乙酰胆碱酯酶固定化方法的研究

38酶电极中酶固定化方法研究进展孔维琴 陈志伟（山东理工大学 化学工程学院，中国 淄博 255049）摘要 酶电极是最常用也是最早开发的生物传感器，而固定化酶作为酶电极的关键也得到了广泛的关注。

本文介绍了酶电极及固定化酶的特点，重点讨论了制作酶电极的关键技术即酶固定化的方法，包括吸附法、包埋法、共价键合法和交联法等传统方法和静电纺丝法、纳米技术处理等一些新型的固定化方法，并进一步探讨了各种固定化方法的优缺点。

关键词 酶电极，固定化酶，研究进展作者简介：孔维琴（1986-），女，硕士研究生，应用化学。

E-mail:kongweiqin1986@通信作者：陈志伟（1972-），男，教授，主要从事生物化学及分析测试方面的研究。

E-mail:12chen@引言酶电极是指将活性物质酶固定在电极表面，探测电流型或电位型催化反应信号。

酶电极是最常用也是最早开发的生物传感器。

早在1962年Clark [1]等人将酶片和电极结合起来，产生了酶电极的雏形，并在1967年由Updike和HickS [2]用聚丙烯酰胺凝胶固定葡萄糖氧化酶（GOD）成膜和氧电极组装在一起，制成了第一种生物传感器，即葡萄糖酶电极生物传感器。

因为酶与电化学电极的匹配很容易，所以对酶电极的研究最成熟。

到目前为止，酶电极被广泛应用于食品[3]、医药、化学分析、环境监测甚至军事等领域，中国专利CN 1452717A（2003）还公开了利用酶电极测定三磷酸腺苷（ATP）浓度的方法[4]。

酶是一类具有催化功能的活性物质，和化学催化剂相比，具有反应速度快、选择性好、反应条件温和、底物专一性强、可在水溶液和中性pH下操作等优点，同时酶本身可以被微生物降解，符合绿色化学的要求。

但是游离酶也有对外界因素非常敏感容易失活、不易分离和纯化等问题。

为了克服这些缺点，酶固定化技术应运而生。

酶的固定化是用一定的材料将活性酶束缚或限制于一定的区域内，但仍能进行酶所特有的催化反应，并可回收及重复使用的一种新技术。

胆固醇酯酶的固定化及其性能的研究
张定亨;张惠芬;等
【期刊名称】《江西工业大学学报》
【年(卷),期】1992(014)001
【摘要】1 ABSE-交联琼脂经重氮化后，在冰浴中偶联胆固醇酯酶的条件确定为：最适PH取8.0，加酶量取170酶单位/克湿载体、偶联时间取3小时，刚制备的
固定化酶必须用∝-萘酚封闭以增加稳定性，固定化酶活力为84酶单位/克湿固定
化酶，活力回收为49%。

2 固定化酶性能为：最佳催化反应温度为35℃，最佳
PH为7.8；具有良好的热稳定性和PH稳定性；在4℃保存期可达6个月以上，
重复使用4个月仍可保留90%以上活性。

3 用固定化酶检测胆固醇酯，当酯的浓
度在7.2-300mg/dl范围内，500nm处的吸光度变化值与酯浓度呈线性关系。

【总页数】8页(P32-39)
【作者】张定亨;张惠芬;等
【作者单位】化学工程系;化学工程系
【正文语种】中文
【中图分类】R446.1
【相关文献】
1.聚乙二醇修饰的胆固醇酯酶在高密度脂蛋白胆固醇均相测定中的作用 [J], 董伟;李淑锋;王纲;华子春
2.固定化植物酯酶-显色剂传感膜的制备与性能 [J], 马文石;汪军;栾崇林
3.胆固醇、胆固醇酯、胆碱酯酶在重症肝炎患者中的水平变化 [J], 龚诗
4.不同载体固定化海洋微生物酯酶ETM-b的性能比较 [J], 张艳;郑媛;王海英;孙谧
5.纤维素基固载酶材料的制备及乙酰胆碱酯酶的固定化性能 [J], 郭明;燕冰宇;周珊;王春鹏;储富祥
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脂肪酶固定化的新方法研究及其应用的开题报告一、选题背景脂肪酶（Lipase）是广泛应用于食品、医药、化工等领域的一类重要酶。

