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takara反转录试剂盒说明书Takara反转录试剂盒是一种用于研究RNA分子的试剂盒。
该试剂盒可以用于DNA的反转录，将RNA转录成DNA，并进行后续的PCR扩增。
反转录试剂盒在生命科学领域中起着非常重要的作用，因此在使用过程中需仔细阅读说明书并按照说明书进行操作。
一、试剂盒组成Takara反转录试剂盒主要包含以下拉玛：1.反转录酶：外源的M-MLV反转录酶，具有高度的反转录活性和优异的扩增效率等优良特性。
2.反转录缓冲液：针对反转录酶的酶切优化反转录缓冲液。
3.引物：随机9mers引物，适用于多种RNA逆转录的应用。
4.对照RNA：In Vitro转录的任意序列的RNA，用于反转录和后续PCR扩增反应的质控。
二、试剂盒使用方法1. RNA提取：在使用Takara反转录试剂盒之前，需要从样品中提取RNA。
2. 反转录反应：将RNA测序专用随机引物、针对反转录酶的反转录缓冲液、反转录酶和RNA样品混合，进行逆转录反应。
3. PCR扩增：反转录完成后，可以利用PCR扩增技术对转录所得DNA进行扩增，完成DNA序列的检测和分析。
三、试剂盒注意事项1. 避免多次冻融。
为保证试剂的稳定性，反转录试剂盒必须储存于-20℃及以下的冰箱中，避免多次冻融。
2. 操作时需佩戴手套。
操作时需佩戴手套，尽量避免手汗或皮脂的污染，影响试剂盒的效率和准确性。
3. 注意反转录缓冲液的稀释量。
反转录缓冲液的稀释量会影响反转录效果，因此需要按照说明书进行操作，精准稀释。
4. 注意反转录酶的用量。
不同反转录酶的最优用量不同，需要根据实验需要按照说明书或文献进行调整。
5. 确认对照RNA引物的扩增效果。
在进行PCR扩增前，需要先进行对照RNA引物的扩增，以确认反转录反应的正确性，避免因为反应偏差而引起的实验结果的偏差。
4. 根据实验需要进行调整。
反转录试剂盒虽然具有大量的优良特性，但是实验环境和实验条件的不同，会对反转录试剂盒的效果产生较大的影响，因此需要根据实验需要进行调整。
takara反转录试剂盒说明书说明书一、产品简介takara反转录试剂盒是一种高效、可靠的反转录试剂盒，适用于转录RNA为cDNA的实验操作。
本试剂盒由takara公司制造，经过严格的质量控制，确保产品的稳定性和可靠性。
二、试剂盒组成本试剂盒包含以下组分：1. 反转录酶：高效反转录酶，能在广泛的实验条件下进行反转录反应。
2. 基质：提供反应所需的核酸和其他辅助物质。
3. 标记物：用于标记反转录产物的荧光染料或放射性同位素。
4. 缓冲液：维持试剂盒中酶的活性，调节反应条件的缓冲体系。
5. 控制样品：用于检验试剂盒的反应效果和稳定性。
三、实验操作1. 准备工作在进行实验前，请准备所需的实验仪器和试剂，确保实验环境的清洁和无菌，避免污染对实验结果的影响。
2. RNA提取使用适当的方法提取目标RNA样本，并在提取过程中避免RNA的降解。
3. 反转录反应将提取的RNA样本与反转录试剂盒中的反转录酶、基质和缓冲液按推荐比例混合，并在适当的温度下进行反应。
反应时间根据样本的RNA含量和实验要求确定。
4. 停止反应通过停止反应来终止反转录反应，一般使用热敏感性酶来达到这个目的。
5. 产物处理反转录产物可以直接用于下游实验，如实时定量PCR、聚合酶链式反应等，也可以进行储存和后续处理。
四、实验结果解读根据试剂盒的使用目的和实验设计，对反转录产物进行相应的分析和解读。
常见的分析方法有凝胶电泳、实时定量PCR和测序等。
根据实验结果，可以得到RNA的表达情况、差异表达基因等相关信息。
五、注意事项1. 试剂保存：请按照试剂盒上的说明保存试剂，避免暴露在高温、冻融循环和光照等不利条件下。
2. 操作规范：请按照本说明书中提供的实验操作步骤进行操作，避免实验误差对结果的影响。
3. 质量控制：在每次实验中，请使用合适的阳性和阴性对照样品，以确保实验结果的准确性和可靠性。
4. 废弃物处理：请将使用过的试剂和实验废弃物按照相关规定进行处理，避免对环境造成污染。
一步法RT-PCR说明书
TaKaRa PrimeScript TM One Step RT-PCR Kit Ver.2
试剂盒使用说明书
该试剂盒采用一步（One step）RT-PCR法。
RNA→cDNA →PCR反应操作在同一反应体系中连续进行，反应中途不需添加任何试剂。
实验操作
1.配制RT-PCR反应液，以n个反应管为例。
首先，配制如下混合体系，混匀后分加到n个PCR反应管中。
RNase Free dH2O 20μI X (n+1)
2x1 Step Buffer 25μI X (n+1)
PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 2μI X (n+1)
其次，向PCR反应管中加入欲检测病原的扩增引物（即上下游引物）和样品抽提RNA。
上游引物1μI
下游引物1μI
