微卫星DNA
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微卫星稳定免疫组化诊断标准人类错配修复(MMR)基因除了检验和校正复制期间发生在微卫星样重复DNA序列上小的插入和丢失之外,还防止解旋的DNA序列重新结合。
MMR基因突变破坏了MMR蛋白的功能,引起重复DNA序列的产生及DNA修复错误,从而导致患者DNA出现微卫星不稳定(MSI)。
Lynch综合征是一种由错配修复(MMR)基因种系突变引起的常染色体显性遗传病。
MSI检测具有重要临床意义:1、诊断Lynch综合征:MSI是Lynch综合征的重要生物学标记,当MSI-H被证实,该诊断即可成立;2、判断预后及治疗效果:MSI-H的结直肠癌患者对化疗药物5-氟尿嘧啶的疗效不佳;3、鉴别遗传性胚系来源与散发性来源的MSI结直肠癌:散发性MSI-H结直肠癌的病因通常是hMLH1基因启动子甲基化,只有小部分为BRAF基因突变致MMR基因沉默而免疫组化阴性,并出现MSI。
若肿瘤MMR基因启动子甲基化或BRAF基因突变阳性,说明为散发性癌;4、筛查:Bethesda修订指南建议对小于50岁的患者常规进行MSI检测。
根据Bethesda修订指南,有下列指征的患者需做MSI检测:1、患者年龄小于50岁;2、肿瘤位于右半结肠;3、易发生肠内或肠外其他器官的多发性肿瘤;4、术后易再发其他原发性恶性肿瘤;5、肿瘤有淋巴细胞浸润;6、多分泌黏蛋白或有印戒细胞;7、浸润性生长模式。
MSI检测目前有以下两种检测方法:1、PCR技术检测方法对石蜡切片进行人工显微切割提取DNA,以一些微卫星点为标记指导合成引物进行PCR,通过凝胶电泳分析得出MSI谱,进行比较分析。
最常用的2个Promega分析系统由5个单核苷酸标记点(BAT-25、-26,MONO-27,NR-21、-24)构成;而美国国家癌症研究所(NCI)参考系统由3个双核苷酸(D2S123、D5S346和D17S250)和2个单核苷酸(BAT-25和-26)构成。
当胚系谱中微卫星的长度改变,MSI的诊断即可成立。
叠加效应或重叠作用:两对或两对以上等位基因同时控制一个单位性状,只要其中一队等位基因中存在显性基因,个体便表现显性性状,两对基因均为纯和隐性时,个体表现隐性性状的基因互作类型。
将孟德尔比率修饰为15:1上位效应或上位作用:又称异位显性。
两对基因同时控制一个单位性状发育,其中一对基因对另一对基因的表现具有遮盖作用,这种基因互作类型称为上位效应。
与显性相似,因为这两者都是一个基因掩盖了另一个基因的表达,区别就在于显性是一对等位基因中一个基因掩盖另一个基因的作用,而上位效应是非等位基因间的掩盖作用,掩盖者称为上位基因,也称为异位显性。
被掩盖者称为下位基因上位性和显性的区别:1 显性是一对等位基因中,显性基因掩盖另一隐性基因2 上位性是非等位基因的掩盖,掩盖者称上位基因,异位显性,被掩盖者称下位显性并发系数:观察到的双交换率与预期的双交换率(两个单交换率的乘积)的比值从性遗传:常染色体上的基因所控制的性状在表现型上受个体性别的影响,只出现与雌方或雄方;或在一方为显性另一方为隐性的现象剂量补偿作用:是使具有两份或两份以上的基因量的个体与只具有一份基因量的个体的基因表现趋于一致的遗传效应、剂量补偿效应:在哺乳动物中一定存在一种机制可以补偿x染色体的超量。
在XY性别决定机制的生物中,使性连锁基因在良种性别中有相等或近乎相等的有剂量的遗传效应。
两种机制:1 调节X染色体的转录速率;2 通过失火雌性细胞中的一条X染色体来实现的,无论是雌性还是雄性细胞都只有一条X染色体是有活性假连锁:两对染色体上原来不连锁的基因由于靠近易位断点,易位杂和体总是以交替式分离方式产生可育的配子,因此就表现出假连锁现象限性遗传:是指位于Y染色体(XY型)或W染色体(ZW型)上的基因所控制的遗传性状只限于雄性或雌性上表现的现象基因表达:基因编码的信息转化为细胞结构并在细胞中行使功能的过程。
