高效液相色谱详解-郝建涛

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高效液相色谱法测定律复康胶囊中人参皂苷Re和Rg1的含量

虫垦塑垡荭堑瘗旦垫！Ｑ生！旦笠垒鲞箜！塑垦塾垫』丛鲤旦型ｇ垒ＰＰ！：里！垫！Ｑ：！堂：！：盟！：！高效液相色谱法测定律复康胶囊中人参皂苷Ｒｅ和Ｒｇｌ的含量陈舒茵申洪超黎瑞汝韩丽华王振涛梁生旺【摘要】目的建立律复康胶囊中红参人参皂苷Ｒｇｌ与Ｒｅ的含量测定方法。

方法采用ＨＰＬＣ法本品红参中人参皂苷Ｒｇｌ、人参皂苷Ｒｅ。

Ｄｉａｍｏｎｓｉｌｃ。

柱色谱柱，流动相为乙腈旬．０５％磷酸水（２１．５：７９．５），检测波长２０３ａｍ。

结果人参皂苷Ｒｇｌ、Ｒｅ在范围内呈良好线性，分别为２．３３—２０．９５斗ｇ（ｒ＝０．９９９４Ｕ＝５），０．９７２～８．７４８ｐ．ｇ（ｒ＝０．９９９２，ｎ＝５），平均回收率分别为１００．２％（ＲＳＤ＝１．９％）、９７．１％（ＲＳＤ＝０．８％）。

结论ＨＰＬＣ方法简便、准确，精密度高、重现性好，适用于含人参皂苷Ｒｇｌ、Ｒｅ成分产品含量的测定。

【关键词】律复康胶囊人参皂苷Ｒｇｌ；人参皂苷Ｒｅ；高效液相色谱法ＡｎａｌｙｓｉｓｏｆｐａｎａｘｇｉｎｓｅｎｇＣ．九ＭｅｙｉｎＬｖｆｈｋ，ａｎｇＣａｐｓｕｌｅｓＣＨＥＮＳｈｕ—ｔｉｎ，ＳＨＥＮＨｏｎｇ－ｃｈａｏ，ＨＡｌＬｉ—ｈｕａ，ｅｔａ１．ＧｕａｎｇｄｏｎｇＰｈａｒｍｏｚｚｕｔｉｃａｌｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｎａｎｇｚｈｏｕ５１０００６；ｌ－ｌｅＮａｎＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＴＣＭ，ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ，４５０００８，Ｃｈｉｎａ【Ａｂｓｔｒａｃｔ】ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏａｎＭｙｚｅｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆｐａｎａｘｓａｐｏｎｉｎＲｇｌｐａｎａ】【ｓａｐｏｍｎＲｅｉｎＬｖｆｕｋａｎｇＣａｐ—ｓｕｌｅｓ．ＭｅｔｈｏｄｓＨＰＬＣＷａＳｕｓｅｄｔｏａｎａｌｙｚｅｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｓ０ｆｐａｎａｘｓａｐｏｎｉｎＲ９１ｐａｎａｘｓａｐｏｎｉｎＲｅｉｎＬｖｆｕｋａｎｇＣａｐｓｕｌｅｓ．ＴｈｅＤｉａｍｏｎｓｉｌＣ１８ｃｏ｜ｕｔａｈ（５ｐｍ，２５０ｘ４．６咖）Ｗａｇｕｓｅｄ．Ｔｈｅｍｏｂｉｌｅｐｈａｓｅｃｏｎｓｉｓｔｅｄｏｆａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ一０．０５％ｏｒｔｈｏｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃｗａｔｅｒ（２１。