样品RNA 1μI
总体系：50 μI
2．进行RT-PCR反应
50℃30 min
94℃ 2 min
94℃30 sec
50～65℃（以相应的引物而定） 30 sec 30 循环72℃ 1 min
72℃ 10 min
试剂盒自带有确保试剂有效性的阳性对照RNA以及相应的扩增引物（Positive Control RNA, Control F-1 Primer, Control R-1 Primer）,扩增产物为462bp。
扩增后如果试剂盒阳性对照电泳结果为阳性说明试剂盒所有试剂有效，RT-PCR反应液体系没问题。
1．总RNA的提取、纯化和反转录（Takara）1.1 总RNA的提取（1）取新鲜或者-80℃冻存的组织，添加液氮充分研磨，约每100 mg组织加入1mL RNAiso plus裂解，振荡混匀后室温静置5 min；（2）以每毫升RNAiso对应0.2 mL氯仿的比例加入氯仿，振荡15 s，室温静置3 min；（3）12000 g，4℃，离心15 min，取上清至新的Eppendorf管中（上层：无色水相为RNA，中层：白色为DNA，下层：红色为蛋白）；（4）在得到的水相中加入等体积异丙醇，混匀后-20℃放置20～30 min；（提取dsRNA时，加入等体积的异丙醇和3M NaCl混合液（异丙醇：3M NaCl=1：1））（5）12000 g，4℃，离心10 min，去除上清；（6）加入1 mL75%乙醇（DEPC水和无水乙醇配置，-20℃预冷）洗涤沉淀；（7）8000 g，4℃，离心5 min，去除上清，干燥RNA沉淀；（8）用20～30 μL DEPC水溶解RNA；（9）通过甲醛琼脂糖凝胶电泳判断RNA完整性，用Nanodrop紫外分光光度仪检测RNA纯度和浓度。
1.2 总RNA的纯化1) 在微量离心管中配制下列反应液。
10×DNase I Buffer 5 μLTotal RNA 20~50 μgRecombinant DNase I (RNase-free) 2 μL（10 units）RNase Inhibitor 20 units补DEPC处理的ddH2O至50 μL2) 37℃反应20～30 min。
3) 按以下方法失活Recombinant DNase I。
（1）加入2.5 μL0.5 M EDTA，混匀，80℃保持2 min。
（2）用DEPC处理的ddH2O定容至100 μL。
4) 加入10 μL 3 M醋酸钠和250 μL乙醇，混匀后-80℃放置20 min。
5) 4℃，12 000 g离心10 min，弃上清。
Cat. #9790A9791A Product ManualTaKaRa BioMasher Standard (Non-sterile)TaKaRa BioMasher Standard (Sterile)For Research UseTable of ContentsI. Description (3)II. Components (3)III. Storage (3)IV. Materials (3)V. Protocol (3)VI. Experimental Examples (4)VII. Related Products (4)I. DescriptionTaKaRa BioMasher Standard is a disposable microtube homogenizer designed to efficiently crush small amounts of biological samples for nucleic acid and/or protein extraction. This product is a set of a 1.5-ml microtubes and micro stir bars. The inner wall of the tube and the tip of the stir bar are textured allowing effective disruption of the sample. In addition, there is a lid to prevent splashing of the sample and reagents during sample processing. After the sample has been homogenized, the tube can be centrifuged to minimize sample loss.The TaKaRa BioMasher Standard is available either sterilized (Cat. #9791A) or nonsterilized (Cat.