粒细胞缺乏症检查诊断

重症先天性粒细胞缺乏症一、诊疗规范（一）概述重症先天性中性粒细胞缺乏症（severe congenital neutropenia，SCN）是一种以低水平粒细胞（＜200/mm3）为特征的，与不同基因相关的遗传病，表现为严重的中性粒细胞减少和骨髓成熟障碍。

（二）病因和流行病学目前已知的发病机制是髓系细胞凋亡增加。

相关基因突变最终导致髓系前体细胞过度凋亡，可能是由未折叠蛋白反应激活所致。

根据突变类型和遗传背景的研究，SCN患者中性粒细胞减少的表达可以是相同的或不同的，这提示本病可能存在不同的发病机制，或可能是基因相互作用的结果。

普通人群的患病率估计为1/333300～1.7/333300。

新生儿的年发病率约为1/250000。

无特殊性别倾向。

美国的调查数据显示，大多数患者为白种人。

（三）临床表现患者临床表现为口咽炎、中耳炎、呼吸系统感染、蜂窝织炎及皮肤感染，常由葡萄球菌及链球菌感染所致。

在出现骨髓储备下降的重度中性粒细胞减少患者中，2岁之前大部分患儿都发生过口腔溃疡及疼痛性牙龈炎。

如伴弥漫性胃肠道病变，可引起类似克罗恩病的腹痛和腹泻表现。

嗜中性粒细胞减少症可导致各个部位遭受反复细菌或真菌感染，其中主要受累部位为皮肤粘膜、耳鼻、咽喉和肺。

感染通常非常严重甚至是致命性的。

约15％的患者进展为急性白血病或骨髓增生异常综合征。

患儿通常不伴有特征性畸形。

（四）辅助检查1.实验室检查全血细胞计数及外周血细胞形态学分析均可发现中性粒细胞数减少，可伴单核细胞增多。

2.骨髓涂片骨髓增生程度正常或稍微降低，伴早期髓系“停滞”在早幼粒细胞/中幼粒细胞阶段，常伴有不典型细胞核及胞质空泡形成。

5383.影像学检查因该病患儿易反复发生感染，故影像学可能发现耳、鼻、肺部乃至肠道的感染表现。

4.基因检测SCN是一种遗传性疾病，迄今为止，根据重度慢性中性粒细胞减少国际登记站（https:///registry/）的数据，已经报道超过100种基因突变。

粒细胞缺乏的诊断标准
粒细胞缺乏的诊断标准通常根据外周血象的结果来确定，以下是一些常用的诊断标准：
1. 中性粒细胞计数低于正常范围：成人的正常中性粒细胞计数范围约为1500-8000/mm³，低于此范围可被认为是粒细胞缺乏。

2. 中性粒细胞百分比低于正常范围：正常情况下，中性粒细胞百分比占外周血白细胞总数的40-75%之间，低于此范围可被认为是粒细胞缺乏。

3. 中性粒细胞分类低于正常范围：除了总体中性粒细胞计数低下外，不同类型的中性粒细胞数量也可能在不同程度上受到影响。

例如，嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞计数也较低，表明可能存在特定类型的粒细胞缺乏。

需要注意的是，真正确定粒细胞缺乏的诊断需要综合分析患者的病史、症状以及其他相关检查结果，如骨髓穿刺检查，以排除其他可能的原因并进一步确定诊断。

因此，仅凭外周血象的结果来确定粒细胞缺乏的诊断可能不够准确。

最好在专业医生的指导下进行综合评估和诊断。

粒细胞缺乏症诊断标准粒细胞缺乏症（Neutropenia）是一种白细胞中粒细胞数量减少的疾病，通常由于骨髓功能障碍或其他疾病引起。

粒细胞是一种重要的白细胞，对于身体的免疫系统起着重要作用，因此粒细胞缺乏症的诊断和治疗至关重要。

下面将介绍粒细胞缺乏症的诊断标准，以帮助临床医生更好地识别和治疗这一疾病。

一、临床表现。

粒细胞缺乏症的临床表现主要包括反复发作的发热、口腔溃疡、皮肤感染、肺部感染等。

患者可能出现持续性或周期性的感染症状，特别是对于反复发作的感染需要引起重视。

二、实验室检查。

1. 血液常规检查，粒细胞计数减少，通常小于1.5×10^9/L；2. 骨髓穿刺，骨髓中粒细胞数量减少，通常小于0.5×10^9/L；3. 中性粒细胞功能检测，可通过嗜中性粒细胞吞噬试验等方法进行检测，以评估粒细胞的功能状态。

