新生大鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞的同时分离_施雨露

新生大鼠施万细胞体外培养的实验研究引言：随着科学和技术的不断发展，体外细胞培养成为生物医学研究中的一项重要工具。

体外细胞培养是指将活体细胞从生物体内取出并在培养基中进行细胞生长和繁殖的过程。

新生大鼠施万细胞是一种常用的培养细胞系，具有较高的增殖能力和稳定的生长特性，被广泛应用于生物医学研究。

本文将对新生大鼠施万细胞体外培养的实验研究进行探讨。

实验方法：1.材料准备-成熟雌性新生大鼠-新鲜的完全有效的胎盘组织-PBS缓冲液-无菌培养基-无菌生长因子2.细胞分离与培养a.将新鲜胎盘组织放入含PBS的离心管中，并用显微镊子将组织块分解成细胞悬液。

b.将悬液过筛，去除残渣和大块组织碎片。

c.使用无菌培养基将细胞悬液转移到无菌培养皿中。

d.加入适量的无菌生长因子。

e.在37℃、5%CO2培养箱中培养细胞。

3.细胞生长曲线测定a.采用显微镜观察培养皿中的细胞形态和细胞数量。

b.在培养的不同时间点，取出细胞进行细胞计数，并绘制细胞生长曲线。

4.细胞增殖能力测定a.将细胞离心收集，用PBS冲洗。

b.用胶原酶或胰酶消化细胞，制备细胞悬液。

c.在新干净的无菌培养皿中播种一定浓度的细胞悬液。

d.在37℃、5%CO2培养箱中培养细胞，观察细胞增殖情况。

结果与讨论：1.细胞形态观察在培养的早期，细胞为椭圆形，贴附在培养皿上。

随着培养时间的延长，细胞逐渐增多，并呈多角形或星形。

2.细胞数目统计经过一段时间的培养，细胞数量明显增加。

绘制的细胞生长曲线显示，细胞以指数方式增殖，呈现出快速增长的趋势。

3.细胞增殖能力测定对细胞进行连续传代培养，观察细胞的增殖情况。

结果发现，新生大鼠施万细胞经过多次传代后依然能够保持良好的增殖能力。

细胞体外培养的限制与进展：尽管细胞体外培养在生物医学研究中的应用非常广泛，但仍存在一些限制和挑战。

其中主要包括细胞外环境与体内环境的差异、细胞的无血清培养和三维培养等。

为了克服这些限制，科学家们正在不断努力开展相关研究，提高细胞体外培养的效果。

成年大鼠心肌细胞分离方法【摘要】目的: 探讨三种分离成年大鼠心肌细胞的方法。

方法: 分别应用酶消化法（0. 1 %的胰蛋白酶和0.1%胶原酶依次消化）、程序冷冻后机械分离法（4℃30min，-20℃30min，-80℃30min，-196℃冻存）、酒精和多聚甲醛固定后机械分离法分离心肌组织获取单个心肌细胞悬液。

光镜观察, 结合形态学和台盼蓝染色评价心肌细胞。

结果: 用三种方法新分离的活性心肌细胞比率约70 %～80 % 、杆状、横纹清晰。

结论: 三种方法均可以对成年大鼠心肌细胞进行良好的分离。

【关键词】大鼠; 心肌细胞; 细胞分离【ABSTRACT】 Objective: To study the methods of isolating adult rat ventricular cardiomyocytes. Methods: The method of enzyme digestion(0.1% trypsin and 0.1% collagenase by turns) or mechanical method: mechanical isolation after procedurecryoapplication(4℃30min，-20℃30min，-80℃30min，freeze and keep under-196℃) or mechanical isolation after alcohol and paraform fixation was used to isolate cardiac muscular tissues and obtain single cardiomyocyte suspension. The cardiomyocytes were morphologically observed with optical microscope and evaluated through trypan blue dying. Results: Viability of freshly isolated adult rat ventricular cardiomyocytes, which were rod shaped with clear cross striations,was 70%～80%. Conclusion: Adult ratventricular cardiomyocytes can be isolated well with the above methods.【KEY WORDS】 Rat; Cardiomyocytes; Cell Separation心肌细胞不仅保存了心肌结构和功能上的某些特点,同时去除了体内各种限制因素的影响,作为实验工具,具有简便、精确、重复性好等优点,已成为研究心肌结构、代谢、功能、病理生理及其机制的重要工具。

