１.２.６㊀酶学性质研究㊀(ｉ)最适反应温度:分别在２５㊁３５㊁４５㊁５５㊁６５㊁７５ħ下按照标准方法测定粗酶液的酶活ꎬ以酶活力最高者为１００％ꎻ(ｉｉ)酶的温度稳定性:将酶液分别在３５㊁４５㊁５５㊁６５ħ温度下保温不同时长ꎬ按标准方法测定残余酶活ꎻ(ｉｉｉ)最适反应ｐＨ值:用０.１ｍｏｌ Ｌ－１柠檬酸￣柠檬酸钠缓冲液及１/１５ｍｏｌ Ｌ－１Ｋ２ＨＰＯ４￣ＮａＨ２ＰＯ４分别配制不同ｐＨ值的底物溶液ꎬ按标准方法测定酶活.以酶活力最高者为１００％ꎻ(ｉｖ)酶的ｐＨ值稳定性:将酶液分别于不同ｐＨ值的缓冲溶液(同(ｉｉｉ))中于３０ħ放置１ｈꎬ按标准方法测定残余酶活ꎬ以初始酶活为１００％.每组３个平行ꎬ取平均值计算相对酶活力.２㊀结果与分析２.１㊀菌株的分离纯化稀释涂布后ꎬ４个发酵阶段(编号分别为Ａ㊁Ｂ㊁Ｃ㊁Ｄ)菌群总数存在较大差异ꎬ其中发酵前期较高(约１０７ｃｆｕ ｍＬ－１).各阶段菌落形态种类大致相当ꎬ其中以芽孢菌属典型特征(表面粗糙㊁不透明㊁褶皱㊁乳白或褐色)的菌落为大多数ꎬ而真菌则主要包括曲霉状真菌㊁部分毛霉状真菌及少量酵母菌.２.２㊀产酶细菌株的初筛、复筛每个发酵阶段各选择分离单菌株(４０株)进行点板初筛(见图１(ａ)和图１(ｂ)).初筛中选择每个形态ＨＣ(Ｈ/Ｃ)值的前４~５株ꎬ共１８株进入复筛(见图１(ｃ)).复筛中最终确定每个形态ＨＣ值最高７９１第２期赵文鹏ꎬ等:豆豉中β￣甘露聚糖酶高产菌的分离鉴定及其酶学性质的细菌株ꎬ各形态ＨＣ值的最高株分别为Ａ￣８㊁Ｂ￣３㊁Ｂ￣６㊁Ｃ￣３(见表１)ꎬ其中Ｂ￣３的ＨＣ值为６.８４ꎬ故选择这４株细菌进行后续研究.表１㊀产较大水解圈的细菌ＨＣ值比较㊀编号ＨＣ值㊀编号ＨＣ值㊀编号ＨＣ值㊀编号ＨＣ值㊀Ａ￣４３.７３㊀Ｂ￣３６.８４㊀Ｃ￣３３.５９㊀Ｄ￣５２.８９㊀Ａ￣８４.８２㊀Ｂ￣６４.１６㊀Ｃ￣１９３.９３㊀Ｄ￣１４３.６５㊀Ａ￣１４５.９４㊀Ｂ￣２１４.７５㊀Ｃ￣２６５.１８㊀Ｄ￣２２５.８１㊀Ａ￣１７３.２５㊀Ｂ￣２８３.０６㊀Ｃ￣３１４.５７㊀Ｄ￣３７６.４０㊀Ｂ￣３３６.４１㊀Ｃ￣３６５.３７㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀(ａ)ＢＨＩ平板㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀(ｂ)刚果红平板初筛㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀(ｃ)刚果红平板复筛图１㊀产酶细菌株初筛及复筛２.３㊀摇瓶发酵与β￣甘露聚糖酶活力的测定实验结果表明ꎬ甘露糖含量与吸光度ＯＤ５４０值标准曲线方程为ｙ＝１.００１６ｘ－０.００９８ꎬ且相关性(Ｒ２＝０.９９９５)良好(见图２)ꎬ满足后续酶活力测定的要求.图２㊀甘露糖标准曲线㊀㊀将各真菌接入种子液发酵后ꎬ结合标准曲线ꎬ通过ＤＮＳ法筛选出１株最高酶活的真菌Ｆｕ￣２ꎬ该株真菌及４株细菌形态如图３所示.通过对４株细菌及该株真菌酶活进行测定发现:就细菌来看ꎬＢ￣３酶活最高(１８４５Ｕ ｍＬ－１)ꎬ与筛选平板结果基本一致ꎬ而从整体来看ꎬ真菌的发酵液酶活更高ꎬ达到２０１６Ｕ ｍＬ－１(见图４).２.４㊀高产酶菌株的分子鉴定ＰＣＲ扩增结果表明:４株细菌１６Ｓ保守区域的ＰＣＲ产物均为明亮单一条带ꎬ约为１５００ｂｐꎬ真菌的ＩＴＳ扩增产物大小约为６００ｂｐ(见图５).基于序列与ＧｅｎＢａｎｋ中相关细菌菌株的对应序列比较的结果ꎬ建立系统发育树(见图６).