包括转录成信使RNA接着翻译成蛋白质的基因以及转录成RNA,但是不翻译成蛋白质的基因顺反子:即结构基因,为决定一条多肽链合成的功能单位,约1000bp。
微卫星DNA标记应用于畜禽血缘关系鉴定作者:张一君马海明来源:《国外畜牧学·猪与禽》2016年第02期摘要:随着现代畜牧业的发展,公畜对畜禽育种的影响越来越大,优秀公畜的后裔越来越多,优秀种畜在生产上的贡献也较为突出,因此亲子鉴定对畜牧业有重要的指导意义。
微卫星标记技术以其具有分布广泛,多态信息含量高,呈共显性以及检测方便、快速等优点而备受关注,成为国际动物遗传协会(ISAG)和联合国粮农组织(FAO)优先推荐的分析畜禽遗传多样性的工具,被广泛应用于畜禽的遗传多样性分析、品种间遗传距离估测及亲子鉴定和血缘控制来防止近亲交配。
关键词:微卫星标记;亲缘关系;遗传多样性中图分类号:S813.1 文献标识码:A 文章编号:1001-0769(2016)02-0047-021 微卫星标记的结构微卫星标记(Microsatellite),又称为短串联重复序列(Short Tandem Repeats)或简单重复序列(Simple Sequence Repeats),是均匀分布于真核生物基因组中的简单重复序列[1-3],由2~6个核苷酸的串联重复片段构成,美国人Weber发现了微卫星DNA具有长度多态性[4],并将微卫星分为3类:单纯(Pure)SSR、复合(Compound)SSR和间隔(Interrupted)SSR。
单纯SSR是指由单一的重复单元所组成的序列,如(AT)n;复合SSR则是由2个或多个重复单元组成的序列,如(GT)n(AT)m;间隔SSR在重复序列中有其他核苷酸夹杂其中,如(GT)nGG(GT)m。
由于重复单位的重复次数在个体间呈高度变异性并且数量丰富,因此微卫星标记的应用非常广泛。
2 微卫星标记的特点2.1 分布广泛,有高度多态性微卫星DNA在真核生物的基因组中广泛存在且分布比较均匀。
平均每10 kb的DNA序列中就会出现一个微卫星序列[5]。
在猪的基因组中,每隔 30 kb~50 kb就会有1个两核苷酸重复[6]。
大豆基因组中的微卫星标记
刘峰;陈受宜
【期刊名称】《大豆科学》
【年(卷),期】1998(17)3
【摘要】微卫星DNA是一种简单重复序列(SimpleSequenceR
epeat,SSR),其核心单位由2-5个核苷酸组成,两侧一般是保守序列。
由于它具有共显性,多态性高,可进行PCR扩增分析,既简单又经济,因此是一种很有价值的分子标记。
实验证明大豆的微卫星DNA随机分布于基因组中,其核心单位主要是(AT)n,(ATT)n。
在人类基因组中占很大比例的(CA)n则很少在大豆中出现。
平均每一个微卫星座位有7-10个等位基因,最高可达26个。
大豆的微卫星标记可扩充现有的RFLP图谱,广泛应用于基因型鉴定,基因和QTL分析,分子标记辅助育种和家系分析等。
【总页数】6页(P256-261)
【关键词】大豆;等位基因多样性;微卫星标记;核苷酸
【作者】刘峰;陈受宜
【作者单位】中国科学院遗传研究所植物生物技术实验室
【正文语种】中文
【中图分类】S565.103.2
【相关文献】
1.水稻基因组中的微卫星标记及其应用 [J], 何风华
2.开口箭基因组中微卫星特征分析与分子标记开发 [J], 丁家玺;周天华;王小童
3.大麦基因组中的微卫星标记及其应用 [J], 冯宗云;张义正;凌宏清
4.微卫星标记分析在人类基因组多样性研究中的应用 [J], 况少青;褚嘉佑
5.草鱼基因组中微卫星分子标记的制备及筛选 [J], 马海涛;鲁翠云;于冬梅;孙效文因版权原因,仅展示原文概要,查看原文内容请购买。
微卫星不稳定性的检测和意义秦皇岛第四医院病理科康文喜岳秀杰杨崔航1981年Miesfeld从人类基因文库中发现一段长约2—10个核苷酸片段,他将这一小段核苷酸片段命名为“微卫星”(microsatellite,MS)。