三、其他相关检查。

1. 免疫功能检测，包括血清免疫球蛋白水平、淋巴细胞亚群分析等；2. 骨髓活检，对于不明原因的粒细胞缺乏症患者，可进行骨髓活检以明确病因。

四、诊断标准。

根据临床表现和实验室检查结果，粒细胞缺乏症的诊断标准主要包括：1. 血液常规检查显示粒细胞计数小于1.5×10^9/L；2. 骨髓穿刺显示骨髓中粒细胞数量减少，通常小于0.5×10^9/L；3. 排除其他原因引起的粒细胞减少，如感染、药物因素等。

五、诊断注意事项。

1. 对于患者的临床表现需要进行全面评估，特别是对于反复发作的感染症状需要引起重视；2. 实验室检查结果需要结合临床表现进行综合分析，排除其他原因引起的粒细胞减少；3. 对于不明原因的粒细胞缺乏症患者，可进行进一步的免疫功能检测和骨髓活检，以明确病因。

六、治疗建议。

粒细胞缺乏症的治疗主要包括预防感染和提高免疫功能。

对于患者需要避免接触感染源，定期进行感染预防性用药，如注射粒细胞集落刺激因子（G-CSF）等。

同时，可以适当补充免疫球蛋白，提高机体的免疫功能。

粒细胞缺少症诊断标准全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：粒细胞缺少症，又称白细胞缺少症，是一种罕见的遗传性疾病，主要表现为血液中粒细胞的数量明显减少或完全缺失，导致机体抵抗力下降，易感染各种致病微生物。

本文将详细介绍粒细胞缺少症的诊断标准，帮助医生和患者更好地认识和管理这一疾病。

一、病史和症状在对患者进行诊断时，首先应该详细了解其病史和症状。

患有粒细胞缺少症的患者通常会表现出反复感染、发热、疲劳等症状。

还要了解患者的家族史，因为粒细胞缺少症通常是一个遗传性疾病，家族中可能有其他患者。

二、实验室检查1. 血常规患有粒细胞缺少症的患者通常在血常规检查中会发现粒细胞数量减少。

正常情况下，成人的粒细胞比例为50%-70%，而患有粒细胞缺少症的患者可能会低于10%。

还需要检查其他血细胞参数，如白细胞总数、淋巴细胞比例等，以排除其他疾病的可能性。

2. 骨髓穿刺检查进行骨髓穿刺检查是诊断粒细胞缺少症的关键步骤。

通过检查骨髓中的成熟粒细胞数量和比例，可以确定其是否存在缺失。

还能排除其他骨髓疾病的可能性，如恶性肿瘤、再生障碍性贫血等。

3. 免疫学检查通过免疫学检查可以确定粒细胞缺少症的具体类型。

根据缺失的粒细胞类型，可以分为中性粒细胞缺乏症、嗜酸性粒细胞缺乏症、嗜碱性粒细胞缺乏症等。

还可以检查免疫功能，评估机体的免疫状况。

三、遗传学检查在确定患者患有粒细胞缺少症后，还应该进行遗传学检查，以帮助确定遗传模式和家族风险。

通过检测相关基因突变，可以了解疾病的遗传特点，为家庭遗传咨询提供依据。

四、鉴别诊断在诊断粒细胞缺少症时，还需要对其与其他疾病进行鉴别。

嗜酸性粒细胞缺少症可能需要与哮喘等过敏性疾病进行鉴别；中性粒细胞缺乏症可能需要与再生障碍性贫血等骨髓疾病进行鉴别。

五、治疗和管理一旦确诊为粒细胞缺少症，患者需要根据具体病情制定相应的治疗方案。

目前，主要的治疗方法包括抗生素治疗、免疫调节治疗、骨髓移植等。

还需要密切监测患者的病情变化，避免感染和并发症的发生。

白细胞减少症和粒细胞缺乏症诊断鉴别白细胞减少症和粒细胞缺乏症是两种与白细胞数量相关的疾病，虽然两种疾病都可以导致白细胞数量的减少，但其发病机制、临床表现、诊断方法和治疗策略却有所不同。