反相高效液相色谱法测定葛根素和大豆苷元

反相高效液相色谱法测定葛根素和大豆苷元
何建涛;石志红;赵美萍;常文保
【期刊名称】《分析化学》
【年(卷),期】2004(32)4
【摘要】利用反相高效液相色谱法,配以二极管阵列检测器测定了心可舒片中的葛根素和大豆苷元,建立了一种心可舒片的质量控制方法.色谱柱为C18柱,流动相为乙腈和0.02 mol/L磷酸二氢钾,柱温为25℃,流速为0.8 mL/min,梯度洗脱,检测波长为250 nm.葛根素和大豆苷元的平均回收率分别为97.3%和101.4%;RSD为0.6%和1.9%.
【总页数】3页(P519-521)
【作者】何建涛;石志红;赵美萍;常文保
【作者单位】北京大学化学与分子工程学院,北京,100871;北京大学化学与分子工程学院,北京,100871;北京大学化学与分子工程学院,北京,100871;北京大学化学与分子工程学院,北京,100871
【正文语种】中文
【中图分类】R972
【相关文献】
1.HPLC法同时测定葛根中葛根素·大豆苷及大豆苷元含量 [J], 魏锐;王建南;谢朝阳;何侃;郑群怡
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张薇;张宇霞;张晗
3.离子液体分散液相微萃取-HPLC测定葛根中葛根素、大豆苷和大豆苷元含量 [J], 彭贵龙;周光明;秦红英;陈军华
4.HPLC同时测定六味葛蓝降脂片中葛根素、大豆苷元、橙黄决明素和大黄酚的含量 [J], 肖明;周雅琪;李芳婵;蒋林;魏博伟
5.HPLC同时测定鸢都感冒颗粒中新绿原酸、绿原酸、葛根素和大豆苷元的含量[J], 丁力; 魏慧; 高扬
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第五章高效液相色谱法6hppt课件-PPT精品文档

四、检测器高效液相色谱仪中的检测器是三大关键部件 (高压输液泵、色谱柱、检测器)之一，主要用于检测经色谱柱分离后的组分浓度的变化，并由记录仪绘出谱图来进行定性、定量分析。一个理想的液相色谱检测器应具备以下特征：灵敏度高；对所有的溶质都有快速响应；响应对流动相流量和温度变化都不敏感；不引起柱外谱带扩展；线性范围宽；适用的范围广。可惜至今没有一种检测器能完全具备这些特征。常用的检测器为紫外吸收检测器 (UVD)、折光指数检测器 (RID)、电导检测器(ECD)和荧光检测器(FD)。在高效液相色谱技术发展中，检测器至今是一个薄弱环节，它没有相当于气相色谱中使用的热导池检测器和氢火焰离子化检测器那样的即通用又灵敏的检测器。但近几年出现的蒸发激光散射检测器(ELSD)有望成为高效液相色谱全新的通用灵敏的质量检测器。

第四节高效液相色谱仪简介高效液相色谱仪可分为分析型和制备型，虽然它们的性能各异、应用范围不同，但其基本组件是相似的，对分析型商品仪器可有如下两种组合方式： ①完全紧凑的整体系统。其死体积小，灵敏度高，体现高效液相色谱仪总体实用的特点。 ②独立部件的组合系统。其灵活性高，可根据不同的分析目的，组装成不同的联接方式。现在用微处理机控制的高效液相色谱仪，其自动化程度很高，即能控制仪器的操作参数 ( 如溶剂梯度洗脱、流动相流量、柱温、自动进样、洗脱液收集、检测器功能等 ) ，又能对获得的色谱图进行收缩、放大、叠加，以及对保留数据和峰高、峰面积进行处理等，为色谱分析工作者提供了高效率、功能齐全的分析工具。

（二）柱连接方式柱接头通过过滤片与色谱柱管连接，在色谱柱管的上下两端要安装过滤片，过滤片一般用多孔不锈钢烧结材料。此烧结片上的孔径小于填料颗粒直径，却可让流动相顺利通过，并可阻挡流动相中的极小固体颗粒，柱出、入口的连接管的死体积亦应愈小愈好，一般常用窄孔 (内径0.13mm)的厚壁(1.5— 2.0mm)不锈钢管，以减少柱外死体积。所用柱接头，联接螺帽，密封圈及色谱柱接头皆为不锈钢材料。