人体在正常状态下,微卫星的长度和排序保持不变,并且稳定遗传.但在某些因素作用下,微卫星的 DNA在复制过程中由于滑动等因素,导致双链分子的碱基发生错配、插入或缺失,引起微卫星的结构发生改变,这种结构上发生改变的微卫星就叫做微卫星不稳定性(microsatellite instability,MSI)。
近年来的研究表明,微卫星不稳定性尤其是高度微卫星不稳定性与许多肿瘤的发生和发展关系密切。
研究认为微卫星不稳定性在肿瘤的发生、发展中发挥重要作用,是肿瘤形成又一机制。
在正常人体细胞内,微卫星的分子结构保持稳定不变,其原因是在人体细胞内有一种能够修复微卫星的安全保障体系,这种安全保障体系是由一系列特异性修复微卫星碱基错配的酶分子组成,叫做微卫星错配修复系统(mismatch repair system,MMR)。
人体细胞中由于错配修复系统系统的存在,才能避免遗传物质发生改变,保证DNA复制的高保真度。
微卫星突变后会使正常细胞向恶性肿瘤细胞转化,最终发生恶性肿瘤。
进一步的研究表明,很多肿瘤的发生如肺癌、食道癌、膀胱癌、胃癌、甲状腺癌……等均与微卫星不稳定性密切相关。
在对多种癌组织进行微卫星不稳定性检测后发现,其微卫星不稳定性的突变率明显增高。
在遗传性非息肉性结直肠癌(HNPCC)中微卫星不稳定性的突变率可高达70—90%,散发性大肠癌微卫星不稳定性的突变率也高达28。
85%。
因此,微卫星不稳定性的检测已经成为筛选恶性肿瘤的重要诊断指标。
目前临床上微卫星不稳定性的检测主要利用免疫组化或多聚酶链反应方法,检测项目有MLH1、MSH2、MSH6和PMS2。
微卫星不稳定性检测的意义:1、判断预后:目前大量证据表明,错配修复基因缺失/高度微卫星不稳定性是Ⅰ期结直肠癌患者预后良好的一个标志物。
1、STS(序列标签位点),是已知核苷酸序列的DNA片段,是基因组中任何单拷贝的短DNA序列,长度在100~500bp之间。
任何DNA序列,只要知道它在基因组中的位置,都能被用作STS标签。
作为基因组中的单拷贝序列,是新一代的遗传标记系统,其数目多,覆盖密度较大,达到平均每1kb一个STS或更密集。
用途:这种序列在染色体上只出现一次,其位置和碱基顺序都是已知的。
在PCR反应中可以检测出STS来,因此STS适宜于作为人类基因组的一种地标,据此可以判定DNA 的方向和特定序列的相对位置。
任何一个DNA序列要成为STS,须满足两个前提:第一:它的序列必须是己知的,以便于用PCR方法检测STS在不同DNA片段中存在与否。
第二个要求是STS必须在待研究的染色体上有唯一的定位,或当DNA片段群覆盖全基因组时,STS在整个基因组中具有唯一的定位位点。
如果STS序列具有多个定位点,那么作图数据将会模糊不清。
因此需要确保STS不包含重复DNA的序列。
获得STS途径:①、表达序列标记:表达序列际记(expressed sequence tag, EST)是通过互补DNA (cDNA)克隆分析获得的短序列。
制备互补DNA是将mRNA转化成双链DNA.由于细胞中mRNA来自于编码蛋白的基因,故此cDNA代表了mRNA来源的细胞中表达的基因序列。
EST被看做获得重要基因序列的快捷途径。
即使其序列不完整,也仍然有价值。
如果EST 来自于单一序列DNA,不是基因家族中的某一成员,它也可以被用作STS。
而所谓基因家族是指一组具有相同或相近序列的基因。
②、SSLP:SSLP在物理作图中也可以被用作STS,具有多态性的SSLP以及已通过连锁分析定位的SSLP特别有用,因为它们可在遗传图谱和物理图谱间提供直接联系。
③、随机基因组序列:可以通过对克隆的基因组DNA的随机小片段进行测序或在数据库中搜寻贮存序列获得。
2、STR(短串联重复序列):又称微卫星DNA(micro satellite DNA),是一类广泛存在于人类基因组中的DNA多态性基因座。
微卫星不稳定与结直肠癌关系结直肠癌是常见的恶性肿瘤,近年来我国结直肠癌的发病率和死亡率均呈上升趋势,对其发病机制研究的重要性渐为人们认识涉及了多基因改变,微卫星不稳定性,细胞凋亡机能受限,端粒酶活化以及多条信号传导通路异常等。