本文将对白细胞减少症和粒细胞缺乏症进行详细的对比和鉴别。

首先，我们先来了解一下白细胞减少症。

白细胞减少症是指机体内白细胞数量低于正常水平的疾病，主要表现为白细胞总数的减少。

白细胞减少症的病因非常广泛，可以是由于先天性缺陷、遗传性疾病、药物毒性、病毒感染、免疫相关疾病等多种原因所致。

根据减少的细胞种类不同，白细胞减少症又可以分为中性粒细胞减少症、淋巴细胞减少症和巨噬细胞减少症等。

由于白细胞在机体的免疫防御中起到关键作用，因此白细胞减少症容易导致机体对感染的易感性增加。

而粒细胞缺乏症是一种特指中性粒细胞数量减少的疾病，其病因主要包括先天性遗传因素和获得性因素。

先天性粒细胞缺乏症是由于骨髓造血干细胞或分化过程中的遗传突变所引起的，如嗜酸性粒细胞减少症、嗜碱性粒细胞减少症等。

获得性粒细胞缺乏症则可以由药物、感染、自身免疫疾病、恶性肿瘤、骨髓增生异常综合征等多种因素引起。

粒细胞是机体免疫防御中最重要的细胞类型之一，其减少会导致机体容易发生细菌感染，且感染可能迅速扩散、且难于控制。

在临床表现上，白细胞减少症的病人通常会出现反复发作的感染症状，包括发热、咳嗽、咳痰、腹泻、关节疼痛等。

由于不同种类白细胞的减少，病人可能会出现相应的免疫功能缺陷，比如淋巴细胞减少症患者易患肺炎、巨噬细胞减少症患者易患真菌感染等。

粒细胞缺乏症主要表现为持续或复发严重的多器官细菌感染，如阿斯克龙综合症、慢性肺脓肿等。

此外，不少粒细胞缺乏症患者还有其他异常临床表现，如口腔溃疡、反复发作的发热、肺部炎症等。

诊断白细胞减少症和粒细胞缺乏症的方法主要包括全血细胞计数、骨髓穿刺等实验室检查。

全血细胞计数可以准确测定白细胞总数和粒细胞数量，进而判断白细胞减少症的种类。

(6):552-559.[8]Fagi ol o E,T oriani -terrnzi C .Th 1and Th 2cyt okine modulati onby I L -10/I L -12i m balance in aut oi m mune hae molytic anae m ia [J ].Aut oi m munity,2002,35(1):39-44.2006-02-11收稿　本文编辑:郑春雨作者单位:复旦大学附属华山医院血液科,上海200040E -mail:wangxiaoqin@shmu 1edu 1cn【文章编号】1005-2194(2006)07-0487-03免疫性粒细胞减少症的诊断及治疗林果为,王小钦【中图分类号】R5 【文献标识码】A 林果为,1959年毕业于原上海第一医学院医疗系本科。

现任复旦大学附属华山医院终生教授,血液科博士生导师。

兼任中华医学会血液学分会常委、上海市血液学会副主任委员,《中华医学杂志(英文版)》、《中华血液学杂志》、《上海医学》编委,《实用内科学》副主编。

免疫性粒细胞减少症是指免疫性中性粒细胞减少症(i m mune neutr openia ),系一组因中性粒细胞抗体介导的粒细胞减少(<10岁儿童外周血中性粒细胞绝对值低于115×109/L ,成人低于210×109/L )和粒细胞缺乏症(中性粒细胞绝对值低于015×109/L )。

因患者体内存在中性粒细胞特异性抗原的抗体,导致中性粒细胞在外周血或通过脾脏破坏,或由补体介导的中性粒细胞溶解作用,使粒细胞减少[1]。

大多数患者的抗体是作用于成熟中性粒细胞,因此患者的骨髓象大多呈增生象伴粒细胞系“成熟障碍”,但也有少数患者的抗体可直接作用于粒细胞系的前体细胞,导致严重粒细胞减少,这是因为不仅有粒细胞的破坏,还有生成障碍,骨髓象呈现“纯白细胞再生障碍性贫血”。

白细胞减少症和粒细胞缺乏症……【概述】周围血液白细胞计数低于4000/mm3称为白细胞减少症（leukopenia）。

白细胞减少症最常见是由中性粒细胞减少所致。

中性粒细胞绝对计数低于1800～2000/mm3称为粒细胞减少症（neutropenia）；低于500～1000/mm3称为粒细胞缺乏症（agranulocytosis），常伴有严重的难以控制的感染。

上述三类情况的病因和发病机理大致相同，但病情的严重程度不等。

【诊断】白细胞计数是最主要的实验诊断依据。

白细胞计数受多种因素影响可有较大的波动，所以往往需要多次重复检验始可诊断。

粒细胞浆内可有毒性颗粒和空泡，常提示存在细菌性感染。

单核细胞比例常代偿性增多。

如杆状核的比例增加（＞20％）提示骨髓有足够的粒细胞生成能力。

骨髓象随原发病而异。

粒细胞缺乏症骨髓内各阶段的中性粒细胞极度减少，甚至完全消失。

粒细胞有明显的毒性改变或成熟受阻。

淋巴细胞、单核细胞、浆细胞和组织细胞可增多，幼红细胞和巨核细胞大致正常。

病情好转时外周血中晚幼粒细胞及较成熟粒细胞相继出现，个别可呈类白血病血象。

诊断的第二步是寻找白细胞减少的病因。

要注意追问有无可能引起本病的药物或化学物接触史；有无引起粒细胞减少的基础疾病，例如慢性炎症、自身免疫性疾病；有无反复感染史等。

下列特殊检查可辅助了解粒细胞减少症的病因和发病机理。

（一）骨髓粒细胞贮备功能测定用致热原如初胆烷醇酮、脂多糖及强的松（或氢化考的松），通过中间产物——“中性粒细胞释放因子”的作用，促使骨髓粒细胞释放，了解粒细胞的释放功能。