成年小鼠心肌成纤维细胞的分离和原代培养物品准备：6-8周成年小鼠、眼科剪、眼科镊、75%酒精、PBS缓冲液、细胞培养皿、细胞培养瓶、15ml细胞离心管、恒温水平摇床、低速水平离心机、倒置显微镜、DMEM/F12细胞培养基、胎牛血清、胶原酶II、胰蛋白酶等。

操作步骤：（1）取出2只成年小鼠心脏，并将它们置于含有冰冷的PBS的培养皿中。

（2）将心脏置于无菌细胞培养皿中，并在无菌条件下进行操作。

使用剪刀将心脏切成10块，使用解剖刀将它们缩小至1mm的尺寸。

（3）将组织小块移到盛有PBS的无菌细胞培养皿中，清洗后弃去PBS。

（4）加入2ml消化缓冲液并在37℃恒速水平摇床下消化组织5分钟。

注意：摇床速度应调整至80r，以使所有组织片流动并且不会坐在底部，但不应太强以至不能破坏细胞。

消化酶（胶原酶II: 1mg/ml，胰酶: 0.75mg/ml）（5）将混合物放置1分钟，使组织沉淀并丢弃含有碎片和血细胞的上清液。

（6）加入2ml消化缓冲液并在37℃恒速水平摇床下消化组织30分钟。

（7）将混合物放置１分钟使组织沉淀到底部，并用移液管收集上清液。

不要收集倾向于漂浮的组织碎片。

（8）将上清放入含有2ml成纤维细胞培养基的15ml细胞离心管中。

（9）800r，离心5min。

（10）将细胞重悬于3-4ml培养基中。

（11）重复步骤6-10，直到所有组织溶解（通常7-10次）。

（12）将细胞悬液平铺到细胞培养皿瓶中，并在37℃下在具有5%二氧化碳的细胞培养箱中培养２小时。

（13）２ｈ后显微镜下观察细胞汇合。

此时成纤维细胞类似于小圆点。

（14）收集并丢弃上清液。

用2.5ml温热的PBS洗涤３次，并用10ml 新鲜的成纤维细胞培养基补充。

在37℃和5%二氧化碳的细胞培养箱中培养。

大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养大鼠心肌细胞是研究心血管疾病和心脏发育机制的重要模型。

在进行心肌细胞的分离鉴定和培养之前，我们需要准备以下实验材料和试剂：酶消化液、细胞培养基、大鼠心脏。

我们需要将大鼠处死，并将心脏取出。

取出的心脏需要立即放入含有乙醇消毒的PBS缓冲液中，以去除血液和外部污染物。

然后，将心脏移入无菌培养皿中，用PBS缓冲液冲洗数次，确保心脏表面干净。

随后，用取决于细胞类型和实验目的的酶消化液，如胰酶和胶原酶混合物溶液，对心脏进行消化。

消化时间可能需要根据实验目的的不同而有所差异，通常为30-60分钟。

在消化过程中，可以用显微镜观察和记录细胞的释放情况。

消化结束后，用完整培养基将消化产物传递到细胞培养皿中。

细胞培养皿需要经过预处理，用缺血的培养基包裹，并在37摄氏度的恒温培养箱中进行预暖。

将消化产物收集到离心管中，并用完整培养基进行离心，以去除酶消化液和细胞碎片。

离心结束后，将上清液抛弃，细胞沉淀用预热的完整培养基进行重悬。

通过显微镜观察细胞的形态和数量，并计算细胞的产量和存活率。

对于心肌细胞的鉴定，我们可以使用免疫荧光染色、流式细胞术等方法。

通过使用心肌标记物，如心肌肌动蛋白、酒石酸可溶性酸酐酶等，我们可以确保分离得到的细胞是心肌细胞而不是其他细胞类型。

在培养心肌细胞时，我们可以使用培养基中添加特定生长因子和血清的方法来促进心肌细胞的增殖和存活。

在培养过程中，需要定期更换培养基，并进行细胞观察和记录。

注意细胞的形态变化，如细胞肥大和收缩、形成心肌样结构等。

大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养心肌细胞是构成心脏的主要细胞类型，其功能是维持心脏的收缩和舒张运动。