近期分子学研究发现,DNA修复基因突变引起DNA错配修复系统的功能降低或丧失,从而引起遗传物质不稳定,主要表现为微卫星的不稳定性(microsatellite instability,MSI),进而导致肿瘤的发生。
研究表明,微卫星不稳定性可能是结直肠癌发生过程中一个新发现的重要机制。
现就微卫星不稳定性与遗传性非息肉性结直肠癌关系的研究进展作一综述[1]。
1 微卫星不稳定(MSI)1980年Wyman等[2]首先发现了DNA分子中的一个高度多态性位点,其后人们不断发现这一类由一段核苷酸序列多次串连重复所形成的高变区,称为VNTR。
VNTR又进一步分为小卫星和微卫星。
小卫星的特点是重复单位长度为8到数10个核苷酸,不同的基因座位有不同的结构,但一般都拥有一段共同的核心序列。
1981年Miesfeldd等[3]首次发现微卫星DNA,微卫星DNA由2~6个核苷酸组成,常见的有2、3、4核苷酸重复序列,尤以二核苷酸的重复序列(CA/GT)n最为常见。
微卫星广泛存在于原核及真核基因组中,约占真核基因组的5% ,多位于编码区附近,也可以位于内含子、启动子、Alu序列中。
微卫星DNA数目巨大,人类基因组中约有5×104 个(CA)n重复序列,重复次数一般15~60次,重复单位结构相同,其长度一般小于200 bp。
每个特定位点的微卫星DNA均由中间的核心区和外围的侧翼区2部分构成。
核心区含有1个以上称为“重复”的短序列,一般该重复单位的碱基对数目不变,而串连在一起的重复单位数目是随机改变的,如果用一种不切重复单位的限制性内切酶把DNA分子切割成限制性酶,该限制性酶中位于核心区的外围即是侧翼区[4] 。
名词解释:断裂基因、外显子、内含子、C值、C值矛盾、基因家族、基因簇、卫星DNA、ORF、微卫星DNA、反向重复序列、正链/负链RNA病毒、重叠基因、端粒酶、假基因、Alu家族、基因组学。
断裂基因:在真核生物基因组中,基因是不连续的,在基因的编码区域内部含有大量的不编码序列,从而打断了对应于蛋白质的氨基酸序列。
这种不连续的基因又称断裂基因或割裂基因。
外显子:断裂基因中编码的序列称为外显子(exon),即基因中对应于信使RNA序列的区域。
内含子:断裂基因中不编码的间隔序列称为内含子(intron),内含子是在信使RNA被转录后的剪接加工中去除的区域。
C值:生物种的一个特征是一个单倍体基因组的全部DNA含量总是相对恒定的。
通常称为该物种的C值。
C值矛盾:C-值矛盾(C Value Paradox)是指真核生物中DNA含量的反常现象。
主要表现为:① C值不随生物的进化程度和复杂性而增加;②关系密切的生物C值相差甚大;③高等真核生物具有比用于遗传高得多的C值。
基因家族:基因家族(gene family)是真核生物基因组中来源相同,结构相似,功能相关的一组基因。
基因簇:基因簇(gene cluster)是指基因家族中的各成员紧密成簇排列成大段的串联重复单位,定位于染色体的特殊区域。
卫星DNA:有些高度重复DNA序列的碱基组成和浮力密度与主体DNA不同,在氯化铯密度梯度离心时,可形成相对独立于主DNA带的卫星带。
这些卫星带称为卫星DNA。
ORF:指核苷酸序列的可阅读框。
微卫星DNA:微卫星DNA是由更简单的重复单位组成的小序列,分散于基因组中,大多数重复单位是二核苷酸,也有少量三或四核苷酸的重复单位。
反向重复序列:在DNA分子中核苷酸顺序相同、区向相反的核苷酸序列。
如:AGTTC…CGTTATAACG…GCAAT正链/负链RNA病毒:所含核酸为RNA的病毒称为RNA病毒。
如果所含单恋核酸与mRNA序列相同称之为正链RNA病毒,与mRNA序列互补称之为负链RNA病毒。
名词解释:断裂基因、外显子、内含子、C值、C值矛盾、基因家族、基因簇、卫星DNA、ORF、微卫星DNA、反向重复序列、正链/负链RNA病毒、重叠基因、端粒酶、假基因、Alu家族、基因组学。
断裂基因:在真核生物基因组中,基因是不连续的,在基因的编码区域内部含有大量的不编码序列,从而打断了对应于蛋白质的氨基酸序列。
这种不连续的基因又称断裂基因或割裂基因。