如用强的松40mg口服五小时后白细胞计数较服药前增加2×109/L以上或用氢化考的松200mg静脉注射3～4小时后白细胞计数较用药前增加4×109～5×109/L以上者均为正常。

（二）肾上腺素试验皮下注射0.2mg后20分钟测白细胞数，如升高2000/mm3或较原水平高1倍以上，提示血管壁上有粒细胞过多聚集在边池。

化疗粒细胞减少症的诊断标准主要包括：
1. 成人外周血白细胞低于4.0*10^9/L。

2. 成人外周血当中中性粒细胞绝对值低于2.0*10^9/L。

请注意，粒细胞减少症的症状缺乏特异性，起病一般比较缓慢，少数患者没有明显症状，在检查血象的时候偶然发现。

有症状患者是主诉乏力、疲倦、头晕、纳差、心悸、失眠以及低热。

部分患者反复患上呼吸道、泌尿道和胆道的感染，中性粒细胞低于1.0*10^9/L的时候感染倾向是明显增加的。

因此，对于正在接受化疗的患者，需要定期检查血常规，观察白细胞和中性粒细胞的数量变化，及时发现并处理粒细胞减少症。

同时，也需要注意个人卫生，避免感染。

化疗粒细胞缺乏症诊断标准
化疗粒细胞缺乏症（chemotherapy-induced neutropenia, CIN）是指在接受化疗治疗的患者中，由于化疗药物对骨髓造血功能的抑制，导致白细胞中的粒细胞数量减少，从而增加感染的风险。

诊断
化疗粒细胞缺乏症的标准主要包括以下几个方面：
1. 白细胞计数，诊断化疗粒细胞缺乏症的关键指标是绝对中性
粒细胞计数（absolute neutrophil count, ANC）。

