高效液相色谱(HPLC)简介
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hplc高效液相色谱
hplc高效液相色谱HPLC高效液相色谱简介高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC），也被称为液相色谱法（Liquid Chromatography），是一种广泛应用于药物分析、环境监测、食品检测等领域的分离技术。
HPLC色谱技术通过物质在液体流动相和固定相之间的相互作用，实现对分子化合物的分离、检测和定量。
相对于传统的柱层析技术，HPLC具有分离效率高、分析灵敏度高、分析速度快等特点，被广泛应用于科学研究和工业生产。
HPLC的基本原理HPLC色谱技术是建立在分配系数理论的基础上。
它通过固定填料上溶解物质与流动相中溶解物质之间的分配与再分配，实现目标化合物在固定相中的分离。
HPLC色谱法的基本步骤包括：样品制备、装柱、选择流动相、进样、洗脱分离、检测及数据处理等。
HPLC的主要组成部分HPLC主要由一系列组成部分组成，包括：溶剂输送系统、无菌进样器、色谱柱、检测器和数据处理系统等。
其中，溶剂输送系统用于控制流动相的输送速率和压力，确保流动相以一定速率通过色谱柱；无菌进样器用来将样品进样并转送到色谱柱中；色谱柱是分离目标化合物的关键组成部分，根据所分离物质的化学性质和目标要求选择合适的色谱柱；检测器用来检测溶质的浓度，并将信号转换为电信号输出；数据处理系统用来处理和分析检测到的信号，得出结果。
HPLC的种类和应用领域根据不同的分离机制和柱填料，HPLC可以分为很多不同的类型，包括：反相色谱、离子交换色谱、分子筛色谱等。
反相色谱是最常用的一种HPLC技术，其应用领域非常广泛。
例如，在药物研究领域，HPLC被广泛应用于药物分析、药代动力学研究、质量控制等方面。
在环境监测领域，HPLC被用来检测土壤和水体中的有机污染物、重金属和农药等化学物质。
在食品安全检测领域，HPLC被用来检测食品中的添加剂、农药残留和重金属等有害物质。
HPLC的发展和进展自HPLC技术在20世纪60年代首次提出以来，随着科学技术的不断发展，HPLC技术也在不断进步和改进。
什么是高效液相色谱(HPLC)
什么是HPLC
（高效液相色谱）？
1
什么是超高效液相色谱（UPLC技术）？
• 2004年，液相色谱的仪器和 色谱柱技术取得了进一步发 展，在分离度、速度和灵敏 度方面实现了显著提升。需 要具有更小颗粒[1.7微米]的 色谱柱和具有专门功能的仪 器，提供15,000 psi [1,000 bar]的流动相，以达到更高 的性能水平。必须从整体上 创建一套新系统来执行超高 效液相色谱（现在称为 UPLC技术）。
2
简史和一些定义
• 液相色谱(LC)是俄国植物学家Mikhail S. Tswett在20世纪初 定义的概念。他当时专注于使用填充有颗粒的柱子分离用溶 剂从植物中提取的化合物[叶色素]，这是液相色谱史上的先 驱性研究。
• Tswett用颗粒填充开放式玻璃柱。他发现粉状白垩[碳酸钙] 和氧化铝这两种特殊材料对分离有用。他将样品[均质化植物 叶子的溶剂提取物]倒入柱中，使样品通过颗粒床。然后使纯 溶剂通过。当样品在重力作用下穿过柱子时，可以观察到样 品分成了不同颜色的谱带，这是因为某些组分的移动速度快 于其他组分。
• 高效液相色谱法现在是分析化学领域的一种强大的工具。它能够 分离、鉴定和定量存在于任何可溶于液体的样品中的化合物。目 前，可以轻松鉴定出浓度低至万亿分之一[ppt]级的痕量化合物。 HPLC可以并且已经应用于几乎任何样品，例如药品、食品、保健 品、化妆品、环境基质、法医学样品和工业化学品。
6
3
什么是超高效液相色谱（UPLC技术）？
• 目前，科学家们正在使用颗粒直径甚至 小于1微米的色谱柱以及能够在100,000 psi [6,800 bar]下运行的仪器来从事 基础研究。这让我们可以一窥这项技术 的未来。
• 图：HPLC色谱柱
（高效液相色谱）？
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什么是超高效液相色谱（UPLC技术）？
• 2004年，液相色谱的仪器和 色谱柱技术取得了进一步发 展，在分离度、速度和灵敏 度方面实现了显著提升。需 要具有更小颗粒[1.7微米]的 色谱柱和具有专门功能的仪 器，提供15,000 psi [1,000 bar]的流动相，以达到更高 的性能水平。必须从整体上 创建一套新系统来执行超高 效液相色谱（现在称为 UPLC技术）。
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简史和一些定义
• 液相色谱(LC)是俄国植物学家Mikhail S. Tswett在20世纪初 定义的概念。他当时专注于使用填充有颗粒的柱子分离用溶 剂从植物中提取的化合物[叶色素]，这是液相色谱史上的先 驱性研究。
• Tswett用颗粒填充开放式玻璃柱。他发现粉状白垩[碳酸钙] 和氧化铝这两种特殊材料对分离有用。他将样品[均质化植物 叶子的溶剂提取物]倒入柱中，使样品通过颗粒床。然后使纯 溶剂通过。当样品在重力作用下穿过柱子时，可以观察到样 品分成了不同颜色的谱带，这是因为某些组分的移动速度快 于其他组分。
• 高效液相色谱法现在是分析化学领域的一种强大的工具。它能够 分离、鉴定和定量存在于任何可溶于液体的样品中的化合物。目 前，可以轻松鉴定出浓度低至万亿分之一[ppt]级的痕量化合物。 HPLC可以并且已经应用于几乎任何样品，例如药品、食品、保健 品、化妆品、环境基质、法医学样品和工业化学品。
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什么是超高效液相色谱（UPLC技术）？
• 目前，科学家们正在使用颗粒直径甚至 小于1微米的色谱柱以及能够在100,000 psi [6,800 bar]下运行的仪器来从事 基础研究。这让我们可以一窥这项技术 的未来。
• 图：HPLC色谱柱
高效液相色谱法 HPLC
点是固定液层的耐溶剂冲刷性能差，固 定液易流失，从而导致柱效降低，被键 合相填料所取代。 3．正相色谱-固定液极性 > 流动相极性（NLLC） 极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱， 适于分离极性组分。 反相色谱-固定液极性 < 流动相极性（RLLC） 极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱适 于分离非极性组分。