分析表明:４株细菌均属于Ｂａｃｉｌｌｕｓ属ꎬ但分属于不同种.其中Ａ￣８菌株与Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｅｑｕｉｌｅｎｓｉｓ相似程度最高ꎬＢ￣３㊁Ｂ￣６㊁Ｃ￣３则分别与Ｂａｃｉｌｌｕｓ.Ｖｅｌｅｚｅｎｓｉｓ㊁Ｂａｃｉｌｌｕｓ.ｓｕｂｔｉｌｉｓ和Ｂ.ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ同源性最高.另外ꎬ根据ＢＬＡＳＴ在线分析结果ꎬ最高酶活的真菌鉴定为黑曲霉(Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ).图３㊀５株高产酶菌株的基本形态特征８９１江西师范大学学报(自然科学版)２０２０年图４㊀高产菌株酶活力的比较图５㊀ＰＣＲ产物电泳图图６㊀细菌株的１６ＳｒＤＮＡ系统进化树２.５㊀酶学性质研究通过对比不同温度下相对酶活力发现:不同来源酶的最适宜反应温度为４０~６０ħ(见图７(ａ))ꎬ且均呈先升后降趋势ꎬ其中黑曲霉的相对酶活力在６０ħ时达到最高.就各不同ｐＨ值下各菌株酶活力的表现来看ꎬ细菌来源的相对酶活力最适ｐＨ值为６.０~７.０ꎬ且在ｐＨ值为４.０~８.０时大致仍保留８０％以上的酶活力(见图７(ｂ))ꎻ黑曲霉的最适ｐＨ值则约为５.０ꎬ且在碱性条件下相对酶活下降明显.而就酶的稳定性来看ꎬ不同细菌间差异化明显.其中菌株Ｂ￣６的温度与ｐＨ值稳定性均为最佳ꎬ其在６５ħ时保温２４０ｍｉｎ及在ｐＨ值９.０时保留３０ｍｉｎꎬ残留的相对酶活仍分别达６１.４％与８４.３％.而Ａ￣８㊁Ｂ￣３来源的酶的温度与ｐＨ值稳定性均较弱ꎬ酶活在６５ħ及ｐＨ值３.０时尤其下降明显(见图８(ａ)和图８(ｂ)).另外ꎬ就黑曲霉而言ꎬ其温度与ｐＨ值稳定性则整体表现一般.㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀(ａ)最适反应温度㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀(ｂ)最适反应ｐＨ值图７㊀温度及ｐＨ值对菌株甘露聚糖酶活力的影响９９１第２期赵文鹏ꎬ等:豆豉中β￣甘露聚糖酶高产菌的分离鉴定及其酶学性质㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀(ａ)温度稳定性㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀(ｂ)ｐＨ值稳定性图８㊀温度及ｐＨ值对各菌株甘露聚糖酶稳定性的影响３㊀讨论由于β￣甘露聚糖酶在诸多工业领域中扮演重要角色ꎬ因此很多研究者对其从不同角度展开了大量研究ꎬ特别是产酶菌株的筛选与改良方向.本文通过从豆豉发酵环境中进行产酶菌株的筛选ꎬ最终获得了５株高产β￣甘露聚糖酶菌株并进行了分子鉴定ꎬ同时对不同菌源的粗酶液的基本性质进行了比较.由于土壤㊁海洋及湖泊等环境中菌种资源丰富ꎬ过去很多研究者倾向于从该类生镜中筛选高酶活的菌株ꎬ如李云程等[１６]对海洋中细菌㊁真菌及放线菌产β￣甘露聚糖酶进行了筛选ꎬ得到１株酶活较高的芽孢杆菌.黄俊丽等[１７]从土壤中筛出１株酶活为５０.３６Ｕ ｍＬ－１的假单胞菌ꎬ周芳等[１４]则从土壤中筛选出酶活为１４８７Ｕ ｍＬ－１的芽孢杆菌.本文通过借鉴前人优化后的培养基ꎬ共得到５株高酶活的菌株ꎬ且均在１２００Ｕ ｍＬ－１以上ꎬ４株芽孢杆菌酶活力与周芳等[１４]的研究数据大致相当ꎬ而高于其他大部分报道.