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高效快速筛选新发现的微卫星位点的方法-HRM摘要：本文介绍了一种新的识别微卫星位点的方法，微卫星标记是一种功能强大的共显性标记，扩增产物可靠且可以确定已知物种的高度的多态信息含量，但是对于新位点的发现依然是一种费时费力的方法。
相对于大肠杆菌文库分离方法，新一代测序技术（NGS）可以得到更多可用的候选基因。
我们对已知微卫星引物的注释作了系统的论述，并发现无论采用什么分离技术，由于PCR 未充分扩增，基因位点的单态性或多拷贝都会导致一半以上的候选基因丢失。
因此，在分子标记技术上，筛选候选基因依然是一个很关键的步骤。
我们通过重新评估毛细电泳法进行基因分型，发现HRM可以用于基因分型及筛选候选基因，对此列出了具体的流程。
通过该流程，或许我们可以快速地进行新一代标记的检测，并可以把费用降低到传统方法的一半甚至四分之一。
关键词：HRM 微卫星重新分离技术分子标记新一代测序技术群体遗传学引言微卫星也叫简单重复序列（SSRs），是群体遗传学中最强大的共显性标记，具有广泛的应用(e.g., Chambers and MacAvoy 2000; Ellegren 2004; Jarne and Lagoda 1996;MacDonald et al. 2011)。
最近由于新一代测序技术（NGS）的发展正解决SSRs技术中的一个重要的缺陷，不能获得足够的设计引物的数据。
扩增片段多态位点的选择，依然是一件费时费力的工作，这是SSRs发展中的另一个瓶颈。
因此我们引进了HRM用于识别潜在的SSR位点，并且HRM有望加快SSR的发展速度，降低传统方法的费用。
SSRs 一般是以核心序列1-6bp为重复单位首尾串联而成的短的DNA序列(Wan et al. 2004)。
微卫星具有高突变率、易于进行PCR扩增、便于毛细电泳法(CE)的分析以及可以利用许多软件工具进行生物学推论的诸多优点，使其在群体遗传学方面得到广泛应用。
传统的SSR位点的重新分离，是借助于丰富的基因文库(Glenn and Schable 2005; Zane et al. 2002)，但是该法对于SSR位点不多的物种则不能检测到足够的位点进行分析(Arthofer et al. 2007; Megle´cz et al. 2004)。
微卫星DNA简单重复序(SSR)也称微卫星DNA，也可称为SSRP(Simple Sequence Repeat Polymorphisms)，STMS (Sequence-tagged microsatellites)。
其串联重复的核心序列为1一6 bp，其中最常见是双核昔酸重复，即(CA) n和(TG) n每个微卫星DNA的核心序列结构相同，重复单位数目10一60个，其高度多态性主要来源于串联数目的不同。
SSR标记的基本原理：根据微卫星序列两端互补序列设计引物，通过PCR反应扩增微卫星片段，由于核心序列串联重复数目不同，因而能够用PCR的方法扩增出不同长度的PCR产物，将扩增产物进行凝胶电泳，根据分离片段的大小决定基因型并计算等位基因频率。
SSR具有以下一些优点：(l)一般检测到的是一个单一的多等位基因位点；(2)微卫星呈共显性遗传，故可鉴别杂合子和纯合子；(3)所需DNA量少。
显然，在采用SSR技术分析微卫星DNA多态性时必须知道重复序列两端的DNA序列的信息。
如不能直接从DNA数据库查寻则首先必须对其进行测序。
1 微卫星DNA的构成及特点微卫星又称简单序列重复(Simple Se-quence Repeats，SSR)。
一般以1-6个碱基为核心序列，首尾相连组成的串联重复序列。
这种序列存在于几乎所有真核生物的基因组中，含量丰富，且呈随机均匀分布。
它们不仅大量分布于基因的间隔区和内含子中，而且还分布于基因的外显子和调控区(如启动子、增强子)，真核生物平均每50-150 kb就存在一个微卫星位点，如在人类基因组中每6 kb就有1个微卫星，禽类基因组中约89 kb出现1个微卫星。
微卫星DNA 数目巨大，人类基因组中约有5×104-1×105个(CA)n重复序列，重复次数一般为15-60次，重复单位相同，其长度一般小于200 bp，但也有的更长。