1）硅胶： <>无定型硅胶 最早使用，传质慢、柱效低 <>薄壳型硅胶 直径为30~40μm的玻璃珠表面涂布一层1~2μm 厚的硅胶微粒，孔径均一、渗透性好、传质 快，但柱容量有限。 <>全多孔球型硅胶 粒度一般为5~10μm，颗粒和孔径的均一性都比 前两种好，柱容量大，为当今液固色谱固定相 的主体，也是键合固定相的主要基质。
2．进样系统 a 隔膜进样（高分子有机硅胶垫→进样室） >GC系统压力较小，可以 >HPLC系统压力太大，须停泵进样（早期） b 阀进样：不必停泵，六通阀
3．分离系统-色谱柱 >直径4~6mm,柱长10~30cm,多为不锈钢材料 >柱效评价：色谱系统适应性试验 R，n，fs（拖尾因子） >色谱柱维护 >预柱和预饱和柱
（二）反相键合相固定相
1．分离机制：疏溶剂理论 正相——流动相与溶质排斥力强， 作用时间↑， k↑，组分tR↑ 反相——流动相与溶质排斥力弱， 作用时间↓， k↓，组分tR↓
二、HPLC与GC差别
1．分析对象的区别 GC：
适于能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品； 但对高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型 及高聚物的样品，尤其对大多数生化样品不可 检测。(占有机物的20%)
HPLC： 适于溶解后能制成溶液的样品（包括有机介质溶 液），不受样品挥发性和热稳定性的限制，对分 子量大、难气化、热稳定性差的生化样品及高分 子和离子型样品均可检测用途广泛。（占有机物 的80%）
1）硅胶： <>无定型硅胶 最早使用，传质慢、柱效低 <>薄壳型硅胶 直径为30~40μm的玻璃珠表面涂布一层1~2μm 厚的硅胶微粒，孔径均一、渗透性好、传质 快，但柱容量有限。 <>全多孔球型硅胶 粒度一般为5~10μm，颗粒和孔径的均一性都比 前两种好，柱容量大，为当今液固色谱固定相 的主体，也是键合固定相的主要基质。
2．进样系统 a 隔膜进样（高分子有机硅胶垫→进样室） >GC系统压力较小，可以 >HPLC系统压力太大，须停泵进样（早期） b 阀进样：不必停泵，六通阀
3．分离系统-色谱柱 >直径4~6mm,柱长10~30cm,多为不锈钢材料 >柱效评价：色谱系统适应性试验 R，n，fs（拖尾因子） >色谱柱维护 >预柱和预饱和柱
（二）反相键合相固定相
1．分离机制：疏溶剂理论 正相——流动相与溶质排斥力强， 作用时间↑， k↑，组分tR↑ 反相——流动相与溶质排斥力弱， 作用时间↓， k↓，组分tR↓
二、HPLC与GC差别
1．分析对象的区别 GC：
适于能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品； 但对高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型 及高聚物的样品，尤其对大多数生化样品不可 检测。(占有机物的20%)
HPLC： 适于溶解后能制成溶液的样品（包括有机介质溶 液），不受样品挥发性和热稳定性的限制，对分 子量大、难气化、热稳定性差的生化样品及高分 子和离子型样品均可检测用途广泛。（占有机物 的80%）
高效液相色谱法简介
高效液相色谱的特点
高压——压力可达150～300 kg/cm2。色谱
柱每米降压为75 kg/cm2以上。
高速——流速为0.1～10.0 mL/min。 高效——塔板数可达5000/米。在一根柱中
同时分离成份可达100种。
高灵敏度——紫外检测器灵敏度可达0.01ng。
同时消耗样品少。
第二节
塑料块 Teflon
1 cm
工作电极 (Pt, Au, 碳糊)
e.电导检测器
电导检测器主要用于离子色谱的检测。 原理： 根据待测物在一些介质中电离后所产 生的电导（电阻的倒数）变化来测量电离物质 的含量。 电导检测器的主要部件是电导池。其响应 受温度影响较大，因此需要将电导池置于恒温 箱中。另外，当 pH>7时，该检测器不够灵敏。 电导检测器不能用于梯度洗脱。
◆恒流泵
注射型泵------输出精确，无脉动，需更换溶剂而中断工作。
往复型泵------造价低廉，溶剂更换方便，但存在脉动。 （使用较多） 对流量变化敏感的检测器会有噪声 干扰，此时可连接一脉动阻尼器。
◆恒压泵--------压力恒定，但流量不恒定（现在已经较少使用）。
输液泵操作注意事项：
防止固体微粒进入泵体 流动相不应含有腐蚀性物质 防止溶剂瓶内的流动相被用完 不超过规定的最高压力 流动相一般应该先脱气
F=2.3QKI0εCl
Q为量子产率，K为荧光效率，ε为摩尔吸光系 数，l为光径长度。
F=KC
特点：选择性好，
专属型检测器，灵敏 度比紫外检测器高 （检测限10-10 g/ml） 对多环芳烃，维 生素 B 、黄曲霉素、 卟啉类化合物、农药 、药物、氨基酸、甾 类化合物等有响应；
c. 示差折光检测器
hplc高效液相色谱法
HPLC高效液相色谱法简介高效液相色谱法（HPLC）是一种利用液体作为流动相，通过高压输液系统，将样品中的各组分在固定相和流动相之间进行分配或吸附等作用而实现分离和检测的色谱技术。
HPLC具有分离效率高、灵敏度高、选择性强、分析速度快、样品适用范围广等优点，已成为化学、生物、医药、环境等领域中最重要的分析方法之一。
本文将简要介绍HPLC的基本原理、仪器组成、常用的色谱模式和应用领域，以期对HPLC感兴趣的读者有所帮助。
一、HPLC的基本原理HPLC的基本原理是利用样品中的各组分在固定相和流动相之间的不同亲和力，使其在色谱柱内以不同的速度移动，从而达到分离的目的。
固定相是填充在色谱柱内的颗粒状物质，可以是固体或涂于固体载体上的液体。
流动相是通过高压泵送入色谱柱的溶剂或溶剂混合物，可以是极性或非极性的。
样品是通过进样器注入流动相中，并随流动相进入色谱柱。
当样品中的各组分经过固定相时，会发生吸附、分配、离子交换、排阻等作用，导致它们在固定相中停留不同的时间。
这个时间称为保留时间（retention time），通常用tR表示。
保留时间是反映样品组分在色谱柱内分离程度的重要参数，不同的组分有不同的保留时间。
当样品组分从色谱柱出口流出时，会被检测器检测到，并产生一个信号。
这个信号随时间变化而变化，形成一个色谱峰（chromatographic peak）。
色谱峰的位置反映了样品组分的保留时间，色谱峰的面积或高度反映了样品组分的含量或浓度。
将检测器信号随时间变化而绘制出来，就得到了一条色谱图（chromatogram）。
色谱图上可以看到不同的色谱峰，每个峰对应一个样品组分。
通过比较保留时间和色谱峰面积或高度，就可以对样品进行定性和定量分析。
二、HPLC仪器组成HPLC仪器主要由以下几个部分组成：溶剂供给系统（solvent delivery system）：负责提供恒定压力和流速的流动相，并将溶剂混合成所需比例。
高效液相色谱法的简介..