而就黑曲霉来看ꎬ以往大部分学者往往采用固态发酵进行产酶试验ꎬ与以往利用突变或基因工程的部分黑曲霉液体发酵相比ꎬ本研究与其仍有一定差异[１８￣１９].需要指出的是ꎬ由于酶活方法的定义及具体试验条件不同ꎬ故这也是许多研究酶活力数据存在较大差异的重要原因.另一方面ꎬ较高酶活力往往只是筛选产酶菌株的一个重要指标ꎬ良好的应用前景往往需考虑酶在不同环境中的稳定性.为此ꎬ本文针对不同产酶菌株的酶液的基本性质进行了探索.可以发现ꎬ真菌的在偏酸偏热的环境中达到最高酶活ꎬ而芽孢杆菌最高酶活更集中于温和的中性环境ꎬ这与之前的一些报道类似[１４ꎬ１７ꎬ２０].同时ꎬ部分芽孢菌株来源的酶液(如Ｂ￣６㊁Ｃ￣３)在许多温度及酸碱度区间内均能保持较高酶活力ꎬ这说明其或许更能耐受严酷环境ꎬ可能具有较好的应用开发价值.此外ꎬ本文虽筛选到了一些高产β￣甘露聚糖酶菌株ꎬ但可培养法往往只能在特定培养基中筛选出易于培养的菌株ꎬ很多难于培养菌株的β￣甘露聚糖基因资源未能得到有效挖掘ꎬ未来有必要结合宏基因组策略进行更为广泛的筛选ꎬ并针对现有的产酶菌株进一步地改造.４㊀参考文献[１]胡会萍.豆豉后酵中有益微生物及接菌发酵低盐豆豉品质㊁风味与功能性的研究[Ｄ].北京:中国农业大学ꎬ２０１２.[２]宋园亮ꎬ张忠华ꎬ熊骏ꎬ等.元阳豆豉中高产蛋白酶乳酸菌的筛选及其产酶条件的研究[Ｊ].中国微生态学杂志ꎬ２０１１ꎬ２３(１):８￣１２.[３]廖焰焰ꎬ张菊ꎬ李翔ꎬ等.传统曲霉型豆豉中高产脂肪酶的米曲霉筛选及鉴定[Ｊ].江西师范大学学报:自然科学版ꎬ２０１８ꎬ４２(５):５８￣６３.[４]石聪ꎬ李世瑞ꎬ李跑ꎬ等.基于高通量测序浏阳豆豉不同发酵阶段微生物多样性分析[Ｊ].食品与发酵工业ꎬ２０１８ꎬ４４(２):２７￣３２.[５]ＨｅＢｉｎꎬＬｉＨａｏｒａｎꎬＨｕＺｈｉｈｏｎｇꎬｅｔａｌ.Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｉｎｍｉｃｒｏ￣ｂｉａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｙａｎｄｔａｓｔｅｃｏｍｐｏｕｎｄｓｂｅｔｗｅｅｎＭｕｃｏｒ￣ｔｙｐｅａｎｄＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ￣ｔｙｐｅｄｏｕｃｈｉｄｕｒｉｎｇｋｏｊｉ￣ｍａｋｉｎｇ[Ｊ].ＦｏｏｄＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌꎬ２０１９ꎬ１２１:１３６￣１４３. 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农业部公告第2045号――关于公布修订后的《饲料添加剂品种目录(2013)》的公告文章属性•【制定机关】农业部(已撤销)•【公布日期】2013.12.30•【文号】农业部公告第2045号•【施行日期】2014.02.01•【效力等级】部门规范性文件•【时效性】已被修改•【主题分类】畜牧业正文*注：本篇法规已被：农业部公告第2134号――修订《饲料添加剂品种目录(2013)》（发布日期：2014年7月24日，实施日期：2014年7月24日）修订农业部公告（第2045号）为加强对饲料添加剂的管理，保障饲料和养殖产品质量安全，促进饲料工业持续健康发展，根据《饲料和饲料添加剂管理条例》，现公布《饲料添加剂品种目录（2013）》（以下简称《目录（2013）》），并就有关事宜公告如下。