每个特定位点的微卫星DNA均由两部分构成：中间的核心区和外围的侧翼区。
论文综述微卫星分子标记筛选方法综述摘要：微卫星是一种短的串联重复序列(short tandem repeat, STR)或简单重复序列(simple sequence repeats, SSR)。
它作为一种重要的分子遗传标记，能较好地反映物种的遗传结构和遗传多样性变化，被广泛应用于实验动物的研究。
本文概述了获得和富集微卫星位点的常用方法。
最简便、最省时的方法是从从公共数据库（如Genbank、EMBL、EST数据库等）或已发表的文献中查找到微卫星位点，但只限于已经有序列数据发布的物种；第二种方法是种间转移扩增，即从相近物种的数据库中查找微卫星位点，或使用已有数据发表的遗传距离相近物种的微卫星标记。
第三种方法是从基因组DNA中筛选微卫星位点，其中用于富集微卫星的方法有引物法、磁珠杂交法、尼龙膜杂交法以及分子标记技术法。
关键词：微卫星；分子标记；实验动物微卫星（Microsatellite），又称为简单序列重复（Simple Sequence Repeat , SSR），短串联重复（Short Tandem Repeat STR），是以少数几个核苷酸（一般1～6个）为重复单位的串联重复DNA序列。
微卫星位点广泛分布于真核生物的基因组中[1]，在植物基因组中平均每33 Kb存在一个20 bp长的微卫星位点，而在哺乳动物中每6 Kb存在一个20 bp长的微卫星位点[2]。
并且SSR的重复次数不同和重复程度不同，使其呈现高度的多态性。
微卫星标记共显性的特点使它能够用于研究等位基因，区分二倍体（或多倍体）的纯合体或杂合体，这是AFLP、RAPD 等显性标记所无法做到的。
另外，微卫星的特异性引物扩增具有良好的重复性和保真性，方便各实验室间的交流。
目前，微卫星标记已被广泛应用到基因连锁与遗传图谱构建、遗传多样性研究、谱系和发育研究、疾病检测以及品种鉴定、亲本分析与个体、纯系检验上。
随着微卫星标记在图谱上的丰富,将显现出更大的优势。
1．进行酶切用Vs pⅠ对四种鱼（GC、GS、NL和ZZ）基因组DNA（需基因组DNA浓度较高）进行酶切。
反应体系为：ddH2O 15µLVs pⅠbuffer 2µLVs pⅠ酶1µLDNA 2µL总体积20µL酶切在37℃反应3～4h即可，但是为了提高酶切效率可切4～6h。
PCR反应程序为：94℃ 5min，（94℃ 1min，53℃ 1min，72℃ 1min）×30，72℃ 10min，4℃ hold。
Vs pⅠ酶即（AseⅠ酶）：酶切识别位点为：5’A T↓T A A T 3’5’T A A T↑T A 3’AseⅠ酶的接头为：A1：5’CTC GTA GAC TGC GTA CC 3’A2：5’TAG GTA CGC AGT C 3’AseⅠ酶用的预扩增产物为：A3：5’CTC GTA GAC TGC GTA CCT AAT 3’2．接头制备用10µL A1（200µM）和10µL A2（200µM）混合，94℃ 3min后室温放置30min。
3．酶切片段与接头连接接头为A1和A2制备的接头，命名为AE。
连接反应体系如下：ddH2O 5µLT4 ligation酶0.5µLT4 buffer4µL酶切产物20µLA TP（10mM）0.3µLAE 1µL总体积30.8µL上述混合体系在16℃连接过夜。
10h左右。
4．连接产物PCR扩增对连接产物进行PCR扩增，每个样本做4管。
扩增引物为A3。
反应体系如下：ddH2O 14µL10×buffer 2.5µLMg2＋2µLdNTPs（10mM）0.5µLA3 1µLDNA（连接产物）5µLTaqE（2.5U/µL）0.2µL总体积25.2µLPCR反应程序为：（94℃ 30sec，56℃ 1min，72℃ 1min）×20，72℃ 10min，4℃ hold。
微卫星位点获取方法的研究进展微卫星位点获取方法是一种基因分型和遗传分析的重要手段，它可以通过测定微卫星位点的多态性来研究个体间的遗传差异和进化关系。
研究者们一直致力于发展更加高效、准确和便捷的微卫星位点获取方法。