高效液相色谱法测定保健食品纳豆红曲茶多酚软胶囊中洛伐他汀的方法

高效液相色谱法测定保健食品纳豆红曲茶多酚软胶囊中洛伐他汀的方法季加才，孟凡荣（山东润达检测技术有限公司，山东潍坊 261000）摘要：目的：本文建立高效液相色谱法测定保健食品中（以纳豆红曲茶多酚软胶囊为例）洛伐他汀的方法。

方法：样品经乙腈提取后，用液相色谱C18柱分离，二元流动相洗脱，238 nm波长下紫外检测器检测，测定精密度、准确度。

结果：洛伐他汀在10～200 μg·mL-1线性关系良好，相关系数＞0.999 9，相对标准偏差为0.62%。

当加标浓度为0.5 mg时，回收率为98.8%；当加标浓度为1.0 mg时，回收率为102.7%；当加标浓度为1.5 mg时，回收率为99.7%。

结论：本方法检测灵敏度高、操作简单、定性定量准确、针对性强，为纳豆红曲茶多酚软胶囊质量控制和深度开发提供了科学依据。

关键词：高效液相色谱法；洛伐他汀；纳豆红曲茶多酚软胶囊Determination of Lovastatin in Health Food Natto Monascus Tea Polyphenol Soft Capsules by High Performance LiquidChromatographyJI Jiacai, MENG Fanrong(Shandong Runda Testing Technology Co., Ltd., Weifang 261000, China) Abstract: Objective: To establish a method for the determination of lovastatin in health food by high performance liquid chromatography. Method: After being extracted with acetonitrile, the sample was separated using a liquid chromatography C18 column, eluted with a binary mobile phase, and detected with a UV detector at a wavelength of 238 nm for precision and accuracy. Result: The linear range of lovastatin was 10～200 μg·mL-1, the correlation coeﬃcient was more than 0.999 9, and the relative standard deviation was 0.62%. When the concentration was 0.5 mg, the recovery rate was 98.8%. When the concentration was 1.0 mg, the recovery rate was 102.7%. When the concentration was 1.5 mg, the recovery rate was 99.7%. Conclusion : This method has high sensitivity, simple operation, accurate qualitative and quantitative, and strong pertinence. It provides a scientiﬁc basis for the quality control and in-depth development of natto monascus tea polyphenol soft capsule.Keywords: high performance liquid chromatography; lovastatin; natto monascus tea polyphenol soft capsules洛伐他汀由红曲霉在其生长后期产生，能有效降低血浆胆固醇[1]。

高效液相色谱分析原理及流程

高效液相色谱分析原理及流程高效液相色谱以经典的液相色谱为基础，是以高压下的液体为流动相的色谱过程。

通常所说的柱层析、薄层层析或纸层析就是经典的液相色谱。

所用的固定相为大于100um的吸附剂(硅胶、氧化铝等)。

这种传统的液相色谱所用的固定相粒度大，传质扩散慢，因而柱效低，分离能力差，只能进行简单混合物的分离。

而高效液相所用的固定相粒度小(5um-10um)、传质快、柱效高。

高效液相色谱法(HPLC)是20世纪60年代后期发展起来的一种分析方法。

近年来，在保健食品功效成分、营养强化剂、维生素类、蛋白质的分离测定等应用广泛。

世界上约有80%的有机化合物可以用HPLC来分析测定。

高效液相色谱分析原理(一)高效液相色谱分析的流程由泵将储液瓶中的溶剂吸入色谱系统，然后输出，经流量与压力测量之后，导入进样器。

被测物由进样器注入，并随流动相通过色谱柱，在柱上进行分离后进入检测器，检测信号由数据处理设备采集与处理，并记录色谱图。

废液流入废液瓶。

遇到复杂的混合物分离(极性范围比较宽)还可用梯度控制器作梯度洗脱。

这和气相色谱的程序升温类似，不同的是气相色谱改变温度，而HPLC改变的是流动相极性，使样品各组分在最佳条件下得以分离。

(二)高效液相色谱的分离过程同其他色谱过程一样，HPLC也是溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。