外显子:断裂基因中编码的序列称为外显子(exon),即基因中对应于信使RNA序列的区域。
内含子:断裂基因中不编码的间隔序列称为内含子(intron),内含子是在信使RNA被转录后的剪接加工中去除的区域。
C值:生物种的一个特征是一个单倍体基因组的全部DNA含量总是相对恒定的。
通常称为该物种的C值。
C值矛盾:C-值矛盾(C Value Paradox)是指真核生物中DNA含量的反常现象。
主要表现为:① C值不随生物的进化程度和复杂性而增加;②关系密切的生物C值相差甚大;③高等真核生物具有比用于遗传高得多的C值。
基因家族:基因家族(gene family)是真核生物基因组中来源相同,结构相似,功能相关的一组基因。
基因簇:基因簇(gene cluster)是指基因家族中的各成员紧密成簇排列成大段的串联重复单位,定位于染色体的特殊区域。
卫星DNA:有些高度重复DNA序列的碱基组成和浮力密度与主体DNA不同,在氯化铯密度梯度离心时,可形成相对独立于主DNA带的卫星带。
这些卫星带称为卫星DNA。
ORF:指核苷酸序列的可阅读框。
微卫星DNA:微卫星DNA是由更简单的重复单位组成的小序列,分散于基因组中,大多数重复单位是二核苷酸,也有少量三或四核苷酸的重复单位。
反向重复序列:在DNA分子中核苷酸顺序相同、区向相反的核苷酸序列。
如:AGTTC…CGTTATAACG…GCAAT正链/负链RNA病毒:所含核酸为RNA的病毒称为RNA病毒。
如果所含单恋核酸与mRNA序列相同称之为正链RNA病毒,与mRNA序列互补称之为负链RNA病毒。
叠加效应或重叠作用:两对或两对以上等位基因同时控制一个单位性状,只要其中一队等位基因中存在显性基因,个体便表现显性性状,两对基因均为纯和隐性时,个体表现隐性性状的基因互作类型。
将孟德尔比率修饰为15:1上位效应或上位作用:又称异位显性。
两对基因同时控制一个单位性状发育,其中一对基因对另一对基因的表现具有遮盖作用,这种基因互作类型称为上位效应。
与显性相似,因为这两者都是一个基因掩盖了另一个基因的表达,区别就在于显性是一对等位基因中一个基因掩盖另一个基因的作用,而上位效应是非等位基因间的掩盖作用,掩盖者称为上位基因,也称为异位显性。
被掩盖者称为下位基因上位性和显性的区别:1 显性是一对等位基因中,显性基因掩盖另一隐性基因2 上位性是非等位基因的掩盖,掩盖者称上位基因,异位显性,被掩盖者称下位显性并发系数:观察到的双交换率与预期的双交换率(两个单交换率的乘积)的比值从性遗传:常染色体上的基因所控制的性状在表现型上受个体性别的影响,只出现与雌方或雄方;或在一方为显性另一方为隐性的现象剂量补偿作用:是使具有两份或两份以上的基因量的个体与只具有一份基因量的个体的基因表现趋于一致的遗传效应、剂量补偿效应:在哺乳动物中一定存在一种机制可以补偿x染色体的超量。
在XY性别决定机制的生物中,使性连锁基因在良种性别中有相等或近乎相等的有剂量的遗传效应。
两种机制:1 调节X染色体的转录速率;2 通过失火雌性细胞中的一条X染色体来实现的,无论是雌性还是雄性细胞都只有一条X染色体是有活性假连锁:两对染色体上原来不连锁的基因由于靠近易位断点,易位杂和体总是以交替式分离方式产生可育的配子,因此就表现出假连锁现象限性遗传:是指位于Y染色体(XY型)或W染色体(ZW型)上的基因所控制的遗传性状只限于雄性或雌性上表现的现象基因表达:基因编码的信息转化为细胞结构并在细胞中行使功能的过程。
包括转录成信使RNA接着翻译成蛋白质的基因以及转录成RNA,但是不翻译成蛋白质的基因顺反子:即结构基因,为决定一条多肽链合成的功能单位,约1000bp。
生物的基因组中,特别是高等生物的基因组中含有大量的重复序列,根据重复序列在基因组中的分布形式可将其分为串联重复序列(Tandem Repeats Sequence,TRS)和散布重复序列(Dispersed Repeats Sequence,DRS)。
其中,串联重复序列是由相关的重复单位首位相连、成串排列而成的。
