抗酒石酸酸性磷酸酶染色液说明书

30-40岁2型糖尿病患者血清TRACP-5b及BALP临床分析目的：分析30-40岁糖尿病患者血清骨形成指标TRACP-5b及BALP 骨吸收指标水平与骨重建失衡的机理，为糖尿病骨质疏松的早期诊断提供可能的依据。

方法：选择30-40岁2型糖尿病患者23例及对照组病例21例，分别对其血清TRACP-5b及BALP进行测量，并做统计分析。

结果：T2DM患者组血清TRACP-5b水平高于对照组（P<0.05）具有统计学差异,T2DM患者组血清BALP水平低于对照组（P<0.05）具有统计学差异。

结论：1. 2型糖尿病患者较健康对照组患者血清骨吸收指标TRACP-5b水平升高，骨形成指标BALP 水平降低，成骨作用小于破骨作用，骨质疏松的风险有增加的可能性。

（2型糖尿病患者骨质疏松风险的增加可能与BALP及TRACP-5b 存在一定的关系）。

2.骨形成标记物BALP及骨吸收标记TRACP-5b可能是2型糖尿病骨质疏松早期预测的敏感指标。

引言：2型糖尿病是一种严重威胁人类健康的慢性疾病，在造成起心、脑、肾损伤的同时，还极易引起骨重建负平衡，导致骨质疏松。

有研究明，TRACP-5b是骨吸收的特异性标志物,可反映破骨细胞的活性及骨吸收的状态；BALP是骨形成的特异性标志物，可反映成骨细胞的活性及骨形成的状态。

本课题通过对40岁以下T2DM患者观察组和健康人对照组的血清TRCAP-5b及BALP水平测量，分析骨重建失衡的机理，为糖尿病骨质疏松的早期诊断提供可能的理论依据。

1.对象和方法1.1研究对象观察组：选取23例为我院2015年3月~2015年6月住院病人，按WHO标准确诊为T2DM 患者，其中男10例，女13例，年龄30-40岁，平均年龄(65. 5 ±1 0. 7)岁, 体质量指数[ BMI=体重( kg) /身高2( m2)] 平均为24. 4 ±3. 1, 病程6月～21 年, 均为口服降糖药及通过饮食控制血糖健康对照组：同期我院健康体检者21例，其中男10例，女11例，年龄30-40岁，平均年龄xx岁，体重指数xx.且经口服葡萄糖耐量试验排除糖尿病。

抗酒石酸酸性磷酸酶5b（TRACP 5b）定量测定一、简介和用途、适用范围大量的抗酒石酸酸性磷酸酶（TRACP）是由骨吸收的破骨细胞和有活力的巨噬细胞所释放的。

在血液循环中的TRACP有TRACP 5b 和TRACP 5a二种形式， TRACP 5b 来源于破骨细胞，而TRACP 5a来源于巨噬细胞。

由破骨细胞刚分泌到血液中的TRACP 5b是有活性的酶，但当TRACP 5b在血液循环中被清除之前已无活性，并被降解为碎片。

这样TRACP 5b不会因肝、肾功能受损而在血液中积蓄。

血清中TRACP 5b均来源于破骨细胞，此酶在昼夜的活性水平变化不明显，且不受进食的影响，故可在一天的任何时候都可以采集标本进行检验。

此试剂盒依据测定由破骨细胞释放的TRACP 5b的特异性测定方法。

它可以用于测定骨吸收亢进的病人，如原发性骨质疏松和肾性骨病，也可以预测骨折的危险性，并便于了解抗骨吸收治疗的效果。

在肿瘤病人中，当TRACP 5b 的活力增高提示肿瘤骨转移。

在体外，培养基中TRACP 5b的活力大小代表了破骨细胞数量的多少，因此应用于此试剂盒在进行人的破骨细胞培养时，可用于检测破骨细胞的数量。

二、试验原理测试孔内已包被抗TRACP单克隆抗体→加入校准液、质控品和样品→加入释放剂→有活性的TRACP 5b从结合蛋白质上离解→TRACP 5b与孔内包被的抗TRACP单克隆抗体结合→加入底物pNPP孵育→加入终止液终止反应→在酶标仪上检测结果。