目前，大多数的脂肪酶分离纯化方法采用离子交换色谱、凝胶过滤、透析等传统方法，但这些方法存在分离纯化周期长，成本高，难以大规模生产等问题。

因此，对脂肪酶固定化的研究具有重要意义。

脂肪酶固定化可以提高催化活性和稳定性，减少废弃物污染等优点，成为了研究的热点。

目前常见的固定化方法有包埋法、吸附法、凝胶法等。

但这些方法还存在着单一、操作困难等问题。

因此，本研究旨在探究一种新的脂肪酶固定化方法，使其具有更高的效率和实用性。

二、研究内容与目的本研究将探究一种新的脂肪酶固定化方法，该方法是基于金属有机骨架材料（MOF）的。

MOF具有稳定的多孔结构和良好的吸附性能，易于构造多种功能化材料，在催化应用方面具有广泛的应用前景。

本研究的目的是通过MOF固定化脂肪酶，提高其酶活性，稳定性和重复使用次数，拓展其在食品、医药等领域的应用。

具体研究内容包括：1. MOF的制备和表征2. MOF固定化脂肪酶的制备和表征3. 固定化脂肪酶的催化性能研究，包括酶活性、稳定性和重复使用次数等方面的研究4. MOF固定化脂肪酶在食品、医药等领域的应用实验三、研究意义本研究将探究一种新的脂肪酶固定化方法，对脂肪酶的高效、稳定和重复使用具有重要的意义。

该方法具有以下几个扩大应用的优点：1. MOF材料生产成本低廉，有望实现在大规模生产中的应用2. 脂肪酶的稳定性和催化活性得到提升，可支持更多化学反应的进行3. 固定化脂肪酶的重复使用次数增加，节约成本，提高效率4. 有望广泛应用于食品、医药和化工领域四、研究方法和技术路线1. 实验用具的准备，如摇床、离心机、pH计、紫外分光光度计、荧光分光光度计等2. MOF材料的制备和表征3. 脂肪酶的生物学特性分析4. MOF固定化脂肪酶的制备和表征5. MOF固定化脂肪酶的催化性能研究，包括酶活性、稳定性和重复使用次数等方面的研究6. MOF固定化脂肪酶在食品、医药等领域的应用实验七、论文结构本研究将完成以下部分的论文：1. 绪论2. 相关理论和方法3. MOF固定化脂肪酶的制备和表征4. 固定化脂肪酶在催化反应中的应用5. 结论6. 参考文献以上是本研究的开题报告，目前仍需在实验数据上进行更深入的探究和研究。

大豆肽乙酰胆碱酯酶抑制活性实验乙酰胆碱酯酶（AchE）是老年痴呆疾病阿尔茨海默氏病（Alzheimer’s Disease,AD）的一个酶抑制剂作用靶点。

乙酰胆碱酯酶浓度过高，催化乙酰胆碱的裂解反应，导致乙酰胆碱过度的缺失，直接造成神经信号传递失败，引起老年痴呆症。

在以往的研究中，已经被证明发酵豆腐乳中具有ACHE的抑制活性，大豆异黄酮（染料木素、山奈酚、大豆素）也具有抑制活性，但是大豆蛋白不具有乙酰胆碱酯酶抑制活性。

本次实验旨在检测大豆肽中是否具有乙酰胆碱酯酶抑制活性肽，如果具有，则可证明大豆肽具有保护大脑神经记忆的作用，同时也可以进行接下来的实验，利用层析分离大豆肽，找出具有活性的具体肽，鉴定其结构，人工合成此肽，检验活性。

1实验原理根据Ellman的方法，底物碘代硫代乙酰胆碱(ATch)在乙酰胆碱酯酶(AchE)作用下分解，生成硫代胆碱(Thiocholine)，硫代胆碱与显色剂DTNB迅速作用，生成在405nm处有光吸收的黄色物质，在酶催反应的稳态阶段其OD值即可代表起始反应速率。

O+AchE→Acetyrate+ThiocholineAcetylthiocholine+H2Thiocholine+5’5’-thiobis-2-nitrobenzoic acid→5-thio-2-nitrobenzoic acid2实验材料与仪器2.1实验材料磷酸氢二钠和磷酸二氢钠配成0.1M的PBS磷酸缓冲液。

乙酰胆碱酯酶(AchE)：冻干粉溶于PBS中，配成4.3U/ml溶液。

DTNB：溶于PBS中，配成756uM的溶液。

碘代硫代乙酰胆碱(ATch)：溶于PBS中，配成0.3mM的溶液。

2.2实验仪器酶标仪、96孔板3实验步骤3.1实验样品阴性对照组、阳性对照组、产品对照组、大豆肽原液、0~1000u、1000~3000u、3000~10000和10000~30000共八组，每组做五组平行实验取平均值。

