病原菌的分离鉴定及其疫苗的制备(2)

实验二植物病原菌的组织分离实验二植物病原菌的组织分离、培养和纯化一、实验目的通过本次实验学习植物病原菌分离培养及纯化的原理和常用的方法。

二、材料和用具玉米大斑病叶、灰斑病叶、苹果果实轮纹病及霉心病、甘薯黑斑病等材料，5%次氯酸钠溶液（有效氯为5%，见光分解，尤其紫外光，现用现配），75%酒精，剪刀，镊子，无菌水，灭菌培养皿，保鲜膜封口膜，记号笔、解剖刀，75%酒精小喷壶、酒精灯，打火机、、无菌滤纸、酒精棉、培养皿三、分离材料的选择为减少腐生菌的污染，分离所用的病害材料应尽可能新鲜，并且最好在病、健交接处选材取样。

病、健交接处，除材料新鲜，污染的可能性小外，病原菌的生活力强、比较活跃，容易分离成功。

四、植物病原菌的分离方法病原菌分离的方法因材料不同而异，植病实验室最常见的方法有组织分离法和稀释分离法两种。

（一）.组织分离法：这种方法适用于大部分病菌的分离，此法又分为小块组织分离和大块组织分离两种方法。

1、病斑类病原菌的分离（玉米大斑病病、灰斑病及苹果果实轮纹病的分离、甘薯黑斑病）（1）将无菌培养皿、镊子、无菌水、无菌滤纸、75%酒精小喷壶等放入无菌操作台，开紫外灯15分钟。

期间融化培养基备用。

（2）在操作台外，用酒精消毒双手，晾干。

在操作台内再次消毒双手，晾干，将融化并冷却到50℃左右的PDA以无菌操作倒入培养皿8—10ml，在桌面上轻轻摇动，敞开盖，制成平，凝固后待用。

（3）在操作台外，取分离材料，在病、健交界处剪取2—3毫米长的病组织。

（4）在无菌条件下，用5%的次氯酸钠溶液消毒3-5min，（时间长短依病组织不同而异，处理种子约5—10分钟）。

（5）用经过三次火焰灭菌的镊子将消毒的病叶移至无菌水中，漂洗3次，在滤纸上吸干水分，移至PDA平板培养基上，每皿可放均匀放3~4片，使材料与培养基紧密接触。

倒置于25—28℃恒温箱内培养。

（6）3~4天后，待菌落长出后挑取前缘菌丝，回接于PDA培养基上，在25℃温箱中培养，待菌落颜色变深后，在无菌条件下镜检是否是玉米大斑病菌、灰斑病菌、黑斑病菌、轮纹病菌，若仅有这几种病原菌的分生孢子，则说明已获得了纯培养，否则，则需要继续转至斜面培养基上进行纯化，直至获得纯培养。

如何进行病原菌的分离如何进行病原菌的分离、纯培养材料用具菌种：米曲酶枯草芽孢杆菌大肠杆菌金黄色葡萄球白地霉蕈状芽孢杆菌（Bacillus mycoides）粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）巴氏芽孢梭菌（巴氏固氮梭状芽孢杆菌，Clostridum pasteurianum）荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）灰色链霉菌（Streptomyces griseus）酿酒酵母产黄霉菌（Penicillium chrysogenum）培养基：淀粉琼脂培养基牛肉膏蛋白胨培养基(斜面、液体、半固体) 马丁氏琼脂培养基查氏琼脂培养基庖肉培养基肉汤培养基马铃薯培养基麦芽汁酵母膏培养基溶液或试剂：10%酚，盛9ml无菌水的试管，盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶，4%水琼脂，10%NaOH,灭菌的石蜡凡士林（1：1），焦性没食子酸，液体石蜡，甘油，五氧化二磷，河沙，瘦黄土或红土，95%乙醇，10%盐酸，无水氯化钙，食盐，干冰。

仪器或其他用具：无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接种环，无菌培养皿，链霉素和土样，显微镜，血细胞计数板，接种针，酒精灯，棉花，厌氧罐，催化剂，产气袋，厌氧指示袋，无菌的带橡皮塞的大试管，无菌的玻璃板（直径比培养皿大3至4cm），滴管，烧瓶，小刀。