由于心肌细胞自身的特殊性质，其在病理学和药理学研究中具有重要的作用。

因此，对大鼠心肌细胞的分离鉴定和培养具有重要的研究价值。

1. 材料与方法将健康的雄性SD大鼠用5%碘酒消毒，取出心脏并用PBS清洗，然后将其切成5mm×5mm的小块。

接着，将心肌块用0.25%胰酶和0.1%胆酸溶液（pH 7.4）在37℃水浴中消化30 min，然后加入完整培养基中停止消化。

用100μm的过滤网过滤后放在离心管中，500g离心5 min，取出混悬液上清液（含心肌细胞）。

将上清液平行于低浓度FBS培养基缓慢滴加到细胞培养瓶中，放置于37℃恒温培养箱中培养。

将细胞瓶中的细胞制备成单层细胞，加入适量的鼠抗α肌动蛋白单克隆抗体进行免疫染色。

观察细胞的形态和免疫染色结果，确定大鼠心肌细胞的纯度。

同时，采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blotting等方法来检测心肌特异性基因和蛋白的表达水平。

1.3 第1代大鼠心肌细胞的培养将细胞瓶中的心肌细胞培养至80%的密度后，用0.25%胰酶溶液（pH 7.4）将细胞处理成单细胞，然后加入适量的完整培养基中，调整至适当的离心管中，进行离心操作。