3．操作条件差别
GC：加温操作
HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）
二. 高效液相色谱法的特点和应用
“三高” “一快” “一广” 高压 高柱效——n=104片/米，柱效高（远高于一般LC） 高灵敏度 分析速度快 应用范围广泛（可分析80%有机化合物）
三.各类高效液相色谱法
液-固吸附色谱 液-液分配色谱
3.1 液-固吸附色谱法
固定相为固体吸附剂,流动相为液体。
固定相：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常 使用的是5～10μm的硅胶吸附剂；
流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂
分离机制：利用溶质分子占据固定相表面吸附活性 中心能力的差异，即物质吸附作用的不同来分离的。
适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具 有官能团的化合物和异构体有较高选择性
3.2 液-液分配色谱
固定相与流动相均为液体（互不相溶）；
基本原理：组分在固定相和流动相上的分配； 流动相 ：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即 流动相的极性小于固定液的极性（正相色谱），反之， 流动相的极性大于固定液的极性（反相色谱）。正相 与反相的出峰顺序相反； 固定相：早期涂渍固定液，固定液流失较多，较少采 用；
离子交换色谱
离子色谱
排阻色谱
亲和色谱
高效液相色谱固定相和流动相 （－）固定相
1. 高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类，可分为刚性固体和硬胶两 大类：
刚性固体：以二氧化硅为基质，可承受 7.O×108 ～ 1.O×109Pa 的高压，可 制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。如果在二氧化硅表面键合各种官 能团，就是键合固定相。 硬胶：主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚苯乙烯与二乙烯苯基 交联而成。可承受压力上限为3.5×108Pa。
高效液相色谱法(HPLC)
高效液相色谱法(HPLC) High Performance LiquidChromatography§3-1 高效液相色谱法概述一、定义以高压输出液体为流动相，以小粒径填料填充色谱柱的色谱分析方法。
高效液相色谱法是继气相色谱之后，70年代初期发展起来的一种以液体做流动相的新色谱技术.二、HPLC特点1、高压经典的液相色谱法，流动相在常压下输送，所用的固定相柱效低，分析周期长。
而现代液相色谱法中，流动相改为高压输送（150～350 ⨯105 Pa，最高输送压力可达450⨯105 Pa）;2、高速由于流动相流速高，分析时间大大缩短，几min、十几min可完成一个分析任务。
3、高效HPLC色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）。
4、高灵敏度利用高灵敏度的检测器，检测灵敏度大大提高。
紫外检测器10-9g荧光检测器10-11g高效液相色谱三、液相色谱分离原理及分类液相色谱分离的实质是样品分子（以下称溶质）与溶剂（即流动相或洗脱液）以及固定相分子间的作用，作用力的大小，决定色谱过程的保留行为。
根据分离机制不同，液相色谱可分为：液固吸附色谱、液液分配色谱、化学键合相色谱、离子交换色谱以及分子排阻色谱等类型。
四、液相色谱与气相色谱的比较1、相同点（1）基本原理一致：不同组分在两相中的作用力不同。
（2）基本概念一致：基本概念：保留值、塔板数、塔板高度、分离度、选择性等与气相色谱一致。
（3）基本理论一致：塔板理论与速率方程也与气相色谱基本一致。
2、不同点由于在液相色谱中以液体代替气相色谱中的气体作为流动相，而液体和气体的有性质本质不同，因此，两种方法也有不同之处：（1）仪器设备和操作条件不同；（2）应用范围不同；气相色谱仅能分析在操作温度下能气化而不分解的物质。
对高沸点化合物、非挥发性物质、热不稳定化合物、离子型化合物及高聚物的分离、分析较为困难。
HPLC简介
高效液相色谱高效液相色谱（high performance liquid chromatography, HPLC）也叫高压液相色谱（high pressure liquid chromatography）、高速液相色谱（high speed liquid chromatography）、高分离度液相色谱（high resolution liquid chromatography）等。
是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。
它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱。
又因分析速度快而称为高速液相色谱。
高效液相色谱是目前应用最多的色谱分析方法，高效液相色谱系统由流动相储液体瓶、输液泵、进样器、色谱柱、检测器和记录器组成，其整体组成类似于气相色谱，但是针对其流动相为液体的特点作出很多调整。
HPLC的输液泵要求输液量恒定平稳；进样系统要求进样便利切换严密；由于液体流动相粘度远远高于气体，为了减低柱压高效液相色谱的色谱柱一般比较粗，长度也远小于气相色谱柱。
HPLC应用非常广泛，几乎遍及定量定性分析的各个领域。
使用高效液相色谱时，液体待检测物被注入色谱柱，通过压力在固定相中移动，由于被测物种不同物质与固定相的相互作用不同，不同的物质顺序离开色谱柱，通过检测器得到不同的峰信号，最后通过分析比对这些信号来判断待侧物所含有的物质。
高效液相色谱作为一种重要的分析方法，广泛的应用于化学和生化分析中。
高效液相色谱从原理上与经典的液相色谱没有本质的差别，它的特点是采用了高压输液泵、高灵敏度检测器和高效微粒固定相，适于分析高沸点不易挥发、分子量大、不同极性的有机化合物。
高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，在技术上，流动相改为高压输送（最高输送压力可达4.9´107Pa）;色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。
高效液相色谱分析法概述
高效液相色谱分析技术及其新的发展与应用余建军(陕西科技大学生命科学与工程学院，西安710021)1 高效液相色谱法概述高效液相色谱法（high performanc，liquid chromatography，HPLC）是在经典液相色谱法基础上发展起来的一种新型分离、分析技术。
经典液相色谱法由于使用粗颗粒的固定相，填充不均匀，依靠重力使流动相流动，因此分析速度慢，分离效率低。
新型高效的固定相、高压输液泵、梯度洗脱技术以及各种高灵敏度的检测器相继发明，高效液相色谱法迅速发展起来[1]。