西安工程大学学报J o u r n a l o f X i a n P o l y t e c h n i c U n i v e r s i t y第38卷第1期(总185期)2024年2月V o l .38,N o .1(S u m.N o .185)引文格式:潘虹,陆天炆,王晓军,等.酶固定化技术的最新研究进展[J ].西安工程大学学报,2024,38(1):83-91.P A N H o n g ,L U T i a n w e n ,WA N G X i a o j u n ,e t a l .R e c e n t a d v a n c e s i n e n z y m e i mm o b i l i z a t i o n t e c h n o l o g y [J ].J o u r n a l o f X i a n P o l y t e c h n i c U n i v e r s i t y,2024,38(1):83-91. 收稿日期:2023-08-06 修回日期:2023-10-21基金项目:陕西省自然科学基础研究计划项目(2021J Q -672㊁2022J Q -117);陕西省教育厅专项科研计划项目(22J K 0399) 通信作者:潘虹(1988 ),女,讲师,博士,研究方向为固定化酶和多孔水凝胶㊂E -m a i l :441595837@q q.c o m 酶固定化技术的最新研究进展潘 虹,陆天炆,王晓军,洪一楠(西安工程大学环境与化学工程学院,陕西西安710048)摘要 酶作为一种催化性能好且安全可靠的生物催化剂,在食品㊁医药及环境治理等诸多领域得到了广泛应用,但因受限于游离酶较差的环境稳定性而难以实现进一步的工业化应用㊂酶固定化技术有助于提高游离酶对敏感环境的耐受性和操作过程中的稳定性,大大缩减了应用成本㊂回顾了近五年内固定化技术的发展及现状,总结了吸附法㊁结合法等传统固定化方法,共固定化酶法等新型固定化方法,以及天然材料载体㊁复合材料载体和纳米载体等不同固定化载体在各个领域的研究进展㊂相比于游离酶,固定化酶体系在稳定性和重复使用性等方面得到了显著提升,但同时也存在一些不足,如固定后的活性回收率降低㊁载体合成途径繁琐且成本较高以及固定化酶作用机理尚不完善等㊂结合这些不足之处提出了酶固定化技术在未来的发展方向㊂关键词 酶固定化;固定化载体;固定化方法;纳米载体;共固定开放科学(资源服务)标识码(O S I D )中图分类号:Q 814.2 文献标志码:AD O I :10.13338/j .i s s n .1674-649x .2024.01.011R e c e n t a d v a n c e s i n e n z y m e i m m o b i l i z a t i o n t e c h n o l o g yP A N H o n g ,L U T i a n w e n ,WA N G X i a o ju n ,H O N G Y i n a n (S c h o o l o f E n v i r o n m e n t a l a n d C h e m i c a l E n g i n e e r i n g ,X i a n P o l y t e c h n i c U n i v e r s i t y,X i a n 710048,C h i n a )A b s t r a c t A s a n e f f i c i e n t a n d s a f e b i o c a t a l y s t ,e n z y m e s h a v e b e e n w i d e l y u s e d i n m a n yf i e l d s s u c h a s f o o d ,m e d i c i n e a n d e n v i r o n m e n t a lg o v e r n a n c e ,b u t i t i s d i f f i c u l t t o r e a l i z e f u r th e ri n d u s t r i a l a p-p l i c a t i o n d u e t o t h e p o o r e n v i r o n m e n t a l s t a b i l i t y o f f r e e e n z y m e s .E n z y m e i mm o b i l i z a t i o n t e c h -n o l o g y h e l p s t o i m p r o v e t h e t o l e r a n c e o f f r e e e n z y m e s t o s e n s i t i v e e n v i r o n m e n t s a n d t h e s t a b i l i t yd u r i n g o pe r a t i o n ,a n d g r e a t l y r e d u c e s t h e a p p l i c a t i o n c o s t .T h i s p a p e r r e v i e w s t h e d e v e l o pm e n t a n d c u r r e n t s