沉淀细胞，再用适量的完整培养基悬浮细胞，取适量的细胞悬浮液加入到新的细胞培养瓶中，以此种方式连续传代，获得第1代大鼠心肌细胞的纯培养状态。

2. 结果通过以上方法，从大鼠心脏中成功分离出心肌细胞，得到了悬浮液。

悬浮液中的心肌细胞大小大约为10-15μm，可用影像学方法进行精细观察，获得细胞数量约为3×10^6个/ml。

通过α肌动蛋白的免疫染色和心肌特异性基因和蛋白的表达水平的检测，我们成功地鉴定出了大鼠心肌细胞的纯度，并且进一步证明了其心肌细胞的特异性。

通过培养，我们成功地获得了第1代大鼠心肌细胞的纯态，细胞生长状况良好，细胞数量增加较为显著。

新生大鼠心肌细胞培养技巧原代培养心肌细胞作为一种主要的研究模型，被广泛应用于心血管研究之中.我们实验室经过长期尝试，摸索出了一些行之有效的方法，并积累了一些经验，现总结如下：1新生大鼠鼠龄的选择新生大鼠心肌细胞在出生后3 d内具有部分的增殖能力，成年大鼠心肌细胞则为终末分化细胞，不再具有分裂增殖能力.因此，大鼠出生时间越短，其心肌细胞分离后成活率越高，越容易贴壁生长.大量观测表明，选择1~3 d龄大鼠分离其心肌细胞进行原代培养较为理想.其中尤以半日龄大鼠心肌细胞培养效果最佳.2消化酶的选择及使用新生大鼠心肌细胞的分离可采用组织块法和消化法，前者因不易获得密度均一的细胞且难控制成纤维细胞的生长而较少采用.消化法中常使用的酶有3种：胰蛋白酶、胶原酶I或Ⅱ以及透明质酸酶.透明质酸酶多与胰蛋白酶或胶原酶联合应用.胰蛋白酶作用较强，容易造成心肌细胞损坏.胶原酶作用较缓和，能消化细胞间质中的胶原纤维以释放细胞，对细胞损伤小，且在新生大鼠心肌组织，以胶原I为主,故我们选用胶原酶I.文献报道胶原酶的工作浓度一般在0.6~1 g・L1,我们使用的为0.8 g・L1.胶原酶最好现用现配.3消化程度的把握新生大鼠心肌细胞对酶消化极为敏感.消化过度可使肌原纤维出现萎缩，细胞死亡率增加或丧失贴壁能力及搏动能力；消化不足，细胞聚集成团，无法分清细胞边界，难以形态学观测.消化过程中使用磁力搅拌器时应注意:(1)转速一般控制在60~80 r・min1左右.(2)每次消化的时间须结合消化酶浓度确定.(3)将粘附在搅拌子上的心肌组织吹散，使酶液充分接触组织.(4)适宜温度为35~37℃.(5)当组织由红转白呈半透明状态时，应停止消化.4接种的细胞密度心肌细胞接种密度不仅影响细胞间的相互接触，进而影响细胞对肥大刺激的反应，而且影响长期培养细胞的成活率.接种细胞的绝对数量应经精确计算.一般而言，应根据实验的观测目的决定单位面积上的细胞数量.例如，如作形态学观测,六孔板中每孔的接种细胞数量应控制在1×105~2×105个；若需收获心肌细胞作mRNA或蛋白表达水平的观测，则每孔的接种密度可增加到5×105~6×105个.5细胞的分散度与接种的均匀性分离出的心肌细胞，在溶液中Ca2+作用下较容易出现集聚现象.因此，在进行差速贴壁前后，均应反复多次地轻柔吹打使心肌细胞成单个分散状态.接种后，应小心使心肌细胞均匀地分布于培养板上,避免细胞向培养孔的中央集聚.此外，可将培养板放入孵箱后用滴管轻轻吹打各孔中央部位2~3次，但应格外注意避免污染.6对成纤维细胞的抑制与血清种类的选择成纤维细胞较心肌细胞更容易贴壁且具有分裂增殖能力，经差速贴壁后仍有少量成纤维细胞混杂于心肌细胞之中，若处理不当，很容易生长成优势细胞.溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine, BrdU)可干扰细胞的有丝分裂，故常规使用BrdU抑制成纤维细胞的生长.但是，如果使用胎牛血清培养细胞，由于胎牛血清所含的促细胞有丝分裂的因子较多，BrdU 很难完全抑制成纤维细胞的生长.改用小牛血清则可克服这种现象的出现，获得高达90％以上的心肌细胞.7换液时间进行心肌细胞形态学观测时，接种密度较低，贴壁的心肌细胞数量减少，为避免成活心肌细胞随换液而被丢弃，应在接种48 h后换液.这样不仅使贴壁的心肌细胞数量明显增加，而且BrdU作用时间较长，对成纤维细胞的抑制作用更确实.此外，去血清后可用ITS和0.1 g ・L1BSA对心肌细胞进行营养支持，对心肌细胞贴壁率与凋亡率均不产生明显影响.8抗污染措施除应注意无菌操作等常规技术方法外，还应特别注意以下几点：(1)获取心脏时避免剪破消化道.比较稳妥的办法是在剑突上一肋处入剪，这样做不涉及腹腔，也就减少了污染机会.(2)如条件允许，应避免乳鼠心肌细胞与其他细胞在同一孵箱内共同培养，以防止发生交叉污染.(3)对于培养心肌细胞的观察、照相每次时间不可过长，否则既会导致培养液pH改变，又能增加污染机率.9培养液pH值适宜的pH范围在7.2~7.4之间，配制及使用培养液时应注意：(1) pH值会在过滤后上升0.1~0.3.(2)培养液中加入血清后pH值会有降低，降低程度与血清品质和含量有关.(3)应及时换液.(4)配制好的培养液不宜长时间贮存在4℃.这是因为培养液中的CO2会溢出，使培养液pH上升.每次配好的培养液尽量在2 wk内用完，否则应部分置于－20℃保存，使用前应补充谷氨酰胺和NaHCO3，再次过滤后方可使用.1，取心脏：起初取心脏的听说可以“剪开胸骨，就可以挤出来”但是找不到合适的剪开点。