高效液相色谱法与经典液相色谱法比较，具有下列主要特点：（1）高效由于使用了细颗粒、高效率的固定相和均匀填充技术，高效液相色谱法分离效率极高，柱效一般可达每米104理论塔板。
近几年来出现的微型填充柱（内径lmm）和毛细管液相色谱柱（内径0.05umm），理论塔板数超过每米105，能实现高效的分离。
（2）高速由于使用高压泵输送流动相，采用梯度洗脱装置，用检测器在柱后直接检测洗脱组分等，HPLC完成一次分离分析一般只需几分钟到几十分钟，比经典液相色谱快得多。
（3）高灵敏度紫外、荧光、电化学、质谱等高灵敏度检测器的使用，使HPLC 的最小检测量可达10-9～10-11g（4）高度自动化计算机的应用，使HPLC 不仅能自动处理数据、绘图和打印分析结果，而且还可以自动控制色谱条件，使色谱系统自始至终都在最佳状态下工作，成为全自动化的仪器。
（5）应用范围广（与气相色谱法相比）HPLC 可用于高沸点、相对分子质量大、热稳定性差的有机化合物及各种离子的分离分析。
如氨基酸、蛋白质、生物碱、核酸、甾体、维生素、抗生素等。
（6）流动相可选择范围广它可用多种溶剂作流动相，通过改变流动相组成来改善分离效果，因此对于性质和结构类似的物质分离的可能性比气相色谱法更大。
（7）馏分容易收集更有利于制备2 色谱法分类高效液相色谱法按固定相不同可分为液-液色谱法和液-固色谱法；按色谱原理不同可分为分配色谱法（液-液色谱）和吸附色谱法（液-固色谱）等[2]。
高效液相色谱法
正相色谱：以极性物质做固定相，非极性物质作
流动相，即流动相的极性<固定相的极性。正相色 谱适用于极性化合物的分离，极性小的先出柱， 极性大的后出柱。（反之为反相色谱）
高效液相色谱仪
压力表 储液器 高压泵
进样器
梯度洗 提装置
色 谱 柱
记录仪 检测器
馏分收集器
一 高压输液系统 1.贮液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶剂过滤器(Ni 合金)，其孔径约2 m，可防止颗粒物进行 泵内。 2.脱气：超声波脱气或真空加热脱气。溶剂通 过脱气器中的脱气膜，相对分子量小的气 体透过膜从溶剂中除去。 3.高压泵： 对输液泵的要求：密封性好、输液流量稳 定无脉动、可调范围宽、耐腐蚀。
二 分离和进样系统 （一）进样系统 与GC相比，HPLC柱要短得多，因此由于柱 本身所产生的峰形展宽相对要小些。即， HPLC的展宽多因一些柱外因素引起。这些 因素包括：进样系统、连接管道及检测器 的死体积。进样装置包括两种。 1. 隔膜注射进样：使用微量注射器进样。装 置简单、死体积小。但进样量小且重现性 差。
2．化学发光检测器
是近年发展起来的高选择性、高灵敏度
（二）荧光检测器（FD） 早期的荧光检测器是具有滤光片的荧光 光度计，已基本淘汰。 目前使用的荧光检测器多是具有流通池 的荧光分光光度计（直角光路）。 检测限可达 1× 10-10g ／ ml ，比紫外检测 器灵敏，但只适用于能产生荧光或其衍生 物能发荧光的物质。
主要用于氨基酸、
多环芳烃、维生素、 甾体化合物、酶类、 黄曲霉素、卟啉类 化合物、农药等的 检测。
利用固定相与流动相之间对待分离组分子溶解
度的差异来实现分离。分配色谱的固定相一般 为液相的溶剂，依靠图布、键合、吸附等手段
高效液相色谱法（hplc）
高效液相色谱法(HPLC)一．概述色谱法是一种应用范围相当广泛的分离分析技术，它已有近百年的发展史。
二十世纪五、六十年代石油及石油化工的突起促使了GC技术大发展，而七、八十年代生命科学、生化、制药工业的发展推动了HPLC的迅速发展。
目前除分析化学外，生物化学，石油化学，有机化学，无机化学等学科都普遍采用色谱技术。
现代高效液相色谱仪，以其高效，快速和自动化等特点成为当代分析仪器中发展最快的仪器。
HPLC已成为操作方便、准确、快速并能解决困难分离问题的强有力的分析手段。
1．HPLC的特点（1）适用范围广已知有机物中仅20%不经预先化学处理，可用GC分析；而其余80%有机物可用HPLC分析。
HPLC适于分离生物、医学大分子和离子化合物，不稳定的天然产物，种类繁多的其它高分子及不稳定化合物。
（2）流动相及固定均与样品分子作用，而GC仅固定相与样品分子作用。
（3）具有独特性能的柱填料（固定相）种类较多，具有多种分离方式，适于各种化合物分析。
（4）分离温度较低，提高了分离效率。
（5）具有一些独特的检测器：电化学，示差折光，可见紫外吸收及荧光检测器等。
（6）样品易回收。
2．HPLC分类按分离机理分为四类：吸附色谱（液固）：通过试样组分对活性固体表面吸附亲合力的不同实现分离。
对具有不同官能团的化合物和异构体有较高选择性，早期应用较多，现在大多可用正相键合相色谱替代，常用硅胶柱。
分配色谱：不同溶质分子按其在固定相和流动相中分配系数不同得到分离。
现代分配色谱即化学键合相色谱，是将各种不同的有机基团通过化学反应键合到硅胶表面，具有很好的化学稳定性和热稳定性。
大部分分离问题都可用键合相色谱解决。
离子交换色谱：以离子交换剂为固定相，试样中电离组分与交换剂基体相反电荷的离解部位亲合力不同而分离。
用于分离无机或有机离子。
固定相为阴（阳）离子交换树脂，流动相为电解质溶液。
分子排阻色谱：按物质分子量大小进行分离。
不仅对高聚物，对分子量差别较大的低聚物或小分子化合物也可进行分离。
高效液相色谱技术简介(HPLC)
140高效液相色谱技术（HPLC ）高效液相色谱（HPLC ：High Performance Liquid Chromatography ）是化学、生物化学与分子生物学、医药学、农业、环保、商检、药检、法检等学科领域与专业最为重要的分离分析技术，是分析化学家、生物化学家等用以解决他们面临的各种实际分离分析课题必不可缺少的工具。
国际市场调查表明，高效液相色谱仪在分析仪器销售市场中占有最大的份额，增长速度最快。
高效液相色谱的优点是：检测的分辨率和灵敏度高，分析速度快，重复性好，定量精度高，应用范围广。
适用于分析高沸点、大分子、强极性、热稳定性差的化合物。
其缺点是：价格昂贵，要用各种填料柱，容量小，分析生物大分子和无机离子困难，流动相消耗大且有毒性的居多。
目前的发展趋势是向生物化学和药物分析及制备型倾斜。
7.1 基本原理固定相 流动相AB CCBA固定相 —— 柱内填料，流动相 —— 洗脱剂。
HPLC 是利用样品中的溶质在固定相和流动相之间分配系数的不同，进行连续的无数次的交换和分配而达到分离的过程。
通常，按溶质（样品）在两相分离过程的物理化学性质可以作如下的分类：分配色谱：—— 分配系数亲和色谱：—— 亲和力吸附色谱：—— 吸附力离子交换色谱：—— 离子交换能力凝胶色谱（体积排阻色谱）：—— 分子大小而引起的体积排阻分配色谱又可分为：正相色谱：固定相为极性，流动相为非极性。
反相色谱：固定相为非极性，流动相为极性。
用的最多，约占60～70％。
固定相（柱填料）：固定相又分为两类，一类是使用最多的微粒硅胶，另一类是使用较少的高分子微球。
后者的优点是强度大、化学惰性，使用pH范围大，pH=1～14，缺点是柱效较小，常用于离子交换色谱和凝胶色谱。
最常使用的全孔微粒硅胶（3～10μm）是化学键合相硅胶，这种固定相要占所有柱填料的80％。