i t u a t i o n o f i mm o b i l i z a t i o n t e c h n o l o g yi n t h e p a s t f i v e y e a r s ,a n d s u mm a r i z e s t h e r e -s e a r c h p r o g r e s s o f d i f f e r e n t i mm o b i l i z a t i o n m e t h o d s(i n c l u d i n g t r a d i t i o n a l i mm o b i l i z a t i o n m e t h-o d s s u c h a s a d s o r p t i o n m e t h o d a n d b i n d i n g m e t h o d a n d n e w i mm o b i l i z a t i o n m e t h o d s s u c h a s c o-i mm o b i l i z a t i o n e n z y m e m e t h o d)a n d i mm o b i l i z a t i o n c a r r i e r s(i n c l u d i n g n a t u r a l m a t e r i a l c a r r i e r s, c o m p o s i t e c a r r i e r s a n d n a n o c a r r i e r s)i n v a r i o u s f i e l d s.I n g e n e r a l,c o m p a r e d w i t h f r e e e n z y m e s, t h e i mm o b i l i z e d e n z y m e s y s t e m h a s b e e n s i g n i f i c a n t l y i m p r o v e d i n t e r m s o f s t a b i l i t y a n d r e u s-a b i l i t y.H o w e v e r,t h e r e a r e s o m e s h o r t c o m i n g s,s u c h a s l o w e r r e c o v e r y r a t e a f t e r i mm o b i l i z a-t i o n,c u m b e r s o m e a n d c o s t l y c a r r i e r s y n t h e s i s p a t h w a y,a n d i m p e r f e c t m e c h a n i s m o f i mm o b i l i z a-t i o n e n z y m e.F i n a l l y,t h e d e v e l o p m e n t d i r e c t i o n o f t h e t e c h n o l o g y i n t h e f u t u r e w a s p u t f o r w a r d b a s e d o n t h e s e s h o r t c o m i n g s.K e y w o r d s e n z y m e i mm o b i l i z a t i o n;i mm o b i l i z a t i o n c a r r i e r s;i mm o b i l i z a t i o n m e t h o d;n a n o c a r r i-e r s;c o-i mm o b i l i z a t i o n0引言生物酶是一类具有催化效率高㊁专一性强的生物催化剂[1],其本质是一种蛋白质㊂因此,生物酶通常需在常温常压等温和条件下才能表现出其高催化性能,当离开特定环境就会出现酶活性和稳定性迅速降低的缺点[2]㊂活性炭可以吸附蔗糖酶进行蔗糖水解,且保持了蔗糖酶较好的催化活性[3]㊂由此,固定化酶的思想被首次提出㊂随后,研究人员开始通过一系列酶固定化技术来改善游离酶存在的缺点㊂酶固定化技术就是指将游离酶通过一定的技术手段固定在某些不溶性载体上,进而使其在敏感环境下仍然表现出较高的稳定性和酶活性[4]㊂经固定化后的酶,可以借助载体的保护作用或者与载体之间相互作用,保护了酶蛋白的空间构象[5],进而提高了对p H㊁温度㊁重金属离子等影响因素的耐受性㊂同时,固定化酶可以通过简单的离心过滤等手段从反应体系中分离出来,促进漆酶的回收和重复使用[6]㊂目前,固定化酶技术已经在食品加工[7]㊁生物传感器[8]㊁纺织印染废水处理[9-10]㊁生物漂白[11]等诸多领域得到广泛的应用,其固定化技术也表现出愈发成熟的发展㊂本文综述了近五年酶固定化技术的发展,重点表现在固定化方法和固定化载体上,以及酶固定化技术在多个领域的应用㊂1酶固定化方法酶固定化方法可分为传统固定化方法和新型固定化方法㊂表1列出来近五年的一些酶固定化技术所用的方法㊂表1固定化酶所用固定化方法T a b.1I mm o b i l i z a t i o n m e t h o d s u s e d i n d i f f