通常情况下，
如果ANC低于1500/mm³，则被认为是粒细胞缺乏症。

在ANC低于1000/mm³时，患者被认为处于中度粒细胞缺乏状态；当ANC低于
500/mm³时，患者被认为处于重度粒细胞缺乏状态。

2. 发热，化疗粒细胞缺乏症患者经常伴有发热，特别是重度粒
细胞缺乏症患者。

体温超过38.3摄氏度（101华氏度）被视为发热。

3. 感染症状，化疗粒细胞缺乏症患者容易出现感染症状，如咳嗽、呼吸困难、腹泻、尿频、皮肤感染等。

4. 诱因，患者在接受化疗后出现上述症状，且排除其他原因引
起的感染和发热。

根据上述标准，医生可以对化疗粒细胞缺乏症进行诊断。

一旦诊断出化疗粒细胞缺乏症，医生通常会采取相应的治疗措施，包括使用生长因子促进粒细胞生成、预防性使用抗生素等，以减少感染的风险，保护患者的健康。

同时，患者在接受化疗期间也需要密切关注自身健康状况，避免受到外界感染源的影响，保持健康的生活方式和饮食习惯。

㊃论著㊃通信作者:乔明吟,E m a i l :qa o f 12345679@163.c o m 2例儿童先天性粒细胞减少症的基因诊断乔明吟,刘 炜,李彦格,毛彦娜,管玉洁(郑州儿童医院血液肿瘤科,河南郑州450000) 摘 要:目的 提高对先天性粒细胞减少症(C N )的认识,通过检测基因突变类型,探讨其分子学发病机制㊂方法 使用D N A 直接测序法分析患儿全基因组,分析其有意义的突变类型,查找数据库进行相应序列对比,再进行一代测序(S a n ge r 法)验证㊂结果 先证者一存在G 6P C 3基因存在双重杂合子突变:I V S 3+1G>T 及c .915(E 6):缺失G ,先证者二存在C X C R 4基因突变:c .1004(e x o n 1)-c .1005(e x o n 1)缺失A A ㊂结论 2例先天性粒细胞减少症的患儿均存在异常的基因突变,基因诊断对先天性粒细胞减少症的诊断有重大意义,对临床研究及治疗提供依据㊂关键词:中性粒细胞减少;基因;C X C R 4基因;G 6P C 3基因中图分类号:R 557.3 文献标志码:A 文章编号:1004-583X (2018)04-0314-05d o i :10.3969/j.i s s n .1004-583X.2018.04.010G e n e t i c d i a g n o s i s o f t w o c h i l d r e nw i t h c o n g e n i t a l n e u t r o pe n i a Q i a o M i n g y i n ,L i u W e i ,L iY a n g e ,M a oY a n n a ,G u a nY u ji e D e p a r t m e n t o f P e d i a t r i cH e m a t o l o g y a n d O n c o l o g y ,Z h e n g z h o uC h i l d r e n sH o s p i t a l ,Z h e n g z h o u 450000,C h i n a C o r r e s p o n d i n g a u t h o r :Q i a oM i n g y i n ,E m i l :q a o f12345679@163.c o m A B S T R A C T :O b je c t i v e T o i m p r o v e t h eu n d e r s t a n d i n g a n dd i a g n o s i sof c o ng e n i t a l n e u t r o p e n i a (C N )i nchi l d r e n a n de x p l o r e t h e p r o c e d u r e sb y t h eu s eo f g e n e m u t a t i o n .M e t h o d s D i r e c tD N As e q u e n c i n g o fP C R w e r ea p pl i e dt o a n a l y z e t h ew h o l e g e n o m e .T h ed a t a b a s ew e r e s c r e e n e dt oc o n d u c t r e l e v a n t s e q u e n c ea l i gn m e n t .T h em u t a t i o n sw e r e c o n f i r m e db y r e v e r s e s e q u e n c i n g .R e s u l t s P r o p o s i t u s 1h a d d o u b l e h e t e r o z y g o u sm u t a t i o n s ,I V S 3+1G>Ta n d c .915(E 6):,w h i l ew a s i n l a c ko fG.P r o p o s i t u s2h a dh e t e r o z y g o u sm u t a t i o n s :c .1004(e x o n 1)-c .1005(e x o n 1),w h i l e i n l a c ko fA A.C o n c l u s i o n B o t ho ft h et w oc h i l d r e n w i t hc o n g e n i t a ln e u t r o p e n i ah a da b n o r m a l g e n e m u t a t i o n .G e n e d i a g n o s i s i so f g r e a ts i g n i f i c a n c et od e f i n ec o n g e n i