本文将介绍微卫星位点获取方法的研究进展，并分析不同方法的优劣势。
传统的微卫星位点获取方法主要依赖于聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide Gel Electrophoresis, ）或琼脂糖凝胶电泳（Agarose Gel Electrophoresis）技术。
这些方法需要进行反应体系的优化和样品处理的多个步骤，操作繁琐且费时。
此外，这些方法对于微卫星序列扩增反应的选择性和敏感性有一定的限制，导致了低位点数目和较大的测定误差。
近年来，随着高通量测序技术的发展，研究者们开始采用下一代测序（Next Generation Sequencing, NGS）平台进行微卫星位点的获取和分型。
这些方法不仅可以获得更多的位点信息，还可以提高测定精度和准确性。
NGS方法的主要优势在于其高通量性和多样性，可以同时对多个样品进行测定，并且可以对微弱突变进行敏感检测。
其中，常用的NGS方法包括基因组重测序（Whole Genome Sequencing, WGS）、基因组库构建和目标区域测序（Targeted Re-Sequencing）等。
此外，研究者们还开发了一些基于多聚酶链反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）的位点获取方法，如多重微卫星分型法（Multiplex PCR）和简化微卫星-PCR方法（Simplified Microsatellite-PCR, SMP）。
这些方法通过引入多个引物或优化反应体系，提高了微卫星位点的扩增效率和选择性，并减少了操作的复杂性。
此外，通过引入荧光标记和电泳分离等技术，可以实现高通量的微卫星位点分型。
除了上述方法外，近年来还涌现了一些新的位点获取技术，如基于DNA芯片（DNA microarray）的方法和全基因组关联分析（Genome-Wide Association Study, GWAS）。
中国地鼠微卫星DNA引物的设计及筛选宋国华;耿佳宁;贾若愚;岳文斌;刘田福;胡松年【摘要】本研究旨在筛选中国地鼠微卫星位点,为中国地鼠遗传分析提供遗传标记.根据建立的中国地鼠微卫星富集文库,对筛选的含微卫星DNA序列的克隆应用引物设计软件Primer 3.0设计引物135对,选择合成11对理论上易出现影子带的引物,用20个中国地鼠个体对这些引物进行了评估.结果显示,11对引物均能扩增出谱带,这11条带的平均多态信息含量(PIC)为0.4195,平均观察杂合度(Ho)为0.3895,平均期望杂合度(He)为0.4565,每个位点的平均等位基因数为5.818.筛选出的微卫星位点均可用于中国地鼠种群遗传结构分析,这将为中国地鼠品种选育、种系评估提供更多的微卫星遗传标记信息.%The objectives of the present study were to screen new microsatellite loci in Chinese hamster to develop genetic markers for genetic analysis. A library of partial small size fractionated genomic DNA was constructed with the Chinese hamster. 135 pairs of primers were designed with the software Primer 3. 0 for rnicrosatellites positive clones obtained. 11 pairs primers that the stutter bands easily in theory were synthesized and 20 samples were tested with them. The results showed 10 of the 11 loci were found to be polymorphic,and PIC, the mean observed heterozygosities (Ho) , the mean expected heterozy-gosities( He) were 0. 