它是通过化学反应把某种适当的化学官能团（例如各种有机硅烷），键合到硅胶表面上，取代了羟基（－OH）而成。
高效液相色谱法的简介
高效液相色谱仪
色谱仪器的流程由液体流动相的输液系统、进样系统、分离
系统、检测系统、信号放大记录系统组成，其中高压泵、色 谱柱和检测系统是高效液相色谱的主要部件。
1．贮液罐 （滤棒，可滤去颗粒状物 质） 2．高压泵（输液泵） 3．进样装置 4．色谱柱——分离 5．检测器——分析 6．废液出口或组分收集 器 7．记录装置
3．根据分子结构选择 用红外光谱法，可预先简单地判断样品中存在什么 官能团。然后，确定采用什么方法合适。例如，酸、 碱化合物用离子交换色谱；脂肪族或芳香族用液– 液分配色谱、液–固吸附色谱；异构体用液–固吸附 色谱；同系物不同官能团及强氢键的用液–液分配 色谱
高效液相色谱分离方法的选择参考表
五.高效液相色谱仪
离子对色谱机理：离子对形成机理；离子交换机理；离 子相互作用机理；
例如离子对形成机理：固定相为非极性键合相，流动相为水溶液，组分离子 A-，加入一种反荷离子B+，B+离子由于静电引力与带负电的组分离子生成 离子对化合物A-B+。
A 水相
B 有机相
A B 有机相
由于离子对化合物A-B+具有疏水性，因而被非极性固定相（有机 相）提取。
高效液相色谱固定相和流动相
（－）固定相
1. 高效液相大类：
刚性固体：以二氧化硅为基质，可承受7.O×108～1.O×109Pa的高压，可 制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。如果在二氧化硅表面键合各种官 能团，就是键合固定相。
硬胶：主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚苯乙烯与二乙烯苯基 交联而成。可承受压力上限为3.5×108Pa。
流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即 流动相的极性小于固定液的极性（正相色谱），反之， 流动相的极性大于固定液的极性（反相色谱）。正相 与反相的出峰顺序相反；
高效液相色谱(HPLC)简介
2. 流动相类别
按流动相组成分：单组分和多组分；
按极性分：极性、弱极性、非极性；
按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。
常用溶剂： 己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、
乙腈、水。
采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动
相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。
3. 流动相选择
在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。
（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累 积，损坏色谱柱和使检测器噪声增加。 （2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱 子。如使固定液溶解流失，酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。 （3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并 在柱中沉积。 （4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测 器时，流动相不应有紫外吸收。
高效液相色谱（HPLC）简介
目
1, 液相色谱分析法的发展 2, 高效液相色谱的特点 3, 高效液相色谱仪简介 4, 液相色谱法介绍 5, 分析方法的选择 6, 实际分析操作过程
录
1、液相色谱分析法的发展
20世纪初： 俄国植物学家茨维特提出经典液 相色谱法。经典液相色谱法包括柱色 谱、薄层色谱、纸色谱。 20世纪60年代末： 随着色谱理论的发展、高效细微 固定相的开发、高压恒流泵及高灵敏 度检测器的应用，高效液相色谱法得 到了突破性的发展。
a. 紫外检测器
应用最广，对大部分有机 化合物有响应。 特点： 灵敏度高；
线性范围宽；
流通池可做得很小(1mm × 10mm ，容积 8μL)； 对流动相的流速和温度变化不敏感； 波长可选，易于操作； 可用于梯度洗脱。
b. 光电二极管阵列检测器
紫外检测器的重要进展；
高效液相色谱
应用
由于HPLC分离分析的高灵敏度、定量的准确性、 适于非挥发性和热不稳定组分的分析，因此，在工 业、科学研究，尤其是在生物学和医学等方面应用 极为广泛。如氨基酸、蛋白质、核酸、烃、碳水化 合物、药品、多糖、高聚物、农药、抗生素、胆固 醇、金属有机物等分析，大多是通过HPLC来完成的。
液相色谱分离原理及分类
和气相色谱一样，液相色谱分离系统由 两相——固定相和流动相组成。液相色谱的 固定相可以是吸附剂、化学键合固定相（或 在惰性载体表面涂上一层液膜）、离子交换 树脂或多孔性凝胶；流动相是各种溶剂。
被分离混合物由流动相液体推动进 入色谱柱。根据各组分在固定相及流动 相中的吸附能力、分配系数、离子交换 作用或分子尺寸大小的差异进行分离。
它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均 匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需 用高压输送流动相,故又称高压液相色谱法 (High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。 又因分析速度快而称为高速液相色谱法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。也称 现代液相色谱。
敏感，且不适于梯度淋洗。
平面镜
样品
透镜
遮光板
光源
参比
光学零
光电转换 调零
放大器
记录仪
荧光检测器
许多有机物具荧光活性， 尤其是芳香族化合物具有很 强的活性。荧光检测器是一 种选择性很强的检测器，其
灵敏度比UV检测器高2～个数
量级。
电导检测器
电导检测器主要用于离子色谱的检测。 原理：基于待测物在一些介质中电离后所产生的电导（电 阻的倒数）变化来测量电离物质的含量。
流程及主要部件
流程
中国药典版--高效液相色谱法
色谱条件与系统适用性试验
按各品种项下的要求对仪器进行适用 性试验，即用规定的对照品对仪器进 行试验和调整，应达到规定的要求； 或规定分析状态下色谱柱的最小理论 板数、分离度、重复性和拖尾因子。
（1） 色谱柱的理论板数
色谱柱的理论板数(n) 在选定的条件下，注入 供试品溶液或各品种项下规定的内标物质溶液， 记录色谱图，量出供试品主成分或内标物质峰 的保留时间tR（以分钟或长度计，下同,但应 取相同单位）和半高峰宽(Wh/2)，按 n=5.54(tR／Wh/2)<2>计算色谱柱的理论板数， 如果测得理论板数低于各品种项下规定的最小 理论板数，应改变色谱柱的某些条件（如柱长， 载体性能，色谱柱充填的优劣等），使理论板 数达到要求。