t a ln e u t r o p e n i aa n d p r o v i d et h eb a c k gr o u n df o rf u r t h e rc l i n i c a l r e s e a r c ha sw e l l a s t h e r a p yi n t h e s e p a t i e n t s .K E Y W O R D S :n e u t r o p e n i a ;ge n e s ;C X C R 4g e n e ;G 6P C 3g e n e 粒细胞减少症是临床上常见的一种疾病,其中大部分病人与感染㊁化疗㊁自身免疫性疾病等因素有关,即获得性粒细胞减少㊂而重型先天性中性粒细胞减少症(s e v e r ec o n g e n i t a l n e u t r o p e n i a ,S C N ),此类疾病目前我们的认识还比较少,它是原发性免疫缺陷病中的一类㊂最早由瑞典儿科医师K o s t m a n n在1956年报道㊂S C N 是以外周血成熟中性粒细胞缺乏为主要症状的一类异质性疾病,并且已被证实S C N 与多种基因突变有关[1]㊂近年来越来越多的报道基因诊断在临床诊疗过程中发挥着重要作用[2]㊂本文先后对2例粒细胞减少患儿进行基因测序,发现分别存在C X C R 4基因突变及G 6P C 3基因突变,本文意在揭示其基因类型与临床表现的关系,为本病的临床研究及基因诊断提供依据㊂1 资料与方法1.1 研究对象 先证者一,女,3岁8月,发现中性粒细胞减少3年余,3年前查A N C 1ˑ109/L ,后多次查中位粒细胞的绝对计数(a b s o l u t e c o u n t o fn e u t r o p h i l s ,A N C )波动在(0.2~0.8)ˑ109/L ,患儿合并有先天性心脏病:房间隔缺损,二尖瓣关闭不全㊂反复呼吸道㊁皮肤黏膜㊁中耳炎㊁口腔溃疡等感染史㊂先证者为双胞胎,其胞弟,血常规检测未发现异常㊂先证者一父母均体健,血常规检测未发现异常㊂否认有遗传病史㊂骨髓细胞学检查:增生活跃,粒ʒ红比=1.55ʒ1,各阶段细胞均可见,粒系比值正常,占44%㊂早幼粒细胞2.8%,中幼粒细胞6.0%,晚幼粒细胞2%,中性杆状核16.8%,各阶段粒细胞形态大致正常㊂红系比例形态大致正常,淋巴细胞比值及形态正常,余未见异常,见图1㊂先证者二,女,9岁,3年前因臀部肿物 行外科手术时发现粒细胞减少,未进行诊治㊂后因感染入郑州儿童医院,查A N C0.06ˑ109/L ,患儿系领养,其养父母口述患儿自幼体弱多病,患儿有反复盆腔感染病史㊂骨髓细胞学检查:增生活跃,粒ʒ红比=3.19ʒ1,各阶段细胞均可见,粒系比值正常,占61.2%㊂中幼粒细胞8.8%,晚幼粒细胞11.6%,中性杆状核23.6%,中性分叶核16%,各阶段粒细胞形㊃413㊃‘临床荟萃“ 2018年4月5日第33卷第4期 C l i n i c a l F o c u s ,A pr i l 5,2018,V o l 33,N o .4Copyright ©博看网. All Rights Reserved.态大致正常㊂红系比例形态大致正常,淋巴细胞比值及形态正常,余未见异常,见图2㊂淋巴细胞亚群:T 细胞(C D 3+)65%(正常范围55%~84%),T s (C D 3+C D 8+)21%(正常范围11%~41%),T h (C D 3+C D 4+)42%(正常范围31%~60%),N K 细胞(C D 16+56+)24%(正常范围5%~27%),C D 4/C D82.00(正常范围0.68~2.47),B 细胞(C D 19+)7%(正常范围6%~25%)㊂免疫球蛋白M 1.98g /L (正常范围0.4~2.6),免疫球蛋白G9.60g /L (正常范围7~16),免疫球蛋白A2.49g /L (正常范围0.7~4),补体C 40.20g /L (正常范围0.1~-0.4)补体C 31.24g /L (正常范围0.78~-2.1)㊂皮肤黏膜未见明显异常㊂图1 先证者一骨髓涂片 图2 先证者二骨髓涂片(瑞氏-吉姆萨染色ˑ1000)1.2 方法1.2.1 标本采集 在知情同意的前提下,采集先证者一及先证者二全血2m l (E D T A 抗凝血),使用B l o o d G e n M i d iK i t (C W B I O ,C h i n a)提取患者全基因组D N A ,操作按照试剂盒说明书进行㊂1.2.2 二代测序 参考文献与O M I M 数据库信息,将人类全部约2万个基因的基因组外显子区域定制罗氏N i m b l e G e n 捕获探针进行目标基因全外显子捕获㊂I l l u m i n a h i s e q 2500平台标准化上机测序操作流程,I l l u m i n a 官方b a s e c a l l 分析软件B c l T o F a s t q 得到原始数据(r a wd a t a ),进行数据分析㊂1.2.3 一代测序(S a n ge r 法)验证 根据G 6P C 3基因和C X C R 4基因所验证位点序列设计引物,采用P C R 方法进行扩增㊂P C R 反应条件为:95ħ预变性5分钟;95ħ变性30秒,60ħ退火30秒,72ħ链延伸30秒,扩增30个循环;最后72ħ补充延伸10分钟㊂P C R 的体系均为50μl㊂引物序列见表1㊂表1 G 6P C 3基因/C X C R 4基因所验证位点分析引物序列引物名称碱基序列退火温度(ħ)扩增产物大小(b p )I V S 3+1G >T F :A G C A G T G G A C A G A A T C G T A G T551283R :A G G A G A G T G G A G T G A C A A C A G c .915(E 6):缺失G F :G C C T A A T A A C T G G T G A G C A A C T 