# 9790A).II. Components(1) TaKaRa BioMasher Standard (micro stir bar and microtube) 50(2) Stir bar grip (PESTLE GRIP) 1III. Storage Room temperatureKeep out of sun- and UV light.IV. MaterialsTaKaRa BioMasher StandardPolypropylene microtubes AutoclavablePolyacetal stir bar Not autoclavable*Silicon rubber stir bar grip Autoclavable* : The stir bar can not be autoclaved. If you require sterilization, please use Cat. #9791A. V. ProtocolNOTE: Wear a mask, gloves, lab coat, and safety goggles. If necessary, perform in a safety cabinet.1. Insert the micro stir bar into the end of the PESTLE GRIP.2. Add the sample to the microtube. Use less than 100 mg of sample. If necessary, add theextraction reagent (less than 250 μl).3. Insert the micro stir bar into the microtube. With the PESTLE GRIP, rotate and move themicro stir bar up and down, crushing the sample. If necessary, perform on ice.4. After crushing, disconnect the PESTLE GRIP and discard the micro stir bar. The PESTLEGRIP can be used repeatedly; store for future use.5. Close the lid of the microtube. The sample is ready for extraction.VII. Related ProductsRNAisoPlus （Cat. #9108/9109）*NucleoSpin® RNA II （Cat. #740955.10/.50/.250）NucleoSpin® RNA XS （Cat. #740902.10/.50/.250）NucleoSpin® Tissue （Cat. #740952.10/.50/.250）NucleoSpin® Tissue XS （Cat. #740901.10/.50/.250）Wide-Range DNA Ladder (100 - 2,000 bp) （Cat. #3427A/B）* : Not available in all geographic locations. Check for availability in your region.VI. Experimental ExampleTotal RNA extraction from mouse liver 100 mg of mouse liver was crushed using the TaKaRa BioMasher Standard (Sterile). As a comparison, 100 mg frozen mouse liver tissue was crushed with a mortar or with crusher beads. For all samples, total RNA was extracted using 1 ml RNAiso Plus (Cat. #9108/9109) according to the recommended protocol. Total RNA was quantified and analyzed on an 1% agarose gel.Results: Processing the samples using the TaKaRa BioMasher Standard had similar extraction efficiency as the mortar and bead crushing protocols.Crushing method total RNA (μg) A 260/A 2801．Mortar 360 1.702．Mortar 424 1.803．Crusher beads 530 1.924．Crusher beads 494 1.935．TaKaRa BioMasher Standard 411 1.896．