它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分离。

开始样品加在柱头上，假设样品中含有3个组分，A、B和C，随流动相一起进入色谱柱，开始在固定相和流动相之间进行分配。

分配系数小的组分A不易被固定相阻留，较早地流出色谱柱。

分配系数大的组分C在固定相上滞留时间长，较晚流出色谱柱。

组分B的分配系数介于A，C之间，第二个流出色谱柱。

若一个含有多个组分的混合物进入系统，则混合物中各组分按其在两相间分配系数的不同先后流出色谱柱，达到分离之目的。

不同组分在色谱过程中的分离情况，首先取决于各组分在两相间的分配系数、吸附能力、亲和力等是否有差异，这是热力学平衡问题，也是分离的首要条件。

高效液相色谱法测定小儿清热口服液中绿原酸的含量

数所制备出的不含金银花的小儿清热口服液，并以这一溶液为样品，采用与对照品溶液制备相同的方法制备出阴性液。２．５药材液的配制同样需要进行精密称取，并将所称取的０．１５ｇ药材放置到到具塞锥形瓶中，注：样品中含量均为２．１３ｍｇ，ｎ＝３加入５０ｍＬ浓度为５０％的甲醇溶液之后将瓶塞塞紧，然后称量其重量，并对其进行表２绿原酸含量测定结果时长为半个小时的超声处理。然后待溶液冷却后，再称量其重量，并用５０％甲醇将所损失的重量补充回来，并摇匀。２．６标准曲线的绘制精密量取绿原酸对照品２号溶液２，４，５，６，８ｌ进样测定，以绿原关联。在本试验中，最初使用的流动相：酸进样量（ｇ）为横坐标，峰面积积甲醇一水一乙腈一冰醋酸的比例为３：９７：分值为纵坐标绘图。其回归方程为：１２：３，在测定期间发现在此流动相下样Ｙ＝７８１４８３．９０，Ｘ一１５３１６．８７，ｒ＝０．９９９９，品的分离效果不理想，很容易造成绿原酸绿原酸标准品在０．２０１ — ０．８０７ｇ与峰面积峰拖尾问题，为此我们对流动相进行了一有良好的线性关系。定的变动，将乙腈换位了四氢呋喃。在经２．７精密度试验过调整后，样品的分离达到了理想效果。按照测定方法重复进样５次，绿原并为之后的绿原酸含量测定提供了良好条酸峰面积积分值相对标准偏差ＲＳＤ＝件。在对绿原酸进行含量测定时采用高效１．３３％。液相色谱法不但操作简便，且检测效果２．８重现性试验好，能够使绿原酸和其他成分实现基线分按照测定方法重复测定５份样品，绿离，保证了检测结果的准确性。原酸含量的相对标准偏差ＲＳＤ＝０．４％。事实上，绿原酸含量检测不但对小２．９加样回收率试验儿清热口服液的生产质量保证有很大意精密量取５份样品（批号：１１０６１８）义，其在其他请热类药物的生产中也往往各０．５ｍＬ，置５０ｍＬ，容量瓶中，精密吸需要进行要有效检测。因为绿原酸本身存取各样品液，分别精密加入绿原酸对照在于金银花中，所以只要药物成分中有金品２号溶液０．９０ｍＬ、１．０９ｍＬ、１．ＯＯｍＬ、银花都会有绿原酸，绿原酸的杀菌功能较１．０４ｍＬ、１．００ｍＬ，用５０％甲醇定容至刻为显著，在多种感冒清热药物中发挥积极度，摇匀即得。按上述色谱条件测定，以作用，为此必须要确保这类药物中绿原酸下式计算回收率，结果如表１结果表明，的含量符合相关要求。而高效液相色谱法本方法具有良好的回收率。完全可以作为一种检测方法应用在这些药２．１０样品测定物的绿原酸含量检测中。精密量取样品液１０Ｌ进样，依照上参考文献述色谱条件进行含量测定，结果见表２。『１１崔岚，祝德秋，王晓珉，罗启剑，曹结语惠明．反相高效液相色谱法测定清炎颗粒由本实验可以得知，在对小儿清热中绿原酸的含量卟中国药房，２００４（０６）．口服液中的绿原酸含量进行测定时，采用『２１赵霞，杨丽．ＨＰＬＣ法测定双黄连颗粒高效液相色谱法是非常可行的。而其测定中绿原酸的含量［Ｉ１．中国药事，２０１２（０１）．效果与效率在很大程度上与流动相有较大