551370R :T G G A G A T G G C A C A G A G A C T A C c .1004(e x o n 1)-c .1005(e x o n 1)d e l A AF :C A T C C T C C TG G A A A T C A T C A G C A 60ʎ两步法 265R :G C T G G A G T G A A A A C T T G A A G A C T C A G A基因序列分析,G 6P C 3基因/C X C R 4基因所验证位点的P C R 扩增产物,用A B I 3730X L 测序仪测序,测序引物采用原P C R 引物㊂基因序列分析采用D N A S T A R 软件进行序列分析和比对㊂2 结 果2.1 先证者一基因分析 通过对先证者全基因组D N A 提取,检测到先证者一存在G 6P C 3基因突变,使用一代测序(S a n g e r 法)验证先证者G 6P C 3基因全部外显子及其侧翼序列,先证者一的17号染色体G 6P C 3基因第3个内含子g .42152139出现了G>T错义突变,同时位于E 6出现g .42153285出现了缺失G ㊂即先证者一存在杂合子突变:I V S 3+1G>T 及c .915(E 6):缺失G ,杂合突变㊂已美国N C B I 基因库所公布的序列为标准㊂其检测结果见图3㊂图3 先证者一G 6P C 3基因突变序列参照图 ①I V S 3+1的N C B I 参照序列图;②先证者一G 6P C 3基因I V S 3+1出现GңT ;③C .915(E 6)的N C B I 参照序列图④先证者一G 6P C 3基因C .915(E 6)出现缺失G ㊃513㊃‘临床荟萃“ 2018年4月5日第33卷第4期 C l i n i c a l F o c u s ,A pr i l 5,2018,V o l 33,N o .4Copyright ©博看网. All Rights Reserved.2.2先证者二基因分析通过对先证者全基因组D N A提取,检测到先证者二C X C R4基因出现c. 1004(e x o n1)和c.1005(e x o n1)d e l A A,使用一代测序(S a n g e r法)验证先证者C X C R4基因全部外显子及其侧翼序列,先证者二位于2号染色体C X C R4基因第1个外显子g.136872505-136872506出现了连着缺失两个A,至使下游的后序所有蛋白序列发生突变㊂即先证者二存在C X C R4基因:c.1004 (e x o n1)和c.1005(e x o n1)连着缺失两个A㊂已美国N C B I基因库所公布的序列为标准㊂其检测结果见图4㊂图4先证者二C X C R4基因突变序列参照图①C.1004-1005的N C B I参照序列图;②先证者二C X C R4基因出现c.1004(e x o n1)-c.1005 (e x o n1)分别缺失A3讨论S C N其临床表现多态性,除A N C减少外,可伴其他系统的表现,因此按临床表现单独累及血液系统的和同时出现累积其他系统症状,可分为非综合征性C N和综合征性C N[3]㊂近年来,随着基因检测技术的发展,越来越多的患者通过基因检测确诊为S C N㊂近年来的研究证实多种基因突变与S C N发病有关㊂常见的基因有E L A-2基因㊁HA X1基因㊁WA S p基因㊁A K-2基因㊁G F I1基因等㊂本文收录的2例患者的基因突变类型,在国外均有报道,但国内报道较少㊂在既往的国内报道中仅有2例先天性中性粒细胞减少的患者,未检测到异常基因突变类型[4-5],有1例E L A2基因[6],1例H A X1基因出现突变,并在随后的定期门诊随访中提示疾病进展为C MM L[7]㊂1例C X C R4基因突变,并确诊为WH I M综合征(w a r t s, h y p o g a mm a g l o b u l i n e m i a,i n f e c t i o n s,a n d m y e l o k a t h e x i ss y n d r o m e,OM I M193670)[8]㊂本文的先证者二被证实存在C X C R4基因的突变,最早在2003年报道WH I M综合征被证实与C X C R4基因突变有关[9]㊂WH I M综合征表现为疣㊁血丙种球蛋白减少㊁感染以及先天性髓样粒细胞缺乏症的四联症㊂而本先证者一除外周血中性粒细胞减少及反复感染外,并无疣㊁血丙种球蛋白减少症状㊂C X C R4趋化因子受体亢进是发病的主要原因,C X C R4趋化因子受体的亢进引起C X C R4所依赖的中性粒细胞滞留在骨髓中[10],从而导致外周血粒细胞减少和成熟粒细胞异常存留在骨髓中而凋亡㊂C X C R4扮演着重要的角色在人类的免疫系统中,已经发现它与多种疾病的发生有关,并且与癌症转移密切相关㊂正常情况下,C X C R4在人体新生组织中的表达非常的低,随着细胞成熟到即将凋亡表达逐渐增高,这可能与骨髓中衰老细胞被巨噬细胞清除的机制有关[11-12]㊂先证者二目前尚无法诊断WH I M综合症㊂但先证者二存在C X C R4基因突变,可以解释其粒细胞减少症状的原因,骨髓涂片可见增生活跃,且粒细胞生成正常,而外周血中粒细胞明显减少,提示存在粒细胞向外周血释放障碍情况㊂先证者一出现G6P C3基因突变是有葡萄糖6磷酸酶催化亚基3引起的突变所致㊂最早是由B o z t u g 等[13]在2009年发现,根据既往文献报道,该基因可引起重症先天性粒细胞减少症4型(s e v e r e c o n g e n i t a l n e u t r o p e n i a t y p e4,S C N4),临床表现以严重的中性粒细胞减少为特征,并且伴有间歇性血小板减少㊁皮肤浅表静脉突出以及心血管系统㊁泌尿生殖器的畸形㊁面部畸形㊁听力损害[14]㊂G6P C3在骨骼肌肉细胞中表达较高,在G6P C3缺陷的患儿者出现骨骼肌肉异常症,包括肌无力及关节松弛[15]㊂G6P C3在正常人的睾丸中存在很高的表达,有国外的文献报道8例男性的G6P C3缺乏的患者中有6例存在隐睾症[16]㊂在国外的文献报道中提到患儿的体重明显低于同龄人[15]㊂同时G6P C3缺陷的患儿可能合并血液系统的异常,有难治性缺铁性贫血㊁骨髓中出现异常巨核细胞以及外周血可见巨大血小板及㊃613㊃‘临床荟萃“2018年4月5日第33卷第4期 C l i n i c a l F o c u s,A p r i l5,2018,V o l33,N o.4Copyright©博看网. All Rights Reserved.