4195, 0. 3895 and 0. 4565, respectively. The microsatellite markers would be useful for further studying on accessions identification and breeding of Chinese hamster,which would provide some evaluable tools for marker-assisted selection breeding and gene mapping in Chinese hamster.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2012(039)012【总页数】5页(P128-132)【关键词】中国地鼠;微卫星;基因组文库【作者】宋国华;耿佳宁;贾若愚;岳文斌;刘田福;胡松年【作者单位】山西医科大学实验动物中心,山西太原030001;山西农业大学动物科技学院,山西太谷030801;中国科学院北京基因组研究所,北京 100029;中国科学院北京基因组研究所,北京 100029;山西农业大学动物科技学院,山西太谷030801;山西医科大学实验动物中心,山西太原030001;中国科学院北京基因组研究所,北京100029【正文语种】中文【中图分类】S813.3微卫星DNA，又称为简单序列重复(SSR)或短串联重复序列(STR)，广泛存在于真核生物基因组中，每个简单重复DNA片段中一般重复单位仅1～6个碱基，重复次数为10～20次，动物体中最为常见的重复单位是双核苷酸(CA/GT)n。
论文综述微卫星分子标记筛选方法综述摘要：微卫星是一种短的串联重复序列(short tandem repeat, STR)或简单重复序列(simple sequence repeats, SSR)。
它作为一种重要的分子遗传标记，能较好地反映物种的遗传结构和遗传多样性变化，被广泛应用于实验动物的研究。
本文概述了获得和富集微卫星位点的常用方法。
最简便、最省时的方法是从从公共数据库（如Genbank、EMBL、EST数据库等）或已发表的文献中查找到微卫星位点，但只限于已经有序列数据发布的物种；第二种方法是种间转移扩增，即从相近物种的数据库中查找微卫星位点，或使用已有数据发表的遗传距离相近物种的微卫星标记。
第三种方法是从基因组DNA中筛选微卫星位点，其中用于富集微卫星的方法有引物法、磁珠杂交法、尼龙膜杂交法以及分子标记技术法。
关键词：微卫星；分子标记；实验动物微卫星（Microsatellite），又称为简单序列重复（Simple Sequence Repeat , SSR），短串联重复（Short Tandem Repeat STR），是以少数几个核苷酸（一般1～6个）为重复单位的串联重复DNA序列。
微卫星位点广泛分布于真核生物的基因组中[1]，在植物基因组中平均每33 Kb存在一个20 bp长的微卫星位点，而在哺乳动物中每6 Kb存在一个20 bp长的微卫星位点[2]。
并且SSR的重复次数不同和重复程度不同，使其呈现高度的多态性。
微卫星标记共显性的特点使它能够用于研究等位基因，区分二倍体（或多倍体）的纯合体或杂合体，这是AFLP、RAPD 等显性标记所无法做到的。
另外，微卫星的特异性引物扩增具有良好的重复性和保真性，方便各实验室间的交流。
目前，微卫星标记已被广泛应用到基因连锁与遗传图谱构建、遗传多样性研究、谱系和发育研究、疾病检测以及品种鉴定、亲本分析与个体、纯系检验上。
随着微卫星标记在图谱上的丰富,将显现出更大的优势。
但微卫星分析中引物的获得需要预先获知核酸序列,其广泛应用受限于从特定的物种中分离微卫星位点的难度和花费。
微卫星标记分离最大的困难是引物的获得。
同RAPD、AFLP 等遗传标记不同，微卫星研究首先需要获知位点的序列信息，以便从重复序列两端侧翼的保守序列中设计引物。
因而微卫星引物的开发是应用该技术的关键。
目前已知微卫星位点的物种很有限，这是因为微卫星位点的获得需经过克隆、杂交筛选、测序等步骤，因此需花费一定的人力、金钱，这限制了微卫星标记的大量使用。