《高效液相色谱》 (2)幻灯片

液体固定相通过物理吸附固定于载体表面
键合固定相分配色谱(LSPC)
有机分子通过化学反应键合到载体表面
分配色谱–别离原理
不同组分在两相间分配系数不同
分配色谱固定相
固定相 --- 物理吸附（担体 + 固定液）
全多孔型担体薄壳型微珠担体
固定相 --- 化学键合
R --- 极性基团疏水基团离子交换基团
中分子局部进入多孔中，一般保存小分子完全进入多孔中，长时间保存。
排阻色谱固定相
1. 软凝胶：铰链葡萄糖的多孔聚合物，聚丙烯酰胺凝胶。（凝胶过滤色谱）
2. 半硬凝胶：聚苯乙烯珠（凝胶渗透色谱）
3. 高硬凝胶和玻璃：多孔玻璃或多孔硅球，经化学键合处理，不随压力及溶剂改变尺寸，（高效排阻色谱）
离子交换色谱
分离原理
各种离子根据它们与树脂上的交换
基团的交换能力的不同而得到分离。
固定相
固定相为离子交换树脂，流动相为无机酸或无机碱的水溶液。
分离对象离子或可离解的化合物
（无机离子、氨基酸、蛋白质等）
排阻色谱法
(凝胶色谱法)
分离原理
根大据分样子品不分能子进尺入寸多大孔小中分，离不被保存，随 Vm流出
是由极性固定相和非极性（或弱极性）流动相所组成的HPLC体系。其代表性的固定相是改性硅胶、氰基柱等，代表性的流动相是正己烷。吸附色谱也属正相HPLC。
反相HPLC（reversed phase HPLC）：
由非极性固定相和极性流动相所组成的液相色谱体系，与正相HPLC体系正好相反。其代表性的固定相是十八烷基键合硅胶(ODS柱），代表性的流动相是甲醇和乙腈。是当今液相色谱的最主要分离模式。
O S SO ii HC O S lO i C H S l i3 ) ( 2 R CO H SO i Si3 ) ( 2 R CH

高效液相色谱法测定皮炎宁酊中间苯二酚和水杨酸的含量

留时间为
苯酚的保留时间为
∀信噪
比为 Β 时苯酚的最低检出质量浓度为
Ξ 本文收稿日期
修回日期

期
郭兴杰等高效液相色谱法测定皮炎宁酊中间苯二酚和水杨酸的含量
Ù ∀ 的分解产物因未找到对照品无法鉴定和计算最低检测质量浓度∀ 样品中其它成分在检测波长下无吸收不干扰测定空白基质色谱图不加和与基线完全重合∀
均未见有二者同时测定的液相色谱法∀ 本文应用反
相
测定了皮炎宁酊中和和含量方法简
单可靠∀ 在选择的色谱条件下和可与其降解
产物及杂质完全分开∀
实验部分
仪器和试药
日立液相色谱仪可变紫外检测器
数据处理机∀
和对照品由沈阳市药品检验所提供皮炎
宁酊为市售品其它试剂均为分析纯∀
色谱条件
间苯二酚
∀
苯酚苯酚是中国药典规定的和原料药中需要
检查的杂质∀ 采用 ς 甲醇 Β ς 水
Β 作流
动相因和分离度太小故无法将其与上述杂质
分开∀ 增加流动相中水的体积分数二者分离度变
大但的色谱峰拖尾明显∀ 所以我们在流动相中
加入少量的乙酸可使两种主要成分和杂质得到很
好的分离见图 ∀ 由图可见的分解产物保
Λ 记录峰面积∀线性关系见表 ∀结果表明在
∗ Ù和在 ∗
Ù 范围内
线性关系良好∀ 信噪比为 Β 时两组分的最低检
出质量浓度均为 Ù ∀
表线性关系
Τ αβλε 组分
间苯二酚 Χ
Λινεαρ ρελατιονσηι 回归方程