微生物的分离与纯化：一、基本原理从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。

常用的方法有1.简易单细胞挑取法：它需要特制的显微操作器或其他显微技术，因而其使用受到限制。

简易单孢子分离法是一种不需显微单胞操作器，直接在普通显微镜下利用低倍镜分离单孢子的方法。

它采用很细的毛细管吸取较稀的萌发的孢子悬浮液滴在培养皿盖的内壁上，在低倍镜下逐个检查微滴。

将只含有一个萌发孢子的微滴放一小块营养琼脂片，使其发育成微菌落。

再将微菌落转移到培养基中，即可获得仅由单个孢子发育而成的纯培养。

2.平板分离法：该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化。

病原菌分离实验报告一、实验目的本次实验旨在从临床样本中分离和鉴定病原菌，为疾病的诊断和治疗提供准确的病原学依据。

通过实验，掌握病原菌分离的基本方法和技术，熟悉常见病原菌的形态特征和培养特性。

二、实验材料1、临床样本：包括血液、尿液、痰液、粪便等。

2、培养基：血琼脂平板、麦康凯琼脂平板、巧克力琼脂平板等。

3、试剂：革兰氏染色液、氧化酶试剂、触酶试剂等。

4、仪器设备：显微镜、培养箱、接种环、酒精灯等。

三、实验方法1、样本采集与处理血液样本：采集患者静脉血，注入血培养瓶中，立即送实验室进行培养。

尿液样本：收集中段尿，离心后取沉淀进行培养。

痰液样本：患者清晨深部咳痰，经生理盐水洗涤后，制成均匀的混悬液进行培养。

粪便样本：挑取脓血或黏液部分，制成混悬液进行培养。

2、接种培养用接种环取处理后的样本，分别划线接种于不同的培养基上。

将接种后的培养基放入 35℃培养箱中培养 18 24 小时。

3、观察菌落形态培养结束后，观察培养基上菌落的形态、大小、颜色、边缘、质地等特征。

4、涂片染色镜检挑取可疑菌落，制作涂片，进行革兰氏染色。

在显微镜下观察细菌的形态、排列方式等。

5、生化鉴定根据细菌的染色结果和形态特征，选择相应的生化试验进行鉴定。

如氧化酶试验、触酶试验、糖发酵试验等。

四、实验结果1、血液样本培养结果：在血琼脂平板上生长出圆形、凸起、表面光滑、湿润的菌落，有溶血现象。

染色镜检：革兰氏阳性球菌，呈葡萄串状排列。

生化鉴定：触酶阳性，能发酵葡萄糖、麦芽糖，初步鉴定为金黄色葡萄球菌。

2、尿液样本培养结果：在麦康凯琼脂平板上生长出粉红色、光滑、湿润的菌落。

染色镜检：革兰氏阴性杆菌，短杆菌。

生化鉴定：氧化酶阴性，能发酵乳糖，初步鉴定为大肠埃希菌。

3、痰液样本培养结果：在血琼脂平板上生长出扁平、干燥、表面粗糙的菌落。

染色镜检：革兰氏阳性杆菌，有分枝。

生化鉴定：触酶阴性，能分解尿素，初步鉴定为结核分枝杆菌。

4、粪便样本培养结果：在麦康凯琼脂平板上生长出无色、半透明、圆形的菌落。

四川农业大学论文植物病理学姓名：代妮专业：植物保护班级：10级2班学号：201004602012/6/25病原物分离培养、纯化和人工接种病原物的分离培养、纯化和人工接种内容摘要：本实验以辣椒炭疽病和茶叶斑病为材料，采用组织分离法分别对其病原真菌进行分离培养、纯化和，再用针刺接种法对其进行人工接种。

以柯赫氏法则（Koch’s Postulate）为依据，对辣椒炭疽病和茶叶斑病病原进行鉴定。

全过程拟分步实验完成，第一步完成PDA培养基的配置、分装、灭菌、斜面及平板培养基的制作；第二步采用组织分离法，在PDA平板培养基的四个方向上各放置一片病组织块（进行升汞消毒时间分别为10s、15s、20s、25s四个时间梯度），完成病原真菌的分离，并置于恒温箱内进行培养，3-4天后观察菌落生长情况，发现每个方向都长出菌落，但消毒25s的菌落生长最为茂盛，挑取生长最茂盛的菌落转移至斜体中进行纯化培养;第三步完成辣椒炭疽病原的针刺接种，定期观察感病辣椒症状,发现与所取辣椒病组织材料症状相同。

关键词：辣椒炭疽病茶叶斑病病原物PDA培养基分离培养纯化人工接种正文：1 目的要求通过本次实验学习植物病原菌分离培养的原理和常用方法，学习常用的接种方法，掌握根据柯赫氏法则鉴定植物病原物的方法。

2 用具、试剂与材料2·1用具：手提式高压蒸汽灭菌锅、电炉、天平、铁架台、灭菌培养皿、250mL 锥形瓶、漏斗、试管、2000mL烧杯、小烧杯、移液管、止水夹、石蕊试纸、乳胶管、报纸、棉花、医用纱布、解剖剪、接种环、酒精灯；2·2试剂与材料：马铃薯、琼脂、葡萄糖（或蔗糖）、NaOH溶液、盐酸、漂白粉、70%酒精、升汞；茶叶斑病病叶、辣椒炭疽病果实3 内容方法3·1培养基的配置真菌和细菌等微生物与其他生物一样，生长和发育都需要一定的营养条件。