此试验的优点1、所测定的TRACP 5b是由破骨细胞专一释放的。

2、此试验对TRACP 5a或其它磷酸酶没有干扰。

3、溶血不影响结果。

4、不受昼夜变化的影响。

5、不受肝脏、肾脏疾病的影响。

6、不受进食的影响。

7、酶标板容易拆卸，方便检测。

三、试剂盒（一）组成1、酶标板：96孔，已包被抗—TRACP抗体。

2、质控液：3×0.5ml。

3、校准液：3×0.5ml(3×1U/L,3×5U/L,3×10U/L)。

trap染色答案：Trap染色是用于检测骨组织、骨细胞中特征物质的染色，使破骨细胞呈红色，背景呈绿色或蓝色。

抗酒石酸酸性磷酸酶（Trap）为破骨细胞的标志酶，特异地分布于破骨细胞中，为破骨细胞所特有，通常作为鉴别破骨细胞的重要标志物。

在含酒石酸的酸性条件下，trap能将萘酚AS-BI 磷酸盐水解，产生的萘酚AS-BI立即与fast red或六偶氮副品红结合，在酶活性部位形成不溶性的红色染料，通过观察红色染料的形成可间接了解酸性磷酸酶的活性，进一步鉴别及分析破骨细胞的状态。

分析：骨组织切片及trap染色实验步骤1、骨组织脱钙：新鲜骨组织固定于4%多聚jia醛24h 以上。

将组织从固定液取出置于EDTA脱钙液内脱钙（不能用含酸的脱钙液脱钙），每3天换一次脱钙液，至骨组织针扎可以顺利通过为止。

2、取材：在通风橱内用手术刀将目的部位组织修平整，将修切好的组织和对应的标签放于脱水盒内。

3、脱水：将脱水盒放进吊篮里于脱水机内依次梯度酒精进行脱水。

75%酒精4h-85%酒精2h-90%酒精2h-95%酒精1h-无水乙醇I 30min-无水乙醇II 30min-醇苯5-10min-二甲苯I 5-10min-二甲苯II 5-10min-蜡I 1h-蜡II 1h-蜡III 1h。

4、包埋：将浸好蜡的组织于包埋机内进行包埋。

先将融化的蜡放入包埋框，待蜡凝固之前将组织从脱水盒内取出按照包埋面的要求放入包埋框并贴上对应的标签。

于-20°冻台冷却，蜡凝固后将蜡块从包埋框中取出并修整蜡块。

5、切片：将修整好的蜡块置于石蜡切片机上切片，片厚4μm。

切片漂浮于摊片机40℃ 温水上将组织展平，用载玻片将组织捞起，并放进60℃ 烘箱内烤片。

待水烤干蜡烤化后取出常温保存备用。

6、石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ20min-二甲苯Ⅱ20m in-无水乙醇Ⅰ10min-无水乙醇Ⅱ10min-95%酒精5min-90%酒精5min-80%酒精5min-70%酒精5min-蒸馏水洗。

酶类染色液北京华越洋生物------------------------------------------------------碱性磷酸酶染色液(改良Gomori钙钴法) 3×50ml 酶类染色40% 4℃,避光,3个月碱性磷酸酶染色，适用于石蜡切片属于金属沉淀法,碱性磷酸酶活性出呈棕黑色,可能出现假阳性,采用阴性对照。

二甲苯应采用AR以上级别。

碱性磷酸酶染色液(改良Gomori钙钴法) 3×100ml 酶类染色40% 4℃,避光,3个月碱性磷酸酶染色，适用于石蜡切片属于金属沉淀法,碱性磷酸酶活性出呈棕黑色,可能出现假阳性,采用阴性对照。

二甲苯应采用AR以上级别。

碱性磷酸酶-PAS联合染色液6×50ml 酶类染色40% 4℃,避光,3个月碱性磷酸酶染色与过碘酸雪夫试剂合用,同时显色碱性磷酸酶和PAS阳性物质。

适用于冰冻切片、石蜡切片,碱性磷酸酶活性部位呈黑色,PAS阳性物质呈紫红色。

染色过程中注意控制过碘酸处理的时间,否则容易褪色。

中性粒细胞碱性磷酸酶染色液(NAP) 4×2ml 酶类染色40% 4℃,避光,6个月专门用于血液或骨髓细胞涂片的中性粒细胞的碱性磷酸酶染色,又称同时偶联法。

碱性磷酸酶活性部位呈蓝色,位于胞桨中。

油镜下计数100个中性粒细胞,求出百分比和积分。

非特异性反应少，结果可靠。

中性粒细胞碱性磷酸酶染色液(NAP) 4×10ml 酶类染色40% 4℃,避光,6个月专门用于血液或骨髓细胞涂片的中性粒细胞的碱性磷酸酶染色,又称同时偶联法。

碱性磷酸酶活性部位呈蓝色,位于胞桨中。

油镜下计数101个中性粒细胞,求出百分比和积分。

非特异性反应少，结果可靠。

碱性磷酸酶染色液(偶氮偶联法) 4×2ml 酶类染色40% —20℃,避光,6个月用于石蜡切片、冰冻切片、骨髓细胞涂片、血液涂片等的碱性磷酸酶染色,又称同时偶联法碱性磷酸酶活性部位呈蓝色,位于胞桨中。