(3) 拖尾因子
为保证测量精度，特别当采用峰高 法测量时，应检查待测峰的拖尾因子 (T)是否符合各品种项下的规定,或不同 浓度进样的校正因子误差是否符合要 求。除另有规定外， (T) 应在0.95～ 1.05之间。
四重复性
取各品种下的对照溶液，连续进样5次， 除令有规定外，其峰面积测量值相对 标准偏差应不大于2.0％。也可按照规 定 配制相当于80％、100％和120％的 对照品溶液，加入规定量的内标溶液， 配成三种不同浓度的溶液，分别注样3 次,计算平均校正因子，其相对标准偏 差应不大于2.0％。
对氨基酸分离，用经典色谱法，柱长约 170cm，柱径0.9cm，流动相速度为 30cm3·h-1，需用20多小时才能分离出20 种氨基酸；而用高效液相色谱法，只需lh 之内即可完成。又如用25cm×0.46cm的 Lichrosorb－ODS(5μ)的柱，采用梯度洗 脱，可在不到0.5h内分离出尿中104个组
3.测定法
定量测定时，可根据样品的具体情 况采用峰面积法或峰高法。但用归一 法或内标法测定杂质总量时，须采用 峰面积法。
高效液相色谱法(HPLC)的概述
此帖与GC版的对应，是为了让大家更好的学习和了解LC主要内容包括：1.高效液相色谱法（HPLC）的概述2. 高效液相色谱基础知识介绍（1——13楼）3. 高压液相色谱HPLC发展概况、特点与分类4. 液相色谱的适用性5.应用高效液相色谱法（HPLC）的概述以高压液体为流动相的液相色谱分析法称高效液相色谱法（HPLC）。
其基本方法是用高压泵将具有一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂泵入装有填充剂的色谱柱，经进样阀注入的样品被流动相带入色谱柱内进行分离后依次进入检测器，由记录仪、积分仪或数据处理系统记录色信号或进行数据处理而得到分析结果。
由于高效液相色谱法具有分离效能高、选择性好、灵敏度高、分析速度快、适用X围广（样品不需气化，只需制成溶液即可）、色谱柱可反复使用的特点，在《中国药典》中有50种中成药的定量分析采用该法，已成为中药制剂含量测定最常用的分析方法。
高效液相色谱法按固定相不同可分为液-液色谱法和液-固色谱法；按色谱原理不同可分为分配色谱法（液-液色谱）和吸附色谱法（液-固色谱）等。
目前，化学键合相色谱应用最为广泛，它是在液－液色谱法的基础上发展起来的。
将固定液的官能团键合在载体上，形成的固定相称为化学键合相，不易流失是其特点，一般认为有分配与吸附两种功能，常以分配作用为主。
C18（ODS）为最常使用的化学键合相。
根据固定相与流动相极性的不同，液-液色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法，当流动相的极性小于固定相的极性时称正相色谱法，主要用于极性物质的分离分析；当流动相的极性大于固定相的极性时称反相色谱法，主要用于非极性物质或中等极性物质的分离分析。
在中药制剂分析中，大多采用反相键合相色谱法。
系统组成：（一）高压输液系统由贮液罐、脱气装置、高压输液泵、过滤器、梯度洗脱装置等组成。
1.贮液罐由玻璃、不锈钢或氟塑料等耐腐蚀材料制成。
贮液罐的放置位置要高于泵体，以保持输液静压差，使用过程应密闭，以防止因蒸发引起流动相组成改变，还可防止气体进入。
高效液相色谱法(HPLC)简介
高效液相色谱法分离过程
主要在于固定相的性质、形状及粒度，其次 差别： 是检测手段和输液设备。
经典液相色谱 固定相： 粒度：60~600μｍ（多孔） 柱长：10~200cm（d=10~50mm） n 约为 2~50/m
流动相：靠重力输送
经典液相色谱无在线检测器
缺点：
①粒度范围宽、不规则，不易填充均匀，扩散和传质阻 力大。 ②无检测设备，分析速度慢、效率低。 只能作为分离手段
（3）不能完全替代气相色谱
（4）不适于分析受压分解、变性的具有生物活性的
Hale Waihona Puke 生化样品。高效液相色谱法与其他分析方法一样，
不是尽善尽美的。
第二节 高效液相色谱法的基本理论
一、高效液相色谱参数 1.定性参数 tR 、 t 0 、 t’ R t’R= tR- t0 2.柱效参数 σ、 W1/2 、W W=4 σ 或 w=1.699W1/2 n=（ tR / σ）2 H=L/n
四、高效液相色谱法的应用范围和局限性
1.应用范围 高效液相色谱法适于分析高沸点、受热不稳定易 分解、分子量大、不同极性的有机化合物；生物活性 物质和多种天然产物；合成和天然高分子化合物。 涉及石油化工产品、食品、药品、生物化工产品 及环境污染物。约占全部有机物的80%。 2.方法的局限性
（1）使用多种溶剂为流动相，成本高，污染环境 （2）缺少通用检测器
美国药典委员会（USPC）成立于1820年，至今近200 年。出版发行了25版药典。 75年（19版）将HPLC载入药典 20版-62项；21版-363项；22版-871项；23版-1188项； 24版-含量测定法：1386项 鉴别：519项 杂质检查：206项
如今：在评价世界各国药典水平时，HPLC法成为 反映各国药典先进性的重要指标之一。
高效液相色谱检测技术
高效液相色谱法特点
高压：液体作为流动相流经色谱柱时，受到 的阻 力较大，施加高压能使液体迅速通过，一般高达 150-350 ×105Pa。
高速：载液在色谱柱内的流速较之经典液相色谱 法高得多，一般可达1-10mL/min。
高效：高效液相色谱法的柱效能可达3万塔板/米 ，而气相色谱法的柱效能仅为2000塔板/米。
高效液相色谱法自20世纪60年代问世以来，由于使用了高压输液泵、 全多孔微粒填充柱和高灵敏度检测器，实现了对样品的高速、高效和高 灵敏度的分离测定。高效液相色谱由于吸取了经典液相色谱的研制经验， 并引入微处理机技术，极大的提高了仪器的自动化水平和分析精度。现 在用微处理机控制的高效液相色谱仪，其自动化程度很高，既能控制仪 器的操作参数(如溶剂梯度洗脱、流动相流量、柱温、自动进样、洗脱液 收集、检测器功能等)，又能对获得的色谱图进行收缩、放大、叠加，以 及对保留数据和峰高、峰面积进行处理等，为色谱分析工作者提供了高
液相色谱仪最基本的组件是高压输液泵、进样器、色谱柱、检 测器和数据系统（记录仪、积分仪或色谱工作站）。此外，还 可根据需要配置流动相在线脱气装置、梯度洗脱装置、自动进 样系统、柱后反应系统和全自动控制系统等。
液相色谱仪的工作过程：输液泵2将流动相以稳定的流速（或 压力）输送至分析体系，在色谱柱之前通过进样器3将样品导入, 流动相将样品带入色谱柱4,在色谱柱中各组分因在固定相中的分 配系数或吸附力大小的不同而被分离，并依次随流动相流至检测
高灵敏度：采用高灵敏度的检测器，进一步提高 了分析的灵敏度，荧光检测器可达10-11 g 。
HPLC主要知名品牌
• 沃特斯（Waters • 安捷伦（Agilent） • 岛津（Shimazu） • 其它：戴安、菲尼根、热电等。
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柱类型与温度选择性的关系
.