≅
≅
ρ Α

高效液相色谱法测定盐酸特拉唑嗪及其胶囊中的有关物质

高效液相色谱法测定盐酸特拉唑嗪及其胶囊中的有关物质郝万福
【期刊名称】《中国卫生产业》
【年(卷),期】2011(8)09Z
【摘要】目的建立高效液相色谱法测定盐酸特拉唑嗪及其胶囊中的有关物质。

方法采用色谱柱：Dia—monsilC18色谱柱（15mm×4．6mm 5um）；流动相：甲醇-水-冰醋酸-三乙胺（330：670：10：0．3）；检测波长：246mm；流速：1．0mL／min。

结果原料药可检测出5个杂质峰，胶囊剂可检测出6个杂质峰。

结论本法简便，准确，灵敏度高，可用于盐酸特拉唑嗪及其胶囊剂中的有关物质的测定。

【总页数】1页(P9-9)
【作者】郝万福
【作者单位】内蒙古扎兰屯市医院,内蒙古扎兰屯162650
【正文语种】中文
【中图分类】R917.4
【相关文献】
1.高效液相色谱法测定盐酸特拉唑嗪及其胶囊中的有关物质
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3.高效液相色谱法测定维胺酯有关物质和胶囊中维胺酯的含量
4.高效液相色谱法与薄层色谱法测定盐酸特拉唑嗪片有关物质的比较
5.薄层色谱法测定盐酸特拉唑嗪胶囊中有关物质
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高效液相色谱法测定水中硝基苯和苯胺含量

AN
NB
80. 2 ±7. 3
73. 2 ±5. 8
102. 4 ±4. 1
102. 4 ±4. 1
98. 4 ±3. 8
99. 5 ±6. 4
90. 4 ±8. 3
91. 8 ±2. 4
104. 2 ±3. 6
105. 4 ±8. 1
97. 3 ±6. 2
95. 8 ±8. 1
91. 2 ±7. 3
峰宽 Peak width
(m in) 0. 294 0. 259
0. 218 0. 229 0. 189
0. 177
保留时间 Retention time
(m in) 8. 393 5. 034
3. 631 7. 198 2. 779
2. 124
NB 峰高 Peak height
30. 76 54. 44 78. 87 36. 50 91. 13 118. 9
M: 甲醇 (methanol) ; A: 乙腈 ( acetonitrile) ; T: 3. 85 g/L乙酸铵 ( ammonium acetate) 23 g/L乙酸 ( acetic acid) 。
峰宽 Peak width
(m in) 0. 513 0. 291
0. 201 0. 433 0. 173
0. 5 mL水样与 1. 5 mL乙腈混匀后过有机系滤膜进行测试 M ix 0. 5 mL samp le with 1. 5 mL methanol, filter through MM (O )
1. 0 mL水样与 1. 0 mL乙腈混匀后过有机系滤膜进行测试 M ix 1. 0 mL samp le with 1. 0 mL methanol, filter through MM (O )

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1、对色谱柱、仪器起到保护作用色谱柱：由于填料颗粒很细，色谱柱内腔很小，溶剂和样品中的细小颗粒会使色谱柱和毛细管容易堵塞。仪器：溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞和磨损，同时也会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞的磨损。 2、消除由于污染对分析结果的影响
3) 溶剂准备：脱气
目的
3、HPLC中的基本概念和术语
色谱图和峰参数

色谱图(chromatogram)--样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号-时间曲线，又称色谱流出曲线。基线(base line)--经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。噪音(noise)--基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。漂移(drift)--基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。