抗酒石酸酸性磷酸酶染色液使用说明货号：G4561有效期：6个月有效。

产品内容：名称规格（4×10ml）保存试剂(A):TRAP固定液50ml4℃避光试剂(B):TRAP孵育液B1:AS-BI Buffer1ml-20℃避光B2:GBC染色液0.1ml4℃避光B3:TRAP Buffer9ml RT避光临用前，按B1:B2:B3=10:1:90混合，即为TRAP孵育液，即配即用。

试剂(C):苏木素染色液10ml4℃避光试剂(D):甲基绿染色液10ml RT避光产品说明：酸性磷酸酶(acid phosphatase，ACP)分布极广泛，遍布各种组织，主要存在于细胞的溶酶体内，所以常作为溶酶体标志酶。

溶酶体外的酸性磷酸酶存在于内质网和胞质内。

各种动物中的酸性磷酸酶各有不同，酸性磷酸酶的适宜pH为4.5～5.5。

存在于正常人肺泡巨噬细胞和白血病人脾脏的抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate-resistnt acid phosphatase，TRAP)均在细胞滤泡中，并不是释放入血液。

血液中的TRAP绝大多数来源于破骨细胞，因此可以通过测量血液中的TRAP了解破骨细胞的功能状态。

抗酒石酸酸性磷酸酶染色液以萘酚AS-BI为底物，在酸性pH下被酸性磷酸酶水解释放出磷酸和萘酚，萘酚不重氮盐偶联生成有色产物，定位于细胞质中，若细胞内的ACP有抗酒石酸的活性，则呈阳性反应。

该染色液可用于新鲜血涂片、细胞涂片，亦可用于冰冻切片、石蜡切片。

自备材料：1、蒸馏水、恒温箱2、载玻片、推玻片3、光学显微镜操作步骤(仅供参考)：(一)血液、细胞涂片：1、推片：取新鲜血液或骨髓涂片置于载坡片上，推玻片于载玻片保持30度，置于血液或细胞滴液的正前方，稍往后移不血液或细胞滴液接触使后者沿推片下缘散开，再匀速沿载玻片平面平稳向前滑动至铺满血膜为止。

2、自然晾干，TRAP固定液4℃固定30s～3min，多数情况下30～60s即可。

抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)检测试剂盒(PNP微板法)简介：酸酸性磷酸酶(acid phosphatase，ACP)分布极广泛，遍布各种组织，主要存在于细胞的溶酶体内，所以常作为溶酶体标志酶。

溶酶体外的酸性磷酸酶存在于内质网和胞质内，各种动物中的酸性磷酸酶各有不同，酸性磷酸酶的适宜pH为4.5～5.5。

存在于正常人肺泡巨噬细胞和白血病人脾脏的抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate-resistnt acid phosphatase，TRAP)均在细胞滤泡中，并不是释放入血液，血液中的TRAP绝大多数来源于破骨细胞，因此可以通过测量血液中的TRAP了解破骨细胞的功能状态，几乎被认为是是机体破骨活性的唯一血液指标。

TRAP一种糖基化的含金属蛋白酶，在破骨细胞(osteoclast)和破软骨细胞(chondroclast)中高表达，在活化的巨噬细胞和神经元中也有表达。

Leagene抗酒石酸酸性磷酸酶检测试剂盒(Tartrate Resistnt Acid Phosphatase Colorimetric Assay Kit)检测原理是利用Para-nitrophenyl phosphate(pNPP)为一种常用的磷酸酶显色底物，在酸性条件下，可在酸性磷酸酶的作用下生成p-nitrophenol。

在碱性条件下p-nitrophenol呈黄色，产物黄色越深，说明酸性磷酸酶活性越高，反之则酶活性越低，通过分光光度比色法(酶标仪)测定吸光度，据此通过比色分析就可以计算出酸性磷酸酶活性水平。