•
柱类型不同，选择性也不一样，这与键和相有关。 温度的选择性，温度的变化会影响分离度。
色谱柱条件
流速适中，过高会降低塔板数。 当流动相粘度增加时，塔板数会降低， 对于反相体系，水的粘度较高意味着在高温时操作有利于最大限度的增大塔 板数，在50度时较好。
其他因素
工作压力：低于150bar 操作时间：应尽可能短 峰高：只要检测灵敏度有限，需要窄而高的峰 溶剂应用：对日常工作、大量实验，每次进样少消耗流动相为好
液相色谱贮液器的使用及维护
• 常用干净的无水甲醇试剂瓶作贮液器，并要加盖以防灰尘落入，但瓶盖与导 管之间应有缝隙，若过紧会形成真空。贮液并内要放置烧结不锈钢过滤器， 即沉子，孔径为10μ m，其作用是：①防止灰尘进入泵缸。② 作为进液导管 的重物，使导管能沉在并底。 溶剂过滤：常用0.5μm膜过滤。HPLC级溶剂：无微粒，无紫外吸收，已用 0.2μm膜过滤。 贮液瓶要不定期更换，要有2～3个备用瓶，定期用酸、水、溶剂清洗。 沉子：用三个月后必须清洗或更换，若未用沉子，则必须用0.5μm膜过滤。
高效液相色谱（HPLC）简介
什么是高效液相色谱(HPLC)？
• HPLC (High Performance Liquid Chromatography ) —高效液相色谱 法 • 是一种区别于经典液相色谱,基于仪器方法的高效能分离手段: 高性能色谱柱,高精度输液泵,高灵敏度检测器… • 广泛应用于各个领域: 医药,环保,石化,生命科学,食品工业,农业… • 无论在技术上,理论上,还是在应用上仍处于发展阶段
特点：消除了溶剂的干扰，不受温度变化影响，灵敏 度高，是通用型检测器。
紫外吸收检测器有三种类型
固定波长紫外吸收检测器：低压汞灯提供固定254nm或280nm紫外光。
可变多波长检测器：氘灯做光源，光栅分光
光二极管阵列检测器photo－diode－array detector（PDAD，PDA, DAD）：钨灯 和氘灯组合光源，进入检测池的不是单色光，而是一段紫外波长上的光。
操作过程图示
色谱分离的机理
分离是一个 物理的过程。
固定相(Stationary Phase) 流动相(Mobile Phase) 样品 (溶解于流动相中的溶质)
HPLC的特点
项 目 进样方式 流动相 分离原理 检测器
高效液相色谱法 样品制成溶液 溶液 吸附、分配、筛析、亲和等 UVD、PDAD、RID等 低、中、高沸点有机化合物 离子型无机化合物 热不稳定化合物 生物活性分子
流动相的选择原则
• • • • • • • • ①样品易溶，且溶解度尽可能大。 ②化学性质稳定，不损坏柱子。 ③不妨碍检测器检测，紫外波长处无吸收。 ④粘度低，流动性好。 ⑤易于从其中回收样品。 ⑥无毒或低毒，易于操作。 ⑦易于制成高纯度，即色谱纯。 ⑧废液易处理，不污染环境
提高柱效的方法
• • • • 固定相填料要均一，颗粒细，装填均匀 流动相粘度低 低流速 升高柱温。
流动相
• 反相色谱最常用的流动相及其冲洗强度 H2O＜甲醇＜乙腈＜乙醇 ＜丙醇＜异丙醇＜四氢呋喃 • 正相色谱常用的流动相及其冲洗强度的顺序 正己烷＜乙醚＜乙酸乙酯＜异丙醇
液相色谱图相关术语(1)
• 色谱图相关术语:
–色谱峰(Peak):色谱柱流出组分通过检测器时产生 的响应信号的微分曲线 –峰底(Peak Base):峰的起点与终点之间连接的直线 –峰高(Peak Height):峰最大值到峰底的距离 –峰宽(Peak Width):在峰两侧拐点处所作切线与峰 底相交两点之间的距离 –半(高)峰宽(Peak Width at Half Height):通过峰 高的中点作平行于峰底的直线,其与峰两侧 相交两点之间的距离
• 反相柱------固定相通常是以硅胶为基质，表面键合有极性相对较弱官能团 的键合相。反向色谱所使用的流动相极性较强，通常为水、缓冲液与甲醇、 乙腈等的混合物。样品流出色谱柱的顺序是极性较强的组分最先被冲洗出， 而极性弱的组分会在色谱柱上有更强的保留。 常用的反向填料有：C18（ODS）、C8（MOS）、C4（Butyl）、C6H5（Phenyl） 等。
PDA 可以辅助定性。
液相色谱分析法的特点
在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，实现了分析速度快、 分离效率高和操作自动化。兼具分离和分析功能，可以在线检测。
高效液相色谱法的主要类型及原理
1、液-液分配色谱
2、液-固吸附色谱 3、离子交换色谱
4、离子对色谱
5、离子色谱 6、排阻色谱 7、亲和色谱(AC)
• • •
溶剂脱气
脱气：正相色谱如非水性凝胶色谱的流动相不必脱气，反相色谱的流动相需 要脱气。 He氦气脱气：10min可以除去80～90％溶入的气体，但价格昂贵 真空脱气：这是最常用的方法，可用真空抽滤流动相的方法代替。 超声脱气：使用方便，但只能脱气30％ 加热回流：最彻底的脱气方法，混合流动相不能用
HPLC的图形结果 --色谱图(Chromatogram)
色谱图:色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间 的曲线图,其纵坐标为信号强度,横坐标为保留时间.