目前发现的串联重复序列主要有两类:一类是由功能基因组成的(如rRNA和组蛋白基因);另一类是由无功能的序列组成的。
根据重复序列的重复单位的长度,可将串联重复序列分为卫星DNA、微卫星DNA、小卫星DNA等。
微卫星DNA又叫简单重复序列(Simple Sequence Repeat,SSR),指的是基因组中由1-6个核苷酸组成的基本单位重复多次构成的一段DNA,广泛分布于基因组的不同位置,长度一般在200 bp以下。
研究表明,微卫星在真核生物的基因组中的含量非常丰富,而且常常是随机分布于核DNA中。
在植物中通过对拟南芥、玉米、水稻、小麦等的研究表明微卫星在植物中也很丰富,均匀分布于整个植物基因组中,但不同植物中微卫星出现的频率变化是非常大的,如在主要的农作物中两种最普遍的二核苷酸重复单位(AC)n和(GA)n在水稻、小麦、玉米、烟草中的数量分布频率是不同的。
在小麦中估计有3000个(AC)n序列重复和约6000个(G A)n序列重复,两个重复之间的距离平均分别为704 kb、440 kb,而在水稻中,(AC)n 序列重复约有1000个左右,(GA)n 重复约有2000个,重复之间的平均距离分别为450 kb、225 kb。
另外在植物中也发现一些三核苷酸和四核苷酸的重复,其中最常见的是(AAG)n、(AAT)n。
在单子叶和双子叶植物中SSR数量和分布也有差异,平均分别为64.6 kb和21.2 kb中有一个SSR。
研究还发现,单核苷酸及二核苷酸重复类型的SSR主要位于非编码区,而有部分三核苷酸类型位于编码区。
昆虫分类学课程论文 1 微卫星DNA在种下分化及近缘种的鉴定中的应用 农业昆虫与害虫防治 姚远 M071105 摘要:微卫星DNA标记作为一种多态性和稳定性高、重复性好、呈共显性的分子遗传标记技术,目前已被广泛应用于昆虫学的研究中。本文介绍了微卫星DNA标记的基本原理和特点,并综述了近年来该技术在昆虫种群遗传结构及分化、近缘种的鉴定、遗传图谱的构建、基因定位以及系统发生等领域中的应用。 关键词: 微卫星DNA标记;多态性;分化;种群
早在1974 年,Skinger在蟹的DNA 中发现了一类短串联重复序列TAGG。随后人们在人、动物和酵母的基因组中都发现了大量的简单重复序列,因为其比小卫星(10~25bp)短,每个重复单位仅1~6bp,重复数10~20次,是头尾相连的串联重复序列,故称微卫星(microsatellite),又称为简单序列重复DNA(Simple Sequence Repeat,SSR)。重复类型有两种单核苷酸如A/T、C/G;四种二核苷酸重复AT/TA、AC/TG、AG/TC、CG/GC 以及三、四核苷酸重复类型等,但研究发现较多的为AC/TG,约占57%,其它类型较少。而且根据微卫星核心序列排列方式的不同,可分为完全(perfect),不完全(imperfect)和复合型(compound)微卫星。 20世纪七八十年代以来,伴随着分子生物学的飞速发展,出现了多种多样的DNA分子标记[1]。目前常用的DNA分子标记技术有限制性片段长度多态性( restriction fragment length polymorphism,RFLP) 、数量可变的串联重复序列(variable number of tandem repeat, VNTR) 、随机扩增多态性DNA ( random amp lified polymorphic DNA, RAPD) 、扩增片段长度多态性( amp lified fragment length polymorphism, AFLP) 、微卫星标记(microsatellite marker) 、简单重复序列间扩增( inter-simple sequence repeat, ISSR)和单核苷酸多态性( single nucleotide polymorphysm, SNP) 。微卫星标记与其他分子标记相比,具有多态性和杂合度高、稳定性和重复性好、在不同种群中分布广、呈孟德尔共显性遗传等优点[2] ,正日益受到昆虫学家们的重视,在昆虫学研究中扮演着日益重要的角色。