一、《目录（2013）》是在《饲料添加剂品种目录（2008）》（以下简称《目录（2008）》）的基础上修订的，增加了部分实际生产中需要且公认安全的饲料添加剂品种（或来源）；删除了缩二脲和叶黄素；将麦芽糊精、酿酒酵母培养物、酿酒酵母提取物、酿酒酵母细胞壁4个品种移至《饲料原料目录》；对部分品种的适用范围以及部分饲料添加剂类别名称进行了修订；将20个保护期满的新产品品种正式纳入《附录一》，将《目录（2008）》发布之后获得饲料和饲料添加剂新产品证书的7个产品纳入《附录二》。

二、《目录（2013）》由《附录一》和《附录二》两部分组成。

凡生产、经营和使用的营养性饲料添加剂和一般饲料添加剂，均应属于《目录（2013）》中规定的品种。

凡《目录（2013）》外的物质拟作为饲料添加剂使用，应按照《新饲料和新饲料添加剂管理办法》的有关规定，申请并获得新产品证书。

三、饲料添加剂的生产企业需办理生产许可证和产品批准文号。

其中《附录二》中的饲料添加剂品种仅允许所列申请单位或其授权的单位生产。

四、生产源于转基因动植物、微生物的饲料添加剂，以及含有转基因产品成分的饲料添加剂，应按照《农业转基因生物安全管理条例》的有关规定进行安全评价，获得农业转基因生物安全证书后，再按照《新饲料和新饲料添加剂管理办法》的有关规定进行评审。

溶液溶菌酶混合液：2mg/mL溶菌酶、50µg/mL RNase、0.3mol/L蔗糖、25mmol/L Tris-HCI（PH8.0）、25mmol/L EDTA（PH8.0）；氨苄青霉素（Ampicillin，Amp）母液：配成50mg/ml水溶液，-20℃保存备用。

甘露糖溶液，c（C6H12O6）为10.0mg/ml：称取无水D-甘露糖1.000g，加水溶解，定容至100ml。

乙酸溶液，c（CH3COOH）为0.1mol/L：吸取冰乙酸0.60ml。

加水溶解，定容至100ml。

乙酸钠溶液，c（CH3COONa）为0.1mol/L：称取三水乙酸钠1.36g。

加水溶解，定容至100ml。

氢氧化钠溶液，c（NaOH）为200g/L：称取氢氧化钠20.0g。

加水溶解，定容至100ml。

乙酸-乙酸钠缓冲溶液，c（CH3COOH—CH3COONa）为0.1mol/L，pH值为5.5：称取三水乙酸钠23.14g，加入冰乙酸1.70ml。

再加水溶解，定容至2000ml。

测定溶液的pH值。

如果pH值偏离5.5，再用乙酸溶液或乙酸钠溶液调节至5.5。

0.5%魔芋精粉底物：称取0.5g魔芋精粉加入80ml乙酸—乙酸钠缓冲溶液。

磁力搅拌，同时缓慢加热，直至魔芋精粉完全溶解（注：在搅拌加热的过程中可以补加适量的缓冲液，但是溶液的总体积不能超过100ml。

）。

然后停止加热，继续搅拌30min，用乙酸—乙酸钠缓冲溶液定容至100ml，使用前适当摇匀。

4℃避光保存，有效期为3天。

DNS试剂：称取3,5-二硝基水杨酸3.15g，溶于500mL蒸馏水，水浴至45℃，搅拌，然后逐步加入100mL氢氧化钠溶液，同时不断搅拌，直到溶液澄清透明（加入氢氧化钠过程中温度不要超过48℃），再逐步加入酒石酸钾钠91g，苯酚2.5g，亚硫酸钠2.5g，维持45℃，同时补水300mL，不断搅拌直到完全溶解。

冷却后，定容至1000 mL。