不同类群的微生物对营养条件的要求不同。

因此，在人工培养微生物时，就必须考虑它们的营养要求。

兽医微生物学实验复习题1、兽医微生物实验室注意事项是什么？答：①防止病原微生物的散布；②防火；③节约；④标记；⑤记录；⑥安全；⑦清洁与秩序2、观察细菌常用什么显微镜？它主要有哪几部分组成？答：光学显微镜光学部分:目镜、物镜、反光镜、聚光器；机械部分：镜座、镜臂、镜筒、粗调节器、细调节器。

3、油镜用毕后，为什么必须把油镜擦净？答：油镜的原理是通过香柏油的光路折射能更加清晰的观察微生物，油具有粘附性，且不溶于水，所以，在观察完后，香柏油会粘附在镜头上，不擦去的话，风干后镜头就变得模糊不清，甚至报废了，又因为是油所以简单的用擦镜纸擦拭是擦不干净的，二甲苯属于有机溶剂，4、用过多的二甲苯或酒精乙醚混合液擦拭镜油有什么危害？答：过多的二甲苯或酒精乙醚混合液容易脱胶，使油镜脱落。

5、使用油镜时用什么作为物镜与玻片间的介质，有几种？答：可用与玻璃的折光系数相近的油类，有7种，如柏木油。

6、观察细菌时显微镜的操作步骤是什么？主意事项是什么？答：将显微镜物镜镜头转为油镜对好光线（开高集光器，开大光圈，调好反光镜）使亮度最强在载物台上放上载玻片，并在玻片上放一滴香柏油将标本移至载物台正中转动粗准焦螺旋，使油镜浸入油滴中左眼由目镜注视镜内，慢慢地转动细准焦螺旋，直至物像清晰为止注意事项：1.调节粗准焦螺旋的时候要慢2.观察完后要用二甲苯擦拭油镜7、微生物绘图要求有哪些？答：①绘出一个视野，圆形。

②细菌大小比例合理，必须标明名称。

③标名显微镜的放大倍数，标明菌名。

④绘图一律用铅笔。

8、制备细菌染色标本片时应注意哪些事项？答：①干燥好的抹片固定时，使抹面向上，以其背面在酒精灯外焰上如钟摆样来回拖动过数次，略作加热，但不能太热，以不烫手为度进行固定。

9、涂片固定的意义何在？固定时应注意什么问题？有哪些固定方法？答：意义：涂片固定可将涂片上的细菌杀死，使之固定而不会到处漂移，并且死菌比活菌更容易着色，为后面染色做准备。

注意：若用火焰固定时，抹面向上，以其背面在酒精灯外焰上如钟摆样来回拖动过数次，略作加热，但不能太热。

细菌的分离培养与接种技术绝大多数细菌在适宜的条件下可以生长，细菌感染性患者标本只有经过细菌的分离培养、鉴定和药物敏感试验，才可对感染性疾病进行病原学诊断并指导临床用药。