e r e n t i mm o b i l i z a t i o n t e c h n i q u e s固定化方法固定化对象载体材料参考文献传统固定化方法吸附法漆酶/α-淀粉酶生物炭/复合晶凝胶[12-13]共价结合法脂肪酶M I L-53(F e)/球形S i O2[14-15]化学交联法漆酶/葡萄糖淀粉酶磁性纳米粒/纳米S i O2[16-19]包埋法漆酶海藻酸铜微球[20]新型固定化方法吸附-交联法脂肪酶/β-葡糖糖苷酶大孔树脂/纳米S i O2[21-22]吸附-包埋法多种酶/纤维素酶多孔淀粉-阿拉伯胶微囊体/仿生S i O2[23-24]交联-包埋法漆酶聚集体介孔S i O2[25]脂肪酶/磷脂酶聚乙烯亚胺[26]共固定法葡萄糖淀粉酶/葡萄糖氧化酶S i O2[27]葡萄糖氧化酶/辣根过氧化物酶磁性聚乙二醇微凝胶颗粒[28]1.1传统固定化方法1.1.1吸附法吸附法即物理吸附,物理吸附是一种简单易行的方法,通过氢键㊁疏水作用和范德华力等相互作用48西安工程大学学报第38卷使酶吸附到不溶于水的载体表面,该方法操作步骤简洁且不需要额外添加化学试剂,但其固定效果较差且容易受外界条件影响[29]㊂WA N G等采用吸附法将漆酶固定在碱改性生物炭(A-M B)上实现对孔雀石绿(MG)的吸附降解,结果表明,A-M B对MG 表现出最大吸附量757.58m g/g,固定化漆酶A/l a c @A-M B对MG的去除率可达97.70%,10次循环后仍然表现出超过75%的去除率[12]㊂A C E T等以沸石颗粒(P P A)为原料,通过简单方法制备了C u2+-A P P a C包埋型复合晶凝胶(C u2+-A P P a C)用于α-淀粉酶吸附固定,结果表明,α-淀粉酶最大吸附量可达858.7m g/g,同时相较于游离酶,其操作稳定性和存储稳定性也表现出明显的优势[13]㊂1.1.2结合法结合法是利用酶的侧链基团与载体表面的基团发生反应形成共价键,利用共价键将酶固定在载体上[30]㊂G H A S E M I等将M I L-53(F e)通过表面官能化对2种脂肪酶进行共价固定,结果显示脂肪酶固定化体系虽然没有实现对酶的高负载,但仍然表现出更广泛的温度和p H值稳定性,同时实现了酶的可重复使用能力和稳定性的显著改善[14]㊂此外,共价结合法由于化学键的形成,容易使酶的蛋白质构象发生改变,从而降低酶活性[31]㊂F A N等采用戊二醛多点共价结合法和吸附-交联法,以球形二氧化硅为载体,固定化皱纹假丝酵母脂肪酶(C R L),结果表明,多点共价处理后脂肪酶二级结构发生变化,使酶的残余活力下降[15]㊂但相比之下,共价结合法制备的酶体系具有更好的重复使用性和稳定性,使其在酸化油脂催化水解中更有潜力㊂1.1.3化学交联法交联法是通过一些双功能试剂将酶和载体进行连接[31],主要用到的交联剂有戊二醛㊁1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(E D C)㊁二醛淀粉和二醛纤维素[30,32-33]等㊂C H E N等以戊二醛作为交联剂制备了一种具有超顺磁性的固定化漆酶F e3O4@S i O2-N H2-L a c,该固定化体系表现出了良好的稳定性,对有机溶剂㊁金属离子有显著的耐受性和良好的循环使用性,同时在对酚类化合物的去除降解方面也表现出巨大的潜力[16]㊂Q I U等以二醛淀粉为交联剂,采用共价固定法将漆酶在离子液体改性的磁性纳米载体上进行固定,较于其他固定化漆酶,在处理含酚废水中表现出更大优势[17]㊂然而常见的交联剂在固定化过程往往会表现出一定的负面影响[34],为此研究人员着手发掘绿色安全的新型交联剂来避免这种负面影响㊂例如,O U Y A N G等提出了一种新的绿色高效固定化酶的方法 京尼平苷酶解物作为交联剂固定化漆酶[18]㊂与直接使用京尼平或戊二醛作为交联剂,该方法绿色㊁安全,可应用于需要严格控制毒性的食品和医药行业㊂D A N I E L L I等研究了一种双功能交联剂2,5-二甲酰基呋喃(D F F)将葡糖淀粉酶固定在氨基官能化甲基丙烯酸树脂上[19]㊂使用海洋细菌费氏弧菌进行了生态毒性测定,相比于戊二醛,D F F表现出更低的生物毒性㊂1.1.4包埋法包埋法是将酶固定在聚合物材料的网格结构或微囊结构等多空隙载体中[35]㊂这种方法可以提供更好的保护和稳定性,限制了酶的扩散㊂但同时也存在孔隙的扩散阻碍,使得该方法的循环使用效率下降㊂例如,L A T I F等采用包埋法将漆酶固定化在海藻酸铜微球上进行双酚A的降解[20]㊂相比于游离酶,固定化漆酶表现出更高的p H㊁温度稳定性及储存稳定性,但在循环使用5次后剩余酶活降到了21.5%㊂1.2新型固定化方法1.2.1传统固定化方法的改进传统的单一固定化方法进行酶固定往往存在各自的缺点,因此出现了将单一方法进行两两结合来固定化酶的改进方法㊂常见的包括吸附-交联法[21-22]㊁吸附-包埋法[23-24]㊁交联-包埋法[25]等㊂例如,F A T H A L I等以介孔二氧化硅为载体,采用交联-包埋相结合的固定化方法制备了包埋交联漆酶聚集体(E-C L E A)[25]㊂相对于游离漆酶,条件优化后的固定化漆酶显示出较好的热稳定性和p H稳定性㊂此外E-C L E