色谱峰(peak)--组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线上的突起部分。正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线（高斯Gauss曲线）。峰高(peak height，h)-峰的最高点至峰底的距离。峰宽（peak width，W)-峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。半峰宽（peak width at half-height，Wh/2)-峰高一半处的峰宽。峰面积(peak area，A)-峰与峰底所包围的面积。死时间(dead time，t0)--不保留组分的保留时间。即流动相（溶剂）通过色谱柱的时间。保留时间(retention time，tR)--从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时间。

注意：1：每张滤膜只能用一次。
பைடு நூலகம்
2：水相和有机相不要搞混。
2．流动相的配制
流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中(或长时间保留在柱中)。流动相具有一定惰性，与样品不产生化学反应流动相的黏度要尽量小分离效果好柱压低，延长液体泵的使用寿命

(可运用提高温度的方法降低流动相的黏度)
30%
梯度洗脱是 HPLC 的常用手段
梯度洗脱装置流动相中含有两种或两种以上不同极性的溶剂，在洗脱过程中连续或间断的改变流动相
的组成，以调节它的极性，使样品中每个组分
都有较高的分离度，从而实现各组分的圆满分
离，梯度洗脱可提高柱效，缩短分析时间，改
善检测器的灵敏度，它类似于气相色谱的程序升温技术。

-NH2、 -CN
其它 (手性柱，离子交换柱): 10%
柱温箱
控制温度，保证分析结果重
现性
升高温度，降低了流动相的
黏度，降低柱压，保证色谱系统的稳定性
升温对于反相 HPLC分离强疏水肽的影响 (B27)
室温 300C 400C
液相色谱柱: C18 色谱柱尺寸: 4.6 x 250 mm 5µ m
二、上机操作前，我们需要准备好什么？
如：样品怎么处理？流动相怎么选？仪器参数怎么设置？
1．样品的前处理

最好使用流动相溶解样品。使用预处理除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。使用0.45μm的过滤膜过滤除去微粒杂质。
样品准备
过滤样品，确保样品中不含固体颗粒
用流动相或比流动相弱的溶剂溶解样品
检测器简介（五）
◆ 电导检测器（ECD）原理：监测溶液的电导率变化的检测器。特点：选择性检测器、测量时要求恒温、对流动相的组成变化有明显响应、灵敏度低（10-3g）。适用于离子型化合物。
◆ 示差折光指数检测器（RID）原理：监测参比池和测量池中溶液的折射率之差来测量试样浓度的检测器。特点：通用性检测器，温变化要保持在±0.001℃、灵敏度低（10-6g）

滤膜类型：

聚四氟乙烯滤膜：适用于所有溶剂，酸和盐，并无任何可溶物。
醋酸纤维滤膜：不适用于有机溶剂，特别适用于水基溶液，推荐用于蛋白质和其相关样品。尼龙66滤膜：适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可用于强酸，70%乙醇、二氯甲烷、不适用于二甲基甲酰胺。再生纤维素滤膜：具有蛋白吸收低，同样适用水溶性样品和有机溶剂。
高效液相色谱（HPLC）
主讲：郝凤霞
能源化工重点实验室
目录

基础理论上机操作前的准备工作 Agillent 1100 的操作常见故障排除 HPLC在科研中的应用
一、基础理论
1、色谱柱的分离原理
溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。
3、打开电脑，等待TAP窗口出现
4、打开1100各模块开关
指示灯状态
每个部件接通电源后 LED灯显示绿色
荧光电化学示差折光
检测器
通用型
蒸发光散射质谱
药典中的液相检测器
检测器简介（一）
◆
紫外吸收检测器（UVD）
原理：用特定波长的紫外光照射样品池，通过检测透光率的变化来测定样品浓度的检测器。它具有波长固定，波长可变和光二极管阵列三种类型。
特点：选择性检测器、波长检测范围：190-800nm ；对流量和温度敏感性低、灵敏度较高（10-9g）；应用最广，对大部分有机化合物有响应；对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。定量基础：Lambert-Beer定律，A＝Kbc
进样量尽量小
样品完全溶解在流动相中
样品没有完全溶解
样品过滤头的类型：