Байду номын сангаас
←色谱峰
峰宽
基线 ↓ 峰高
时间(分)
液相色谱图相关术语(2)
色谱图相关术语: 峰面积(Peak Area):峰与峰底之间的面积,又称响 应值 标准偏差(σ )(Standard Error):0.607倍峰高处所 对应峰宽的一半 拖尾峰(Tailing Peak):后沿较前沿平缓的不对称峰 前伸峰(Leading Peak):前沿较后沿平缓的不对称峰 鬼峰(Ghost Peak):并非由试样所产生的峰,亦称假峰
h
A B 1/10h
拖尾
前伸
B T f＝ A
液相色谱图相关术语(3)
色谱图相关术语: 基线(Baseline):在正常操作条件下,仅由流动相所 产生的响应信号的曲线 基线飘移(Baseline Drift):基线随时间定向的缓 慢变化 基线噪声(N)(Baseline Noise):由各种因素所引起 的基线波动 保留时间(tR)(Retention time):组分从进样到出现峰 最 大值所需的时间
检测器简介（三）
◆ 蒸发光散射检测器（ELSD）
原理：通过检测光散射程度而测定溶质浓度的检测器。 色谱柱后流出物在通向检测器途中，被高速载气 （氮气）喷成雾状液滴，再进入蒸发漂移管中，流 动相不断蒸发，含溶质的雾状液滴形成不挥发的微 小颗粒，被载气载带通过检测器。在检测器中，光 被散射的程度取决于溶质颗粒的大小与数量。
液相色谱类型
•
•
正相色谱：固定相为极性，流动相为非极性。
反相色谱：固定相为非极性，流动相为极性。用的最多，约占60～70％。
色谱柱简介
• 正相柱------固定相通常为硅胶以及其他具有极性官能团胺基团，如（NH2） 和氰基团（CN）的键合相填料。 由于硅胶表面的硅羟基（SiOH）或其他极性基团极性较强，因此，分离 的次序是依据样品中各组分的极性大小，即极性较弱的组份最先被冲洗出色 谱柱。正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低，如正已烷，氯仿，二氯 甲烷等。
评价液相色谱方法的标准
α，k'，N∶如何控制分离度?
K′是容量因子，表达了被分离组分与柱填料的作用强弱。 a 是分离因子，描述两个组分分离的好坏程度，是化学因素。 N 是理论塔板数，描述色谱峰的谱带展宽程度。
改变a的途径 改变固定相 改变流动相 改变温度 改变样品的本身性质 在反相HPLC中溶剂强度会随着水/有机流动相中的有机相增加而增加 。
流动相不畅的原因 原因 管路阻塞 长了霉菌 管道有大量气泡造成空化 贮液并盖子太紧 解决方法 更换管路 用稀硝酸洗去管内微生物（洗前必须洗净醇类） 采用色谱的空灌注和湿灌注 抬高贮液并或向并内加压去掉沉子
色谱柱使用及维护（一）
• 在使用前一定要注意看使用说明，了解柱子的使用范围如pH值等，一般来说，硅 胶基质：pH 2.5～7.0，聚合物填料：pH 1～13 。极端pH的流动相能溶解硅胶。 • 温度：高温下用小颗粒填料柱会引起塌陷，柱效N下降一半：3μm柱，＞40℃； 5μm柱，＞70℃。 • 柱的保存：通常灌注纯有机溶剂保存。。 • 定期洗柱：甲醇、乙腈洗掉柱中强保留组分，正向或反向洗，不要流过检测器， 若无效：则换不锈钢过滤片，并用同种填料加乙醇调成糊状，补平柱头，或挖去 2～3mm脏填料，重新填平（填料也可以不同种）。 • 延长柱寿命：修补柱头；换不锈钢过滤片；冲洗柱；倒向用（柱效要下降40～60 ％）。 • 使用预柱保护分析柱（硅胶在极性流动相/离子性流动相中有一定的溶解度） • 避免流动相组成及极性的剧烈变化 • 压力升高是需要更换预柱的信号
确定最佳的溶剂强度
• ―试-凑法”，即先用一种可能过强的流动相，在后面的实验中逐步减小溶 剂强度以增加k’，当所有谱峰的k’介于1—20时，其流动相已经接近最佳 了。 • 采用梯度洗脱的实验方法，即在20min内，高强度的溶剂的比例从5%增 加到100%，找出在梯度洗脱期间，流出峰到达中点的时间tx(即流出的第 一谱峰与最末谱峰之间的中心点)，然后用下式计算合适的流动相离开梯 度混合器的时间tk=tx-2t0-tD. • t0为死时间，tD为溶剂由梯度混合器流出，通过泵和所连管线到达柱子的 时间 最佳溶剂强度时溶剂浓度%：=初始浓度（%）+tk/20[最终浓度-初始浓度]
液相色谱分析法
（一）高效液相色谱分析的流程 1、由泵将储液瓶中的溶剂吸入色谱系统，然后输出，经流量与压力测量之后，导 入进样器。 2、被测物由进样器注入，并随流动相通过色谱柱，在柱上进行分离后进入检 测器，检测信号由数据处理设备采集与处理，并记录色谱图。 3、废液流入废液瓶。 遇到复杂的混合物分离（极性范围比较宽）还可用梯度控制器作梯度洗脱。 这和气相色谱的程序升温类似，不同的是气相色谱改变温度，而ＨＰＬＣ改变的是 流动相极性，使样品各组分在最佳条件下得以分离。 • • （二）高效液相色谱的分离过程 同其他色谱过程一样，ＨＰＬＣ也是溶质在固定相和流动相之间进行的一 种连续多次交换过程。它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不 同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分离。