TaKaRa BioMasher Standard4311.90M 125364(bp)2,000750Lane 1-6 Equal amounts of RNA M Wide-Range DNA Ladder (100 - 2,000 bp)NOTE : This product is for research use only. It is not intended for use in therapeutic or diagnostic procedures for humans or animals. Also, do not use this product as food, cosmetic, or household item, etc.Takara products may not be resold or transferred, modified for resale or transfer, or used to manufacture commercial products without written approval from TAKARA BIO INC.If you require licenses for other use, please contact us by phone at +81 77 543 7247 or from our website at .Your use of this product is also subject to compliance with any applicable licensing requirements described on the product web page. It is your responsibility to review, understand and adhere to any restrictions imposed by such statements.All trademarks are the property of their respective owners. Certain trademarks may not be registered in all jurisdictions.。
TaKaRa Ex Taq ®Code No. RR001A 包 装 量：250 Units 附带试剂：10×Ex Taq Buffer （20 mM Mg 2+ Plus ） 1 mldNTP Mixture （2.5 mM each ） 800 μl贮存溶液Tris-HCl （pH8.0） 20 mMKCl 100 mMEDTA 0.1 mMDTT 1 mMTween 20 0.5%Nonidet P-40 0.5% Glycerol 50%dNTP Mixture可直接用于PCR ，无需稀释。
浓 度：每种dNTP 为2.5 mM状 态：水溶液（钠盐，pH7～9）纯 度：每种dNTP ≥98%活性定义用活性化的大马哈鱼精子DNA 作为模板/引物，在74℃、30分钟内，摄入10 nmol 的全核苷酸为酸性不溶物的活性定义为1个活性单位（U ）。
活性测定反应液组成25 mM T APS (pH9.3，25℃)50 mM KCl2 mM MgCl 20.1 mM DTT200 μM each dATP ･dGTP ･dCTP100 μM [3H]-dTTP0.25 mg/ml activated salmon sperm DNA纯 度10 U 的本酶和0.6 μg 的λ-Hin d III 、0.6 μg 的Supercoiled pBR322DNA 或0.6 μg 的λDNA 在74℃下反应1小时，均未检出内切酶和外切酶活性。
用 途 P CR 法扩增DNA 。
PCR 产物 使用本制品扩增得到的大部分PCR 产物3’端附有一个“A”碱基，因此可直接克隆于T-Vector 中。
也可以在末端平滑化和磷酸化后克隆到平滑末端载体。
PCR 性能 1） 以λ DNA 为模板，可以很好地扩增20 kb 的DNA 片段。
2） 以人基因组DNA 为模板，可很好地扩增17.5 kb （β-Globin gene ）的DNA 片段。
使用试剂盒时所有的试剂要放置在冰上转录反应步骤和孵育1.解冻冷冻的试剂把RNA聚合酶混合物放置在冰上，它在甘油中保存，没有被保存在-20。
vortex10×reaction buffer和2×NTP/CAP至完全溶解，一旦解冻，反应过程中把2×NTP/CAP 放在冰上，10×reaction buffer保存在室温，所有的试剂在打开之前都应该短暂的微微离心，以防丢失或污染到离心管边缘的物质。
2.室温下转录反应如果反应在冰上进行，10×reaction buffer中的亚精胺可以与模板中的DNA共沉淀，离心管中加入水和核苷酸后再加入10×reaction buffer。
以下是一个20ul的反应体系，可按需要放大或缩小。