30mm内径：适用于大进样量的过滤，由0.2μm和0.45μm两种规格材料有，纤维素，醋酸纤维，聚四氟乙烯。处理样品体积少于50μl。 13mm内径：适用于范围广的过滤，由0.2μm和0.45μm两种规格。 3mm内径：适用于小进样量的过滤，由0.2μm和0.45μm两种规格。处理样品体积为7μl。
检测器简介（二）
光电二极管阵列检测器
紫外检测器的重要进展；光电二极管阵列检测器： 1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。
2017/11/8
检测器简介（三）
荧光检测器（fluorescence detector）（FLD）原理：某些溶质在紫外光激发后能发射可见光（荧光）的性质检测。特点：选择性检测器、灵敏度高（10-12g）、对流量和温度敏感性低。对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应。
进样器样品引入系统色谱柱关键部分，在这里样品实现分离检测器对分离后的样品进行检测数据记录与处理装置

HPLC的系统组成
输液系统进样系统分离系统
数据分析系统
检测系统
数据处理系统
Agilent 1100 高效液相色谱仪
储液瓶
真空脱气机混合室
自动进样器
分离柱
VWD
手动进样
常用的脱气方法

氦气脱气法：利用液体中氦气的溶解度比空气低，连续吹氦脱气，效果较好，但成本高。加热回流法：效果较好，但操作复杂，且有毒性挥发污染。抽真空脱气法：易抽走有机相。超声脱气法：流动相放在超声波容器中，用超声波振荡1015min，此法效果最差。在线真空脱气法：Agilent1100LC真空脱机利用膜渗透技术，在线脱气，智能控制，无需额外操作，成本低，脱气效果明显优于以上几种方法，并适用于多元溶剂体系。
流动相使用前必须进行脱气处理，以除去其中溶解气体。以防止在洗脱过程中当流动相由色谱柱流至检测器时，因压力降低而产生气泡。气泡会增加基线的噪音，造成灵敏度下降，甚至无法分析。溶解的氧气还会导致样品中某些组份被氧化，柱中固定相发生降解而改变柱的分离性能。若用FLD，可能会造成荧光猝灭。
检测器简介（四）
◆ 蒸发光散射检测器（ELSD）
原理：通过检测光散射程度而测定溶质浓度的检测器。色谱柱后流出物在通向检测器途中，被高速载气（氮气）喷成雾状液滴，再进入蒸发漂移管中，流动相不断蒸发，含溶质的雾状液滴形成不挥发的微小颗粒，被载气载带通过检测器。在检测器中，光被散射的程度取决于溶质颗粒的大小与数量。特点：消除了溶剂的干扰，不受温度变化影响，灵敏度高，是通用型检测器。
5．记录时间

第一次测定时，应先将空白溶剂、对照品溶液及供试品溶液各进一针，并尽量收集较长时间的图谱（如30分钟以上），以便确定样品中被分析组分峰的位置、分离度及是否还有杂质峰在较长时间内才洗脱出来，确定是否会影响主峰的测定。
三、Agilent 1100 机器操作
1、检查流动相

Purge阀（清洗阀、排液阀）处于松开状态
流动相的洗脱方式洗脱方式
低压梯度
等度洗脱
高压梯度
等度洗脱
输液泵
进样器柱温箱色谱柱检测器
单一或混合溶剂
梯度洗脱
A 进样器 A泵
B 浓度
色谱柱
检测器
柱温箱
B
B泵
时间
等度洗脱
MeOH / H2O = 4 / 6
分析时间长
分离度差
MeOH / H2O = 8 / 2
梯度洗脱
95% MeOH 浓度
自动进样
六通阀进样演示
分离系统－色谱柱
功能：组分分离目标：分辨力强效率高
吸附剂－－－化学键和固定相色谱柱