脂肪酸结合蛋白3对缺氧后心肌细胞存活和凋亡的调节作用庄玲芳;陈康【摘要】目的·探讨脂肪酸结合蛋白3 (fatty acid binding protein 3,FABP3)是否参与了缺氧后心肌细胞的存活及其可能的分子机制.方法·分离新生大鼠心肌细胞,使用重组人源FABP3刺激该细胞,利用锥虫蓝实验和MTT法检测缺氧状态下心肌细胞的存活和死亡情况;应用蛋白质印迹检测FABP3对凋亡相关蛋白PARP、caspase 3表达水平的影响;采用免疫荧光染色技术分析缺氧状态下细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平和线粒体膜电位的变化.结果·使用重组人源FABP3刺激心肌细胞可显著增加心肌细胞的死亡数,缺氧后心肌细胞的存活率下降(P=0.021).FABP3可上调cleaved PARP和cleaved caspase 3的蛋白水平(P=0.006,P=0.002),增加细胞内ROS含量(P=0.038),同时降低线粒体膜电位(P=0.002).结论·FABP3通过诱导细胞内ROS的产生和线粒体膜电位的降低,参与了缺氧后心肌细胞的存活和凋亡.【期刊名称】《上海交通大学学报（医学版）》【年(卷),期】2019(039)006【总页数】7页(P586-592)【关键词】脂肪酸结合蛋白3;缺氧;凋亡;活性氧【作者】庄玲芳;陈康【作者单位】上海交通大学医学院附属瑞金医院心内科,上海200025;上海交通大学医学院附属瑞金医院心内科,上海200025【正文语种】中文【中图分类】Q253脂肪酸结合蛋白3（fatty acid binding protein 3，FABP3）是一类小分子可溶性蛋白质，相对分子质量为14 000～15 000，广泛存在于心肌细胞中，约占心肌细胞全部可溶性蛋白的5%[1] 。

生理状态下，FABP3与细胞内疏水性的长链脂肪酸结合后，转运到线粒体中进行脂肪酸的代谢，为正常心脏的收缩和舒张提供能量[2] 。

新生大鼠原代心肌细胞分离实验用材料a) Fibronectin: Sigma; Catalog # 2891492b) Phosphate-Buffered Saline (PBS) Ca/Mg free: HyClone; Catalog #c). Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS, D-Hanks’),d) Trypsin: Gibco; Catalog # 27250-018（28mg）e) Collagenase Type I I: Gibco; Catalog # 17101-015（20mg）f) DMEM: Hyclone; Catalog # SH30022.08g) Fetal Bovine Serum (FBS): Gibco; Catalog # 16000-044原代新生乳鼠心肌细胞分离一、FN包被Cardio Plate（时间：约3小时）1．使用PBS缓冲液将1mg/ml的FN储存液按1：100的比例稀释成1ug/ml工作液2．在E-Plate Cardio 96每孔加入20—30 µl 配制好的1ug/ml的FN工作液。

3．将包被好的E-Plate Cardio 96 置于细胞培养箱内约3h左右。

二、原代大鼠心肌细胞分离（时间：约3小时）1. 获取大鼠心室组织(使用出生24h内的SD大鼠)。

1) 用70%的酒精消毒乳鼠。

2)无菌的解剖板上，左手用镊子固定乳鼠，右手持眼科剪，在无菌条件下迅速剪开胸骨剑突下稍左侧的皮肤。

换眼科剪，在胸骨剑突下稍左侧打开胸腔，左手轻轻用力，心脏跃出，用眼科弯镊取心脏心尖部，置于预冷的DMEM中，在预冷的DMEM 中漂洗3次，去除血液。

3) 将漂洗后的心尖组织在预冷的DMEM去除心房和血管等组织。

4) 在5ml玻璃瓶中加入2ml预冷的HBSS，将心尖转移到HBSS中，用眼科剪剪成约1mm3的小块。