当RNA长度为300base-5kb时采用以下反应体系(用0.1-0.2ug PCR产物模板或0-1ug线性质粒模板）对于更长或更短的转录，参考20页的“Optimizing yield of long transcripts’’和“Optimizing yield of short transcripts”部分。
当合成转录的长度大于5或6KB时，限制GTP生成率，会导致产量降低、过早终止转录。
为了避免这种情况，可能需要补充额外的GTP支持反应。
下面是添加特定体积的GTP对普通转录反应的影响。
（对于T7和T3试剂盒，提供的GTP为30mM。
对于SP6，为20mM.）应该添加多少额外的GTP?对于5-8KB的长度，我们建议最初测试加入1ul的GTP，对于更长的模板应该试试滴定额外的GTP确定所需的最小值。
添加GTP将减少转录合成加帽的比例，但将引起产量升高。
加帽转录的比例与反应中GTP中CAP的模拟物的比率成正比。
RNA产量与良好的加帽效率之间的平衡在网织红细胞溶解物中，我们测试了GTP不同比例的CAP模拟物对转录反应的RNA产量和产生RNA的翻译效率的影响。
RT-PCR实验步骤一．实验器具：1.移液枪：1ml、200μl、20μl、10μl、2.5μl2.吸头：1ml、200μl、20μl3.匀浆管：5ml4.EP管：1.5ml、500μl、200μl5.试剂瓶：棕色试剂瓶(广口，放75%乙醇)6.量筒：100ml7.容量瓶：1000ml8.试管架：5ml、1.5ml、20μl9.铝制饭盒：1-2个10.大瓷缸：1个11.锡泊纸：一卷12.卷纸：2卷13.三角烧瓶：带盖，稍大二．实验器具处理1.塑料制品：(包括枪头、EP管、匀浆管等)先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制品逐个浸泡其中(注意：小枪头要充分浸泡，必要时需要针筒打入DEPC水)，过夜后取出(注意：DEPC水很难自然晾干，所以建议先将刚取出的DEPC物品甩干，枪头装入枪头盒后甩干，EP管和匀浆管装入饭盒后甩干，然后在37度孵箱烘干)。
高压后烤干备用。
如果DEPC处理过的物品时间已超过一个星期，再次使用前应再次高压。
2.玻璃制品：泡酸过夜，冲洗干净，先泡1‰DEPC过夜，再蒙锡纸烤干备用。
3.匀浆器：(包括剪刀、镊子)先洗净后，超声消毒即可(不需要泡DEPC)。
三．试剂配制1．DEPC水：吸出1ml DEPC放在1000ml容量瓶中加双蒸水定容至1000ml，配成1‰DEPC水，并充分振荡混匀备用。
2．75%乙醇：用无水乙醇+DEPC水配，然后放-20℃保存(DEPC水需先高压，高压时注意：1.装DEPC水的瓶子在盖子和瓶之间要放上线头；2.高压时间在40-45分钟，所以水要适当多加一点；3.高压结束后，不要强行放气，要让压力自然下降，不然水会喷出)。
3．异丙醇：放入棕色瓶中。
4．氯仿：放入棕色瓶中。
5．琼脂糖四．缓冲液配制1．电泳缓冲液(5×TBE贮存液)：Tris 54g、硼酸 27.5g、0.5M EDTA 20ml pH8.0、加蒸溜水至1000ml。
使用时，将5×TBE稀释10倍成0.5×TBE就可以在电泳时使用(工作浓度) 2．上样缓冲液(6×缓冲液，4℃保存)：0.25%溴酚蓝、0.25%二甲苯青FF、30%甘油五．琼脂糖凝胶配制1．1.0%：1.0g琼脂糖+100ml电泳缓冲液，微波炉加热至沸腾(如果首次煮胶，一定要煮透，以不出现泡沫为标志)，熔化的琼脂物冷却至60℃时加入10mg/ml溴化乙锭2.5μl，充分混匀，将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中，在室温下放置30-45min(可以放入4度冰箱加快琼脂糖凝固)后现进行电泳。
Code No. RR036A 研究用PrimeScript TM RT Master Mix(Perfect Real Time)说明书目录内容页码●制品说明1●制品内容 1 ●试剂盒外必备材料 1 ●保存 1 ●特长 1 ●使用注意 2 ●操作方法 2 ●Real Time PCR 2 ●实验例 5 ●附录5●关联产品7本制品是2 Step Real Time RT-PCR用的最佳反转录反应试剂。
5×PrimeScript RT Master Mix中含有定量RT-PCR的反转录反应所需的所有试剂（PrimeScript RTase、RNase Inhibitor、Random 6 mers、Oligo dT Primer、dNTP Mixture、反应Buffer），加入模板RNA和水即可迅速进行反应。
使用具有较强延伸能力的PrimeScript RTase，与制品PrimeScript RT reagent Kit（Perfect Real Time）（Code No.RR037A/B）相同，可以在较短时间内高效合成Real Time PCR用模板cDNA。
本制品合成的cDNA可以用于SYBR®Green分析法和TaqMan®探针分析法，可以根据实验目的与SYBR®Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) 和Premix Ex Taq (Probe qPCR)等定量试剂配合使用，能够进行高性能的基因表达分析。