1 微卫星DNA的结构和功能 微卫星DNA也称简单重复序列,由Miesfeld et al[3]于1981年首先从人类基因文库中发现。其核心结构是由2 - 10个核苷酸为重复单位串联组成的长达几十个核苷酸的序列,它在真核生物的基因组中广泛存在,并且具有较高的多态性[4] 。按照重复结构的不同,微卫星DNA可分为3种基本类型[5 ] : (1)完全重复型,如(CA) n; (2)不完全重复型,如(CA) n. CCA. (CA)m; (3)复合型,如(CA) n ( TG)m。微卫星DNA在真核生物基因组中的分布比较均匀,平均每10 kb DNA序列中出现1个微卫星序列[5-6] 。同时,微卫星DNA既可存在于基因组的非编码区中,也可存在于基因组的编码区中[ 20-22 ] 。其具体功能还不是完全清楚,目前一般认为它可能参与基因调控、影响基因的转录和翻译等过程,从而影响蛋白质的编码和功能,它的积累最终会导致表型的改变[7] 。此外,微卫星DNA还有可能参与染色体折叠,维持染色体结构,参与端粒和着丝粒形成,并且在细胞周期调控和错配修复等方面起到一定的作用[8] 。而对于昆虫分类学课程论文 2 其来源,目前认为微卫星丰富的多态性的产生可能与DNA重组过程中的不等价交换有关,也可能与DNA复制过程中的“滑链错配”( slipped-strand mispairing)有关[9] 。从进化角度看,物种间重复序列并不是以前一些人所认为的“垃圾”序列,其差异是自然选择的结果,在生物进化过程中起着重要的调节作用。进化层次越高的生物,重复序列占总DNA的比重越大。如重复序列占噬菌体基因组的10% ,细菌基因组的20% ,酵母基因组的30% ,线虫基因组的60% ,在人的基因组中这一指数则高达90%[9-10] 。
2 微卫星标记技术概况 微卫星(Microsatellites) ,又称简单序列重复(Simple sequence repeats ,SSRs) 、短串联重复( Short tandem repeats ,STRs) 、简单序列长度多态性(Simple sequence length polymorphism ,SSLP) ,是指以少数几个核苷酸(一般为1~6个) 为重复单位组成的简单的串联重复序列,由于重复的次数不同以及重复的程度不一致而造成这些序列的多态性。微卫星上不同长度的等位基因按简单的孟德尔方式遗传。由于微卫星具有高度多态性、在基因组中含量丰富且分布均匀等优点,这一技术很快便发展为一种分子标记,并在自然种群的许多研究中得到了广泛应用。
2.1 微卫星标记的基本原理 SSR标记由核心序列和两翼的保守序列组成,根据两侧保守的DNA 序列设计出互补的特定寡核苷酸引物,然后对基因组DNA 进行PCR 扩增,利用琼脂糖凝胶电泳或高分辨率的聚丙烯酰胺凝胶电泳对PCR扩增产物进行分离,从而检测出DNA 的多态性,即检测出了不同个体在每个微卫星座位上的差别[31 - 32] 。 2.2 引物的筛选 根据微卫星两侧翼的保守序列可设计出一段互补序列的寡聚核苷酸引物。以往的方法是先构建DNA文库,然后筛选出重复性好、具有多态性的微卫星位点,但这种方法工作量大,成本高,目前只用于模式生物的研究[11] 。近年来,随着基因组计划的开展和大规模测序工作的进行,互联网上一些公共数据库(如GenBank、EMBL)中的DNA序列和EST序列越来越多,可以方便地查找到相关的目标序列来设计相应SSR引物,也可根据已发表的文献上相关物种的已知引物来设计目标引物[ 16,34 - 35 ] 。 2.3 微卫星的PCR扩增 进行SSR分析时,首先从生物样本中提取基因组DNA,并保证其具备一定的浓度和纯度。在随后的PCR扩增程序中,需针对不同引物和不同物种基因组DNA来优化扩增条件,即通过预实验对体系中各成分浓度、退火温度、循环次数和时间等反应参数进行调整优化,以获得清晰、重复性好的谱带。PCR产物可通过琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测。 