但近年来发展起来的各种微卫星位点富集技术已在一定程度上解决了这个问题。
已有的最常用的获得微卫星位点的方法包括：1.从公共数据库中查找微卫星位点；2.遗传距离相近物种间引物转移扩增；3.从基因组DNA中筛选微卫星位点。
其中，最方便、最经济的方法就是从已发表的文献中获得微卫星引物，但该法在使用对象上，只限于已有引物开发出的物种，而且引物的数量不会有所增加，只能停留在原有基础上。
对于近缘种引物的应用，其适用范围究竟有多大；原物种的微卫星基因座在其他物种间转移扩增时，其多态性如何。
这些问题使得在不同物种间共用微卫星引物时，盲目性较大，可指导操作的理论依据不足。
最好的途径就是从基因组DNA中筛选微卫星位点并进行引物的开发。
1 从数据库中查找微卫星位点在上述三种方法中,最简便最省时的就是从公共数据库或已发表的文献中查找到微卫星位点。
许多微卫星研究的出发点都是公共数据库，比如从EMBL、Genbank或EST数据库中查找微卫星位点。
从这些数据库中，可通过电子查询方式方便地获得所需要的序列或寻找已存在的微卫星引物。
研究者对大量序列进行处理，利用Clustal W等程序，根据相似性程度，剔除冗余的EST，再剔除过短的序列（小于100bp）和过长的序列（大于1000bp），再利用SSRHunter等软件搜索获得含有微卫星的序列，并根据其侧翼序列设计引物。
何蔚[3]等选用前人分离得到的42对大熊猫微卫星引物，分别用圈养大熊猫的血液DNA和野生大熊猫的粪便DNA对其进行PCR扩增，结果表明不同标记的多态性差异较大，并筛选出13对能较好地应用于大熊猫遗传多样性研究的微卫星引物。
匡刚桥[4]等利用生物信息学方法从公开发表的鳜鱼GenBank数据库中寻找多态信息含量丰富的微卫星位点中共搜索到304条鳜鱼核酸序列，经计算机筛选和人工选择, 最终获得22 条含微卫星重复单元的序列，利用SSRHunter软件在此22条含有微卫星的序列中发现30个微卫星位点，设计出17对引物，其余位点两端序列短无法设计引物。
其中13对引物扩增条带清晰，经过多态性分析，最终筛选获得6对多态性微卫星引物。
徐玲玲[5]等从资料和GenBank中选取扩增效果好、等位基因多、均匀分布于小型猪18条常染色体和X染色体上的100个微卫星位点合成引物，对封闭群小型猪基因组进行PCR扩增及条件优化，筛选出32个分布于不同染色体且等位基因多的微卫星位点。
近年来随着数据库中EST序列的增加，通过数据库搜寻法获得EST微卫星位点的报道越来越多。
在此基础上进行SSR引物开发也就成了一种既经济又有效的方法。
许新[6]等从杂色鲍cDNA文库中用SSRHunter软件搜索获得173个重复序列，从中设计93对引物，有78对可以扩增，占合成总引物的83.9%，用深圳、汕尾等3个群体中挑选出多态性引物19对，多态性微卫星比例24.36%。
石耀华[7]等从马氏珠母贝cDNA文库查找到了268个重复序列，含微卫星的EST数占EST总数的3.48%，设计151对微卫星引物，有130对可以扩增，占合成引物总数的86.09%，其中多态性引物45对，占微卫星总数的34.6%。
EST微卫星位于编码区，由于基因序列的保守性，EST微卫星序列比从基因组中筛选的微卫星多态性低。
Eujayl[8]比较了小麦EST的微卫星和基因组微卫星多态性，结果发现基因组微卫星多态性（53%）远高于EST微卫星（25%）。
从数据库中查找微卫星最大的缺点是只限于已经有序列数据发布的物种。
一个替代方法是从相近的物种数据库中查找微卫星位点，或使用已发表的遗传距离相近物种的微卫星标记。
2 近缘物种交叉扩增获得微卫星引物由于微卫星重复序列和包含引物位点的侧翼序列在物种间具有保守性，所以某一个物种的微卫星引物可以在其相近的物种中使用，用来检测相近物种同源位点的多态性。
这样就大大地减少了检测微卫星位点的工作量。
微卫星在近缘种之间的通用性已有研究,但在属间应用还不多。
根据M. Rossetto[9]对近年来发表文献的总结，微卫星位点可在物种间扩增，其多态性也相当高。
Zucoloto[10]等利用密西西比鳄和宽吻凯门鳄的微卫星在其他3种鳄鱼中进行扩增，扩增率均在85%以上。