注意：Takara Bio使用SYBR® Green I作为研究试剂已得到Molecular Probes Inc.的许可。
SYBR®为Molecular Probes Inc.的注册商标。
●制品内容（10 μl反应×200次）1. 5×PrimeScript RT Master Mix（for Real Time）*1 400 μl2. RNase Free dH2O 1 ml×2支3. EASY Dilution（for Real Time PCR）*2 1 ml*1：含有PrimeScript RTase、RNase Inhibitor、Random 6 mers、Oligo dT Primer、dNTP Mixture、反应Buffer（含有Mg2+）。
*2：制作标准曲线时梯度稀释cDNA或RNA标准品的稀释液。
模板DNA或RNA如果用水或TE Buffer稀释时，由于受Microtube吸附作用等的影响，往往不能准确地进行稀释，导致实验结果精度降低。
使用本制品时，即使稀释至低浓度也能够进行准确地稀释，容易在宽广范围内获得准确定量的标准曲线。
本制品不影响反转录和PCR反应，用其稀释后的样品可直接使用。
EASY Dilution也可以单独购买（Code No.9160）。
注意：EASY Dilution请与本公司Real Time PCR试剂组合使用，对于其他公司的同类制品的适用性本公司尚未进行确认。
●试剂盒外必备材料热循环仪（或37℃水浴和85℃加热块）反转录反应所用0.2 ml和1.5 ml的微量反应管微量移液器和枪头（高压灭菌）●保存：-20℃。
●特长1．制品为预先混好的Premix形式，只需加入模板RNA和水便可以开始反应。
2．可以在较短时间内高效合成Real Time PCR用cDNA，是进行2 Step Real Time RT-PCR反应的最佳试剂。
3．使用了Random 6 mers和Oligo dT Primer 2种反转录引物，可以合成最适的Real Time PCR用cDNA。
4．Real-time RT PCR定量需要建立标准曲线，建立标准曲线的条件就是需要将总RNA和反转录cDNA 稀释到较低的浓度。
如果用水或TE Buffer稀释时，由于模板浓度低不稳定，因而会缩小曲线范围，结果精度降低。
本制品中附加了标准曲线制作用稀释液EASY Dilution（for Real Time PCR），将Total RNA 或cDNA稀释至低浓度时也能够进行准确稀释，容易在宽广范围内获得准确定量的标准曲线。
以下为使用本试剂盒时的注意事项，使用前一定认真阅读。
1．5×PrimeScript RT Master Mix在使用前要小心地离心收集到反应管底部。
由于5×PrimeScript RT Master Mix粘度高，用移液枪慢慢反复吸打充分混匀后使用。
2．分装试剂时务必使用新的枪头（Tip），以防止样品间污染。
3．本制品中已经加入了反转录Primer（Oligo dT Primer 和Random 6 mers），如果要使用Gene Specific Primer进行反转录反应，则不能使用本制品。
●操作方法反转录反应RNA的制备方法参见“附录”。
1.* 反应体系可按需求相应放大，10 μl反应体系可最大使用500 ng的Total RNA。
2. 轻柔混匀后进行反转录反应，条件如下:37℃ 15 min（反转录反应）85℃ 5 sec（反转录酶的失活反应）4℃注意：得到的RT反应液加入到下一步的Real Time PCR反应体系中，其加入量不要超过Real Time PCR反应体积的1/10（V/V）量。
●Real Time PCR以下是使用本制品进行反转录反应后，选择SYBR®Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）（Code No. RR820A）进行Real Time PCR反应的操作方法。
采用TaqMan®探针法进行检测时，请选择Premix Ex Taq （Probe qPCR）（Code No. RR390A）。
◆应用Thermal Cycler Dice Real Time System II扩增仪的操作方法*1 通常引物终浓度为0.4 μM可以得到较好结果。
反应性能较差时，可以在0.2～1.0 μM范围内调整引物浓度。
*2 建议在25 μl反应液中使用相当于10 pg～100 ng Total RNA量的cDNA为模板。
反转录反应液的加入量不能超过PCR反应液总体积的10%。
2. 进行Real Time PCR反应。
建议采用下列图表显示的两步法PCR反应程序。
如果该程序得不到良好的实验结果时，再进行PCR 条件的优化。
当使用Tm值较低的引物或两步法PCR反应扩增性能较差时，可以尝试进行三步法PCR 扩增反应。