A存储21d仍然具有较高的相对活性,在重复使用20次后,其活性保持率可达初始活性的79%㊂对污染废水中苯酚的去除率可达73%[25]㊂1.2.2共固定化酶法共固定化酶是指将多种酶同时固定化在同一载体上的一种方法㊂A R A N A-P EÑA等实现了将5种酶进行逐层固定化的策略,使得整个固定化酶体系的活性明显增强[26]㊂与单一酶的固定化相比,共固定化酶法通常具有更大的优势㊂在保证了固定化后酶稳定性提高的同时,不同酶在共固定后,由于处于58第1期潘虹,等:酶固定化技术的最新研究进展同一载体上,酶之间可以发挥协同作用,且反应底物可以连续在酶之间传递,从而简化了反应步骤㊂G A O等制备了一种化学酶级联反应体系(G A&G O x@A u-S i O2),实现葡萄糖淀粉酶(G A)和葡萄糖氧化酶(G O x)共固定化[27]㊂借助于双酶和载体之间的级联效应,实现了从可溶性淀粉中高效提取葡萄糖酸㊂在保证了固定化双酶稳定性的同时,A u的加入可以使中间产物H2O2快速脱除,显著提高固定化体系的重复利用率㊂类似地,L I U等制备了一种具有可逆热响应释放的双酶固定化体系共固定G O x和辣根过氧化物酶(H R P),在葡萄糖浓度检测过程中表现出优于单酶检测试剂盒的良好性能[28]㊂此外,有学者研究发现,对于如漆酶这种绿色催化剂,较低的氧化还原电位大大限制了其在各个领域中的应用㊂但发现在固定化体系中引入具有高氧化还原电位的介体可以弥补漆酶的这一不足[36]㊂L O U等基于MO F s膜实现了漆酶和介体A B T S的共固定化,结果显示,固定化漆酶的底物亲和力要高于游离漆酶[37]㊂2酶固定化载体用于酶固定化的载体主要包括天然载体㊁人工合成载体和纳米载体,见表2㊂在选择固定化载体时要充分考虑具体的应用领域和需求等㊂表2固定化酶所用载体材料T a b.2 C a r r i e r s f o r i mm o b i l i z e d e n z y m e材料类别载体材料固定化对象固定化方法参考文献天然材料羧甲基纤维素漆酶包埋法[38]琼脂糖脂肪酶吸附法[39]磁性壳聚糖葡萄糖氧化酶共价结合法[40]藻酸盐脱氢酶/蛋白酶吸附法/包埋法[41-42]壳聚糖-黏土复合微球漆酶+介体包埋法[43]海藻酸钠-壳聚糖中性蛋白酶包埋法[44]人工合成材料改性二氧化硅乳酸脱氢酶/碳酸酐酶/甲酸脱氢酶化学交联法/共价结合法[45-47]二氧化钛漆酶吸附法[48]硅酸盐漆酶/葡萄糖氧化酶吸附-共价结合法/吸附法[49-50]氧化铝漆酶共价结合法[51]聚酰胺-胺树枝状大分子脂肪酶化学交联法[52]聚乙烯醇水凝胶-硅胶烯还原酶包埋法[53]二氧化硅-壳聚糖漆酶共价结合法[54]纳米材料磁性纳米粒子漆酶共价结合法[55]金属有机框架MO F s漆酶化学交联法[56]介孔Z I F-8过氧化物酶化学交联法[57]中空微球漆酶吸附法[58]共价有机框架C O F葡萄糖氧化酶+F e3O4吸附法[59]金属酚醛网络M P N酒精脱氢酶吸附法[60]磁性纳米颗粒漆酶+介体A B T S吸附法[61]2.1天然载体材料天然载体最大的优点就是来源广泛㊁低成本和低生物毒性㊂常用的天然载体有纤维素[38]㊁琼脂糖[39]㊁壳聚糖[40]和藻酸盐[41-42]等㊂同时,将天然载体杂化后用于酶固定化可以表现出更优良的固定化能力㊂M E H A N D I A[43]等利用天然载体制备了壳聚糖-黏土复合微球(C C B-L),采用包埋法对漆酶和介体进行共固定㊂微球在洗涤和储存期间均未观察到酶泄漏㊂同时固定化漆酶-介体体系通过填充床反应器系统(P B R S),对纺织废水的脱色率可达78%,C O D㊁B O D以及毒性水平均下降㊂类似地, B A I等将海藻酸钠和壳聚糖交联形成复合凝胶球,采用包埋法固定中性蛋白酶[44]㊂固定化酶在较宽的p H(5~8)和温度(30~80ħ)范围表现出高于游离酶的相对活性,循环使用性和存储稳定性也保持在良好水平㊂68西安工程大学学报第38卷2.2人工合成载体材料2.2.1无机材料无机材料来源广泛㊁合成简单㊁机械强度高,可以直接用于酶的固定㊂常见的无机材料有二氧化硅[45]㊁二氧化钛[48]㊁硅酸盐[49-50]和氧化铝[51]等㊂为了提高固定化效率,常常会先对无机材料进行表面改性再用于固定化㊂Z H A I等使用聚乙烯亚胺(P E I)和多巴胺的共沉积对二氧化硅微球进行改性,用于C O2酶促转化甲酸盐㊂优化后P D A/P E I-S i O2载体使得甲酸盐合成的初始反应速率从13.4倍增加至27.2倍㊂再通过固定化碳酸酐酶(C A)后,甲酸盐的合成速率增加到48.6倍[46]㊂随后,L I U等同样对S i O2微球进行P E I的表面改性后用来固定化甲酸脱氢酶,同样实现了C O2酶促转化甲酸盐的高效合成[47]㊂2.2.2高分子材料人工合成的高分子材料具有良好的结构刚性和其他优良的力学性能㊂如聚酰胺㊁聚乙烯醇等具有良好的固定化能力㊂Z H A O等采用3种胺类试剂将聚酰胺-胺树枝状大分子(P AMAM)接枝到F e3O4纳米粒子上,利用戊二醛作为交联剂得到了不同代数的F e3O4@S i O2/P AMAM磁性纳米载体[52]㊂固定化酶表现出相对游离酶更高的活性,而且改善了其在更宽的p H和温度范围内的耐受性㊂A L A GÖZ等先用聚乙烯醇水凝胶包裹烯还原酶(E R),再固定到氨基官能化的硅胶上㊂包埋后的E R比游离E R的热稳定性高34.4倍㊂在重复使用10次后,固定后的E