因此，细菌培养对疾病的诊断、预防和治疗具有重要的作用。

细菌分离培养主要用于临床标本(如血液、痰、粪便等)或培养物中有多种细菌时对某一种细菌的分离。

通过分离，可使细菌在平板上分散生长，便于观察单个菌落特性，也易于挑取单个菌落，进行生化鉴定。

一、基本条件细菌分离培养的基本条件包括接种用具(接种环、接种针)、培养箱、培养基，以及无菌室和超净工作台等。

(一)接种用具包括接种环和接种针两类。

接种环用来挑取标本、菌液及平板划线等。

接种针则用来挑取单个菌落，穿刺高层琼脂等。

接种环(针)由环(针)、金属柄和绝缘柄3部分组成，环(针)一般采用铂丝制作最佳，其硬度适宜，易于传热，火焰灭菌后冷却快，经久耐用。

但因其价格昂贵，目前多用电热(镍)丝及l次性塑料接种环代替。

接种环的直径一般为2～4mm，长5～8cm，定量接种环容量为1/300ml、1/200ml、1/100ml，用于定量培养。

(二)培养箱1．普通培养箱可自动调节培养温度(一般为35～37℃)，用于培养普通需氧或兼性厌氧菌。

2．二氧化碳培养箱可自动调节二氧化碳浓度(一般为5％～l0％)和培养温度，用于分离培养嗜血杆菌和奈瑟菌等生长时需二氧化碳的细菌，尤其是初次分离培养时。

如无二氧化碳培养箱时，也可用烛缸法代替。

3．厌氧袋、厌氧罐(盒)和厌氧手套箱用于分离培养厌氧菌。

厌氧袋为透明的、不透气的塑料袋。

厌氧罐为密封的塑料或玻璃罐(盒)，可用物理或化学方法去除袋、罐中的氧气，达到无氧状态。

厌氧手套箱则可通过换气装置快速达到、持续保持无氧状态，并自动调节培养温度，还可通过手套在箱内进行分离接种、生化鉴定等操作。

(三)培养基培养基(culture medium)是由人工方法配制而成的，适合微生物生长繁殖使用的混合营养物制品。

鸡大肠杆菌灭活疫苗制备2.西藏山南扎囊县农牧综合服务中心摘要:随着规模化养鸡业的迅速发展，鸡大肠杆菌病的发生和流行日益严重，几乎遍布所有的商业鸡场，给养鸡业带来很大的经济损失。

为了预防该病的传染，作者制备了鸡大肠杆菌病灭活疫苗。

制备了氢氧化铝胶佐剂和培养基，鸡大肠埃希氏菌的菌液培养、纯粹检验、活菌计数、灭活及无菌检验。

鸡大肠埃希氏菌病灭活疫苗:经无菌检验为阴性;经物理性状检验为:静置后上层是淡黄色的澄明液体，下层为灰白色沉淀，振荡后呈均匀混浊液;经鸡安全检验结果为安全;经鸡效力试验有效。

本病无论是药物预防还是疫苗的生物防治，都不是防治此病的根本方法。

要想减少或者杜绝大肠杆菌病的发生率，必须采取加强饲养管理、搞好环境卫生、严格消毒等综合防治措施才行。

鸡大肠埃希氏菌病灭活疫苗的制备，以及疫苗的无菌检验、物理性状检验、安全检验、效力检验等，其结果符合兽用生物制品检验的有关规程。

该疫苗是安全有效的。

鸡大肠杆菌灭活疫苗为免疫预防该病打下了良好的基础。

关键词:鸡，大肠杆菌，灭活疫苗鸡大肠杆菌病是由病原性大肠埃希氏杆菌引起的禽类传染病,由于大肠杆菌在自然界广泛分布，也是禽肠道的正常菌群[3]。

经常可从健康鸡的肠道中分离出致病性大肠杆菌血清型，表明大肠杆菌是条件致病菌或引起继发感染。

禽舍中的粪便和灰尘是致病性大肠杆菌的重要来源，细菌经呼吸道、消化道、种蛋等途径使禽发生感染。

各种年龄的家禽对大肠杆菌都能感染，但多发生于幼龄家禽，特别是雏鸡的发病率和病死率均较高。

近年来，随着规模化养鸡业的迅速发展，鸡大肠杆菌病的发生和流行日益严重，几乎遍布所有的商业鸡场，给养鸡业带来很大的经济损失。

同时，由于血清型众多和滥用抗生素导致耐药菌株的大量出现，使药物控制的难度越来越大，疫苗免疫接种成为有效的预防途径。

从西藏农牧学院实习牧场分离出的致病性鸡大肠埃希氏菌产生肠毒素。

将产肠毒素大肠杆菌称为(Enterotoxigenic E.coli,ETEC)[1]。

副猪嗜血杆菌分离鉴定及其灭活苗的研制的开题报告
题目：
副猪嗜血杆菌分离鉴定及其灭活苗的研制
问题描述：
副猪嗜血杆菌是一种引起猪弧菌病的病原菌，严重威胁了猪的健康和猪肉的质量安全。

本研究旨在通过分离鉴定副猪嗜血杆菌，研发一种环保、高效的灭活苗，为猪
病防治提供有力保障。

研究内容：
1.采样和副猪嗜血杆菌的分离鉴定。

收集不同地区和不同猪场的猪血样本，利用大肠杆菌染色和生化实验，筛选并鉴定出副猪嗜血杆菌。

2.副猪嗜血杆菌的灭活方法研究。

研究不同灭活方法对副猪嗜血杆菌的杀伤效果，包括热灭活、化学灭活和辐射灭活等。

3.副猪嗜血杆菌灭活苗的制备。

研究灭活苗的适宜配比、接种剂量和免疫程序，并进行动物实验，评价其保护效果和安全性。

4.副猪嗜血杆菌灭活苗的应用实践。

将研制出的灭活苗应用于猪场，观察其在猪群中的控制效果和经济效益。

研究意义：
本研究旨在解决副猪嗜血杆菌病防治问题，为猪肉质量安全和养猪业健康发展提供有力支持。

同时，本研究将探索一种新的灭活苗制备方法，为病原菌灭活苗的研究
提供参考。