间歇的血小板减少㊂本文的先证者一经证实存在严重中性粒细胞减少,有先天性房间隔缺损并二尖瓣关闭不全,皮肤浅表静脉突出,特殊面容(非遗传因素的眼裂小及鼻梁低平),身高体重明显低于同龄儿童,间歇性的血小板减少㊂G6P C3基因缺陷引起的S C N4机制是G6P C3基因编码葡萄糖-6-磷酸酶-β(g l u c o s e-6-p h o s p h a t a s e-β,G6Pβ)可以水解糖异生和糖原分解最后一步的葡萄糖-6-磷酸(g l u c o s e-6-p h o s p h a t e,G6P),这种酶同样作用于连接细胞质与内质网的G6P T转运体,突变的基因引起G6P至使发病㊂另外,还有研究指出G6P C3突变可以使糖原合成酶激酶3β的活性增加,从而使抗凋亡分子M c l l (B c l-2家族成员之一)发生水解,造成中性粒细胞凋亡[17]㊂此外,在2010年D a v i d等[15]研究中,提到G6P C3基因突变可造成C X C R4过度的表达从而引起粒细胞减少,在体外动物模型中,通过抑制小白鼠的C X C R4表达可以扭转粒细胞减少㊂另外,在研究中D a v i d等[15]提到粒细胞刺激因子(g r a n u l o c y t e c o l o n y-s t i m u l a t i n g f a c t o r,G-C S F)治疗可减低中性粒细胞的C X C R4表达,从而使外周血的中性粒细胞计数上升至正常㊂目前有关G6P C3缺陷是如何选择性的引起中性粒细胞和N K细胞中C X C R4表达异常提高的机制仍尚不清楚㊂S C N在遗传方式上有多态性,既可以表现为常染色体显性遗传㊁常染色体隐性遗传㊁性染色体遗传,以及无遗传背景的散发病例㊂C X C R4基因是常染色体显性遗传,G6P C3基因为常染色体隐性遗传㊂本文的2例先证者均为无遗传背景的散发病例㊂在既往的国内文献中报道均为无遗传背景的散发病例㊂通过遗传方式对S C N的诊断有一定的帮助,但对于除感染㊁化疗等可能因素外的粒细胞减少,基因分子是诊断S C N强有力的依据㊂不同的突变类型造成粒细胞缺乏程度有所差别㊂因此,通过基因诊断来甄别患儿粒细胞减少程度也有很大的价值[18]㊂S C N中的大部分患者的粒细胞集落刺激因子(G-C S F)/G-C S F R系统功能正常[19-20]㊂本研究未进行G-C S F R功能检测,但均进行G-C S F的治疗,患者的中性粒细胞计数均有所上升㊂G-C S F在80年代被广泛用于S C N的患者㊂尽管有一些关于长期使用G-C S F后出现不利影响的报道[21-22],但是并不影响G-C S F治疗S C N㊂有少量病例报道提到,当患者每次使用G-C S F的剂量大于10μg/k g以及患者接受G-C S F的总剂量大于10000μg/k g,将大大增加向恶性疾病转化的风险[1]㊂另外,还有一些研究指出一部分的S C N可转化成M D S/AM L㊂S C N转化成白血病的风险主要依赖于2个因素,其一是基因突变的类型,其二是累积使用G-C S F[3]㊂目前被报道有很高的风险转化成白血病的病例基因类型有S B D S㊁G A T A2[3]㊂然而目前G6P C3基因转化成恶性疾病概率较低[23]㊂而C X C R4基因所致的WH I M 综合征为良性慢性病程,预后大多良好,有少量报道该疾病进展呈E B V相关淋巴增殖性疾病[24]㊂参考文献:[1] D o n a d i e uJ,F e n n e t e a u O,B e a u p a i n B,e t a l.C o n g e n i t a ln e u t r o p e n i a:d i a g n o s i s,m o l e c u l a r b a s e s a n d p a t i e n tm a n a g e m e n t[J].O r p h a n e t JR a r eD i s e a s e s,2011,6(1):1-28.[2] D a l eD C,P e r s o n R E,B o l y a r d A A,e ta l.M u t a t i o n s i nt h eg e n ee n c o d i n g n e u t r o p h i l e l a s t a s ei n c o n g e n i t a l a n d c y c l i cn e u t r o p e n i a[J].B l o o d,2000,96(7):2317-2322.[3] D o n a d i e uJ,B e a u p a i n B,M a h l a o u iN,e ta l.E p i d e m i o l o g y o fc o n g e n i t a l n e u t r o p e n i a[J].H e m a t o lO n c o lC l i n N o r t h A m,2013,27(1):1-17.[4]杨湖,高宗燕,李琳迪,等.重型先天性粒细胞减少症1例报告并文献复习[J].临床儿科杂志,2014,32(5):485-488. 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