R仍保持其初始活性的85%[53]㊂2.2.3复合材料针对有机㊁无机材料在实际应用中存在的不足,不少文献报道了将2类材料通过物理或化学手段进行复合得到新型复合材料,可以得到性能更优的固定化载体㊂例如,G I R E L L I等将二氧化硅和壳聚糖杂化得到复合材料,相比单材料拥有更好的机械强度㊁热稳定性及生物相容性㊂存储30d后仍具有大于70%的相对活性㊂对漆酶进行固定化后,固定化率达到92%,在较宽的温度和p H范围内固定化后漆酶表现出的稳定性也要高于游离漆酶,重复循环利用15次剩余活性仍在61%以上[54]㊂2.3纳米材料载体纳米材料凭借其小尺寸㊁高表面积和易改性等特点,成为了酶固定化载体研究的焦点㊂各种改性后的纳米材料也在酶固定化领域得到蓬勃发展㊂2.3.1磁性纳米载体磁性纳米载体是一种可以通过外部磁场实现固定化酶快速分离的良好材料㊂凭借这种磁学性质和低生物毒性[16],其在固定化载体的选择上表现突出㊂F e3O4是被广泛使用的一种磁性材料㊂但由于纯F e3O4自身的表面惰性和高团聚,往往需要对其进行表面改性后再应用于固定化㊂R A N等制备了一种壳核结构的磁性纳米载体F e3O4@M o S2@P E I 用于漆酶固定㊂在二硫化钼(M o S2)和聚乙烯亚胺(P E I)的修饰下,磁性载体拥有较大的比表面积并减弱了自身团聚效应,对漆酶的负载量可达120m g/g,酶活回收率可达90%,同时对于水中持久性致癌有机污染物也表现出了良好的降解效率[55]㊂2.3.2介孔纳米载体介孔材料作为一种多孔材料,凭借多孔结构和大的比表面积,也是酶固定化的理想载体㊂金属有机框架(MO F s)[56]凭借着可调控的孔径和较大的比表面积在酶固定化方面得到广泛应用㊂L I等采用水热法合成氨基官能化的MO F材料制备固定化漆酶,在最优条件下实现了95%的刚果红去除率,6次循环后降解率仍达到84.63%[56]㊂L U等以酵母为生物模板,将Z I F-8自组装到酵母上得到杂合Y@ Z I F-8,再用交联剂固定过氧化物酶得到Y@Z I F-8 @t-C A T㊂固定化酶的温度㊁p H耐受性得到提高,更值得一提的是固定化酶在存储45d后活性仍保持在99%以上[57]㊂除此以外,T A N G等还制备了具有中空结构的共价有机骨架微球(H-C O F-OM e)[58]㊂这种孔缺陷的中空结构有助于加快反应物的扩散,从而改善催化反应过程,对四环素具有优秀的降解效果㊂2.3.3金属纳米载体金属纳米材料由于引入了金属离子,可以提高载体的理化性质,在酶固定化过程中表现出重要作用㊂F U等将F e3+/F e2+固定到纳米花形的共价有机框架(C O F)中实现了固定化酶的磁分离[59]㊂L I 等研究了以磁性F e3O4为核,将单宁酸(T A)与不同类型金属离子(C u㊁F e㊁Z n㊁M n㊁A u)配位获得了用于固定化的金属酚醛网络(M P N)涂层[60]㊂不同金属离子的不同极化能力对M P N涂层的亲水性和疏水性造成影响,从而给酶的固定化效率㊁催化活性78第1期潘虹,等:酶固定化技术的最新研究进展和稳定性带来影响㊂对于漆酶而言,引入C u2+对漆酶的活性中心具有正向的促进作用,可以大大提高固定化漆酶的催化活性和底物亲和力[61]㊂3结论与展望生物酶作为一种极具潜力的生物催化剂,通过固定化技术使其在污染物的降解㊁食品加工㊁生物传感器等诸多领域得到了广泛应用㊂酶固定化技术促使酶在较宽的p H值和温度范围下表现出更优良的催化活性,大大提高了生物酶在敏感环境下的稳定性,实现了生物酶的可分离性及循环使用性㊂但目前看来,酶固定化技术依然存在一些不足㊂1)酶在固定化后,由于载体的存在使得底物扩散受阻,无法与酶充分接触,导致酶活性降低㊂可以通过基因工程技术从酶本身出发,利用定点突变或基因重组改变酶结构来提高酶活㊂同时,通过掺杂合适的单一过渡金属离子或多金属离子协同作用激发酶活也值得深入研究㊂2)目前固定化酶技术在污染物降解等领域的实际应用已经颇为成熟,但对于更深层次的作用机制还停留在较为浅薄的层面㊂在未来,随着生物信息技术的不断发展,将固定化酶技术与计算机模拟技术交叉,利用计算机软件模拟分析更深层次的机制原理,可以更好地掌握酶固定化技术㊂3)酶固定化技术仍处在实验室研究阶段,在实现更大规模的工业化应用仍然存在较大的挑战㊂同时,考虑到有些固定化载体制备的时间成本和资金成本,载体若仅用于一次固定化后就无法回收再利用就会造成过度浪费㊂如何实现固定化酶失活后固定化载体与酶的高效分离,从而实现载体的循环使用是一个新的挑战㊂因此,酶固定化技术仍然处在不断发展进步的阶段,需要更多的科研者来完善研究㊂参考文献(R e f e r e n c e s)[1]刘茹,焦成瑾,杨玲娟,等.酶固定化研究进展[J].食品安全质量检测学报,2021,12(5):1861-1869.L I U R,J I A O C J,Y A N G L J,e t a l.A d v a n c e s o f e n-z y m e i mm o b i l i z a t i o n[J].J o u r n a l o f F o o d S a f e t y&Q u a l i t 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1引言随着科学技术的不断发展和人们生活水平的提高，制造的废物垃圾越来越多，对环境造成了严重破坏。