两步法PCR扩增标准程序：Stage 1：预变性Repeat：195℃ 30秒Stage 2：PCR反应Repeat：4095℃ 5秒60℃ 30-60秒Stage 3：Dissociation◆特别提示：本制品中使用的TaKaRa Ex Taq HS是利用抗Taq抗体的Hot Start用DNA聚合酶，与其他公司的化学修饰型Hot Start用DNA聚合酶相比，不需要PCR反应前的95℃、5～15分钟的酶的活性化反应。
如果高温处理时间过长，会使酶的活性下降，其PCR的扩增效率、定量精度等都会受到影响。
如果在PCR反应前进行模板的预变性，通常设定为95℃、30秒。
3. 实验结果分析。
反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线和融解曲线，进行PCR定量时制作标准曲线等。
分析方法参见仪器的操作手册。
◆应用Applied Biosystems7300/7500/7500 Fast Real-Time PCR System和StepOnePlus™ Real-Time PCR System的操作方法*请按照仪器使用说明书要求进行实验操作。
*1 通常引物终浓度为0.4 μM可以得到较好结果。
反应性能较差时，可以在0.2～1.0 μM范围内调整引物浓度。
*2 ROX Reference Dye II（50×）比ROX Reference Dye（50×）浓度低，使用7500 Real-Time PCR System 和7500 Fast Real-Time PCR System时，请使用ROX Reference Dye II（50×）。
使用StepOnePlus™ Real-Time PCR System和7300 Real-Time PCR System时，请使用ROX*3 建议在20 μl反应液中使用相当于10 pg～100 ng Total RNA量的cDNA为模板。
反转录反应液的加入量不能超过PCR反应液总体积的10%。
*4 按不同仪器的要求确定反应液的体积。
2. 进行Real Time PCR反应建议采用下列图表显示的两步法PCR反应程序，如果该程序得不到良好的实验结果时，再进行PCR 条件的优化。
当使用Tm值较低的引物或两步法PCR反应扩增性能较差时，可以尝试进行三步法PCR 扩增反应。
< Applied Biosystems 7300/7500 Real-Time PCR System , StepOnePlus™>两步法PCR扩增标准程序：Stage 1：预变性Reps：195℃ 30秒Stage 2：PCR反应Reps：4095℃ 5秒60℃ 30～34秒*Dissociation Stage* 使用StepOnePlus™时请设定在30秒。
使用7300时请设定在31秒。
使用7500时请设定在34秒。
< Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System >两步法PCR扩增标准程序：Stage 1：预变性Reps：195℃ 30秒Stage 2：PCR反应Reps：4095℃ 3秒60℃ 30秒Dissociation Stage◆特别提示：本制品中使用的TaKaRa Ex Taq HS是利用抗Taq抗体的Hot Start用DNA聚合酶，与其他公司的化学修饰型Hot Start用DNA聚合酶相比，不需要PCR反应前的95℃、5～15分钟的酶的活性化反应。
如果高温处理时间过长，会使酶的活性下降，其PCR的扩增效率、定量精度等都会受到影响。
如果在PCR反应前进行模板的预变性，通常设定为95℃、30秒。
3. 实验结果分析反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线和融解曲线，进行PCR定量时制作标准曲线等。
分析方法参见仪器的操作手册。
●实验例反转录反应时间和cDNA 合成量的研讨实验 [方法] 1. 反转录反应 试 剂： PrimeScript RT Master Mix （Perfect Real Time ） 模 板：Human Placenta Total RNA 2 pg ～2 μg 反应体积：20 μl反应条件： 37℃ 15、30、60 min 反应后85℃ 5 sec 热变性，4℃保存2. Real Time PCR 反应 试 剂： SYBR ® Premix Ex Taq II （Perfect Real Time ） 模 板： 上述反转录反应液2 μl 反应体积： 25 μlTarget Gene ： Human ACTB反应条件： Thermal Cycler Dice Real Time System 标准反应条件[结果]Real Time PCR 扩增曲线图及标准曲线图如下：扩增曲线图标准曲线图以上Real Time RT-PCR 扩增结果显示，不同反转录反应时间（15、30、60 min ）在宽广模板浓度范围内都可以得到同等的扩增效率。