Küpper[11]等使用的环颈鸻微卫星成功地在4种鸻科鸟类中获得扩增，平均扩增率为75%。
蔡清秀[12]等从从非洲象31个微卫星位点和5个已知亚洲象微卫星位点中筛选出14个勐养亚洲象的微卫星位点，其中9个多态位点能在185份粪便样品DNA中稳定扩增。
孙涛[13]等利用138条人类微卫星引物在黑叶猴中进行筛选，得到了23个具有多态性的微卫星位点。
其中有7个位点偏离Hardy-Weinberg 平衡，9个位点存在无效等位基因现象，但是各位点之间均未检测到连锁不平衡现象，这些位点将在黑叶猴种群遗传结构的研究中发挥重要作用。
洪艳云[14]等选用10对非洲糜羚微卫星引物和10对绵羊微卫星引物作为筛选普氏原羚基因组DNA微卫星位点的引物，结果发现20对引物中有8对引物在普氏原羚基因组DNA中扩增出了多态性位点。
谭元卿[15]等利用小鼠微卫星位点引物536对，对长爪沙鼠基因组DNA扩增出了313个阳性条带，经测序分析确定130个长爪沙鼠的微卫星位点，与小鼠同源性为24.3%。
引物跨物种共用的有效程度除与其亲缘关系的远近有关外。
Primmer[16]等对大量鸟类微卫星交叉扩增研究的数据进行总结后提出，交叉扩增中微卫星在来源物种中的完全重复单元数目(perfect repeat units)与交叉扩增所获得的同源微卫星位点的多态性呈正相关。
微卫星位点的重复单元数目越多，其多态性也就越高，这表明微卫星位点的高重复单元数目在其近缘物种仍有所保持。
这意味着即使由于较远的亲缘关系使物种间交叉扩增率较低，具有较高重复单元数目的原始微卫星位点仍有可能获得有价值的扩增产物。
值得注意的是，仅从产物片断大小和变化上不是总能很好地确定微卫星的存在，通过改变扩增条件用微卫星引物在物种间扩增得到产物后，仍需要通过杂交、测序等方法确定所扩增出的条带就是所期望的产物。
3 从基因组DNA中筛选微卫星位点对于无法从上面两种方法获得微卫星引物的物种，可以从基因组DNA中筛选微卫星位点。
绝大多数微卫星位点是从100-1000 bp的小插入片段基因组文库中通过寡核苷酸探针杂交获得的。
标准的分离微卫星位点的方法有如下步骤：①提取基因组DNA；②用限制性内切酶将基因组DNA切割成小片段；③凝胶电泳,回收大小100-1000 bp的片段；④将回收片段克隆，使用标记探针进行杂交；⑤筛选出含有重复序列的克隆；⑥测序证实重复序列片段的存在；⑦根据重复序列片段两端保守序列设计引物，进行PCR扩增,检验引物的有效性；⑧对小量样本进行预试验,挑选出重复性好，具多态性的微卫星位点。
按以上步骤，Srikwan[17]和Munshi-South[18]利用尼龙膜菌落原位杂交法分离出6个泰国树鼩(Tupaia glis)和5个马来西亚树鼩（Tupaia spp.）的微卫星位点。
魏东旺[19]等从鲤鱼基因组DNA中筛选微卫星位点，用探针(CA)n 对质粒pGEM-3Zf(+)构建的基因文库进行杂交筛选，从2000个白色菌落中共获得阳性克隆45个，其中32 个克隆中共得到22个微卫星。
从基因组文库中分离微卫星位点的传统方法在微卫星富集程度上效率很低，为了提高微卫星位点分离的效率，在文库构建前或构建后发展了一些富集方法。
3.1 杂交法富集微卫星杂交富集法根据所使用的介质不同可分为三种：磁珠法、尼龙膜法和亲和素超滤离心法。
3.1.1 磁珠富集法磁珠富集法的基本原理是用生物素标记重复序列寡核酸探针并与基因组DNA酶切片段杂交，再利用生物素与亲和性强的特性，使两者相互作用的稳定性和强度即使在变性、杂交、洗脱等操作过程中也不产生分离，从而完成对重复序列目标片段的富集，建立微卫星富集文库。
经过磁珠富集后使获得的具有重复序列片段的效率大幅度提高。
目前，链亲和素包埋的磁珠已被广泛应用到各种微卫星富集方法中。
磁珠杂交的微卫星富集过程是在文库构建前，一般步骤如下：限制性内切酶酶切基因组DNA，酶切后的DNA片段≤1000 bp；接头连接酶切DNA片段；酶切位点和接头作为引物结合位点，进行扩增，增加DNA片段量；生物素标记的互补微卫星寡核酸探针同PCR扩增产物杂交；链霉素包埋的磁珠杂交筛选目的片段；目的片段洗脱、扩增、纯化、克隆；阳性克隆进行DNA测序，设计引物进行PCR 分析；多态性鉴定。