在适量的酒石酸存在的情况下进行酸性磷酸酶的活性检测，检测得到的酸性磷酸酶的活性就是抗酒石酸酸性磷酸酶的活性。

该试剂盒可用于检测细胞或组织的裂解液或匀浆液、血浆、血清、尿液等样品中内源性的抗酒石酸酸性磷酸酯酶活性。

该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。

组成：自备材料：1、96孔板2、水浴锅或恒温箱3、酶标仪编号名称TE0043120TStorage试剂(A): ACP Assay buffer15ml 4℃试剂(B): pNPP 2支-20℃避光试剂(C): T artrate Solution 1ml 4℃试剂(D): p-nitrophenol(10mM) 0.1ml -20℃避光使用说明书1份操作步骤(仅供参考)：1、配制检测工作液：①配制显色工作液：取出pNPP，恢复至室温后溶解于ACP Assay buffer，混匀，冰上预冷备用。

广州市外显子生物技术有限公司
抗酸染色液
产品说明：
本试剂盒方法学参照世界卫生组织(WHO)所推荐的标准
Ziehl-Neelsen法，主要用于对结核杆菌等抗酸性菌的化学
染色。

抗酸染色有两种常用方法：①碱性复红法又称萋-尼
氏(Zieh1-Neelsen)法；②荧光染料金胺O法(也称金胺－罗
丹明法)，本染色液采用的是改良碱性复红法，可以不用加
温。

结核菌、麻疯杆菌等抗酸性菌，因其菌体表面有一层类脂或
脂质之皮膜而不易着色，但一经着色后，酸性酒精的作用亦
是不容易把它脱色。

利用此特性并以增强的染色液予染色，
然后再以酸性酒精加以处理，使其脱色后再对比染色，此时
抗酸性菌仍是固定着最初色素的颜色(红色)，也就易于鉴别。

产品组成：
货号产品规格储存条件
S-1539 石碳酸复红溶液
酸性酒精溶液
亚甲基蓝溶液
10ml
30ml
10ml
RT
-- 说明书1份
有效期：12 个月。

原包装未开封染色液的使用期限为 12 个月，在有效期内的已开封染色液建议在开封后 6 个月内使用完，每次用后应及时拧紧瓶盖，以免挥发或变质。

实验步骤：
1.涂片经火焰固定，加石碳酸复红溶液染色5-10分钟。

2.水洗后沥干。

3.酸性酒精溶液脱色2分钟。

4.水洗，如残存红色，再添加酸性酒精溶液至完全脱掉红色。

5.加亚甲基蓝溶液染色30秒，水洗、干燥、镜检。

结果判定：抗酸性菌呈红色，其他细菌及细胞呈蓝色。

凯基抗酒石酸酸性磷酸酶染液试剂盒KEYGEN tartrate-resistant acid phosohate stain，TRAP stain说明书修订日期：2016.01.14 Cat number：KGA221Store at4℃for3monthsFor Research Use Only（科研专用）一、检验原理在酸性的缓冲液中，细胞内酸性磷酸酶催化底物水解，其生成物进而与一种稳定的重氮盐偶联，生成不溶性的偶氮染料沉淀，当底物中存在酒石酸时，该反应只出现在特异性细胞中。

二、试剂组成及配制*简明试剂组成表试剂组成试剂编号包装规格一、固定液40ml×1瓶二、底物液底物反应液（一）甲液①A粉×1支②B液500μL×1支乙液③C粉×1支④D液，500μL×1支底物反应液（二）①E粉×1支②F液，500μL×1支底物反应液（三）G液，1ml×1支底物反应液（四）①H粉×1支②I液，500μL×1支三、复染液苏木素10ml×1瓶甲基绿10ml×1瓶*具体试剂配制及操作一、固定液：液体，40ml×1瓶新鲜血涂片、细胞涂片或爬片、冰冻切片用固定液固定5~10min，石蜡包埋的切片经脱蜡后不需要再固定。

二、底物反应液（一）、（二）、（三）、（四）的组成及配制：底物反应液（一）组成及配制：组成：（1）A粉×1支（2）B液500μL×1支（3）C粉×1支（4）D液500μL×1支配制：临用前用移液器将B液吸入A粉中充分溶解配成甲液，备用。

再用移液器将D液吸入C粉中充分溶解配成乙液，备用。

最后将甲液与乙液混合成底物反应液（一），现用现配底物反应液（二）组成及配制：组成：（1）E粉×1支（2）F液500μL×1支配制：临用前用移液器将F液吸入E粉中充分溶解配成底物反应液（二），备用。