2.4 微卫星标记的特点 微卫星标记具有以下特点。(1)微卫星DNA在真核生物中广泛存在。(2)通常呈孟德尔式遗传,具有很好的稳定性、多态性和杂合度,并且等位基因间呈共显性遗传特点[3 – 4,8,10 - 12] 。(3)DNA用量少,并且可以利用非损伤取样,如从唾液、毛发、排泄物、珍贵标本以昆虫分类学课程论文 3 及化石材料中取样进行种群遗传结构的研究[13] 。(4)从一个物种中获得的微卫星引物在近缘种中具有一定的通用性,随着现在大量序列数据的出现,使设计未知物种的微卫星引物越来越方便。(5)微卫星DNA较容易扩增,且PCR产物通过电泳可检测到单碱基的差异,遗传信息量大。(6)微卫星DNA检测容易,适合进行自动化分析,省时省力。
3 微卫星标记在昆虫学研究中的应用 3.1 群体遗传结构的分析 微卫星的突变速率在不同物种、同一物种的不同位点甚至在同一位点的不同等位基因间都存在着较大的差异[14-15] ,因此,微卫星具有高度的遗传多态性。通过分析微卫星多态位点的比率及杂合度,可了解昆虫种群的遗传多样性,从而进一步分析昆虫的群体遗传结构[16] 。England et al[7]应用8个微卫星位点研究了黑尾果蝇(Drosophila melanogaster)的种群结
构,发现相对于异型酶来说,微卫星具有更高的多态性。杨效文等[17]通过构建棉蚜(Aphis gossypii)基因组DNA 300 - 800 bp的插入文库,筛选出2个微卫星位点,并对棉蚜的种群分化做了深入研究。Kamau et al[18]利用微卫星位点多态性研究冈比亚按蚊(Anopheles gam biae) ,发现地理上的隔离使得不同地区的种群由于缺乏基因交流,而导致种群分化。Estoupet al[19]
利用微卫星DNA的多态性研究西方蜜蜂(Apis mellifera)群体遗传结构, 结果表明,在7个微卫星位点上,7个亚种的9个群体间存在较大差异,在平均杂合度和等位基因的数目上,非洲蜜蜂显著高于欧洲蜜蜂亚种。Evans[20]利用微卫星标记分析了Myrmica tahoensis种群的遗传关系,发现同时产生雄性和雌性后代的群体中,个体间亲缘关系较远;主要产生雌性后代的群体中,则由亲缘关系极近的雌性(工蚁和蚁后)组成。Segura[21]对哥斯达黎加的非洲化蜜蜂进行了微卫星DNA分析,结果显示,在该群体内具有较高的等位基因和单倍体频率,群体内存在着丰富的遗传多样性。Reddy et al[22]进行了家蚕基因组SSR标记的相关研究,利用15个SSR标记对家蚕13个品系进行了多态性分析,鉴定了滞育和非滞育品系特有的SSR标记。龚鹏等[48]利用微卫星标记方法,对棉蚜的DNA多态性进行分析,明确了不同蚜型之间的遗传关系。Kim et al[23]利用微卫星标记分析了美国9个州10个地区595个玉米根虫(Diabrotica virgifera)的遗传多样性,明确其种群的遗传结构。 由于微卫星标记是共显性标记, 许多等位基因表现出高度的杂合性,并且遵循孟德尔式遗法则,利用微卫星标记来研究昆虫种群间和种群内的遗传特性,可以得到丰富的遗传多样性信息。 3. 2 昆虫行为和习性的研究 微卫星标记具有多态性高、信息量大等特点,因而国内外利用该技术对营社会性生活的昆虫的行为和习性也进行了大量研究[24] 。微卫星技术主要用于昆虫繁殖和交配特性的研究。Trontti et al[25]利用微卫星标记研究了斜结蚁( Plagiolepis pygm aea) 3个种群的交配行为和分布模式。Kraaijeveld et al[26]利用微卫星分析地中海野生雌性果蝇(Ceratitis capitata)的后代,研究表明,在繁殖季节,雌性果蝇交尾频率高是普遍现象,该结果为利用不育技术防治害虫奠定了一定的理论基础。Maki2Petays et al[27]采用12个微卫星位点研究蚂蚁Form ica aquilonia和Formica lugubris种群数量与栖息地面积的关系,结果表明,森林覆盖率的下降导