自然界中的微生物种类繁多，起着物质转化与降解作用，是整个生态系统的重要组成部分之一，将微生物应用到环境污染治理中，可以实现垃圾的无害化降解和污染的有效治理，在废水中投入微生物可以有效降解废水中的污染物，达到利用微生物进行环境治理保护的目的。

2固定化酶技术在环境工程中的应用2.1进行环境污染物的监测科学技术的发展对水环境造成了很大程度的污染与破坏，极大地危害水体周围人们的健康和安全，因此，要加大对有关水体的检测工作，保障水体的安全性和可靠性。

固定化酶技术的应用可以有效提升环境污染物监测的准确性，缩短检测使用的时间，使检测效率大大提高。

利用固定化酶制定的酶反应器可以直接进行环境污染物的监测，也可以在固定化酶技术的基础之上，辅助应用传感器技术提高检测的灵敏性。

酶反应器与传统的检测手段相比，成本更低，灵敏度更高，体积小，携带方便，特异性强，在水体环境的检测过程中有十分广泛的应用。

此外，酶反应系还可以应用于农药的检测，研究人员利用固定化乙酰胆碱酯酶制成检测设备，可以快速准确地检测蔬菜样品中的农药残留情况[1]。

2.2固定化酶应用于有机废水处理工作水体污染工作一直无法得到有效治理的一个主要原因是缺乏系统科学的废水处理与治理手段，由于废水成分相对比较复杂，波动性较大，只选取一种或单独几种固定化酶往往无法很好地实现水体中垃圾的降解，所以一般采取组合使用的方法，使污染物能够得到有效处理。

根据实际固定化酶的应用案例来看，多种固定化酶联用的效果要远远强于单一固定化酶，但从实际污水处理活动中来看，固定化酶处理方法相对来说投入成本较高，而且固定化酶寿命较短，机械强度较差，本身也容易变质，影响固定化酶在污水处理中的应用效果[2]。

污水处理中常用的固定化酶包括漆酶酪氨酸酶、辣根过氧化物酶等，这些酶具有较强的降解能力，可以有效降解废水环境工程中固定化酶与固定化微生物的应用初探Exploration on the Application of Immobilized Enzyme andImmobilized Microorganism in Environmental Engineering李强（重庆市环境保护工程设计研究院有限公司，重庆400020）LI Qiang(ChongqingEnviromentEgineeringAcademyCo.Ltd.,Chongqing400020,China)【摘要】随着社会经济的不断发展，对环境造成的破坏也越来越大，严重影响人们的生活环境，制约着人类和经济的可持续发展。