如何建立HPLC法测定有关物质的方法

第53卷第1期 辽 宁 化 工 Vol.53，No. 1 2024年1月 Liaoning Chemical Industry January，2024HPLC法测定头孢噻肟钠的有关物质张建廷，张巍（东北制药集团股份有限公司， 辽宁 沈阳 110027）摘 要：建立对头孢噻肟钠有关物质的检测方法。

使用安捷伦C18色谱柱，以pH6.2的磷酸氢二钠缓冲液-乙腈作为流动相。

235 nm的检测波长，30 ℃的柱温，4 ℃的进样室温度，1.0 mL·min-1的流速，10 μL的进样量。

能够对头孢噻肟钠有关物质进行准确的定性和定量。

测试结果表明，杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G、杂质H、杂质7-ACA、杂质J检测限分别为0.007 8、0.015 1、0.012 6、0.005 3、0.010 8、0.005 4、0.020 1、0.012 9、0.021 4、0.014 0 μg·mL-1，定量限分别为0.026 6、0.051 4、0.043 0、0.018 8、0.035 9、0.018 0、0.067 4、0.043 1、0.071 5、0.047 2 μg·mL-1，浓度线性范围0.018 0～16.614 μg·mL-1内线性关系较好，相关系数≥0.999；回收率在90%~108%范围内。

该方法具有较强专属性、灵敏度高且耐用性好，能够满足检测要求。

关 键 词：HPLC法； 头孢噻肟钠； 有关物质中图分类号：O657 文献标识码： A 文章编号： 1004-0935（2024）01-0170-03头孢噻肟钠属于β-内酰胺类抗生素，名称为(6R,7R)-3-[(乙酰氧基)甲基]-7-[2-氨基-4-噻唑基-(甲氧亚氨基)乙酰氨基]-8-氧代-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-甲酸钠盐，20世纪70年代由Hoechst（德国）公司和Russel（法国）公司联合研制，作为第3代头孢菌素类抗生素，其临床应用十分广泛[1-3]。

曲安奈德益康唑乳膏，每克分别含曲安奈德1.0…mg和硝酸益康唑10…mg，曲安奈德为肾上腺皮质激素类药，具有抗炎抗过敏作用，硝酸益康唑为咪唑类抗真菌药，两者联合用于治疗伴有真菌感染或有真菌感染倾向的皮炎、湿疹；由皮肤癣菌、酵母菌、霉菌所致的炎症性皮肤真菌病；由真菌、细菌所致的皮肤混合感染等。

目前国外药典均未收载曲安奈德益康唑乳膏，《中国药典》二部（2015年版）［1］已收载但无有关物质检查项。

因此，笔者参考各国药典原料药质量标准和相关文献［2-12］，建立了高效液相色谱法（HPLC）梯度洗脱测定曲安奈德益康唑乳膏中有关物质的方法，以便更好地控制产品的质量。

HPLC法测定曲安奈德益康唑乳膏中的有关物质郭盛合华润三九（南昌）药业有限公司，江西......南昌 (330012)［摘要］目的：建立HPLC法测定曲安奈德益康唑乳膏中有关物质的方法。

方法：采用高效液相色谱法，色谱条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（Kromasil…100-5…C18，4.6…mm×250…mm，5…μm），柱温为45…℃；以0.077%醋酸铵缓冲液（用磷酸调节pH值至3.0）-甲醇（80∶20）为流动相A；甲醇-乙腈（40∶60）为流动相B；流速为1.0…mL/min；梯度洗脱；检测波长为240…nm和225…nm。

结果：在225…nm检测波长下，阴性样品色谱峰、曲安奈德峰及其杂质峰对硝酸益康唑及其杂质检测无干扰，加已知杂质的供试品溶液中益康唑、益康唑杂质A、杂质B、杂质C、咪康唑及未知杂质峰和相邻色谱峰分离度均符合要求；在240…nm检测波长下，阴性样品色谱峰、硝酸益康唑及其杂质色谱峰对曲安奈德及其杂质检测无干扰，加已知杂质的供试品溶液中，曲安奈德、曲安奈德杂质A（曲安西龙）、杂质B、杂质C及未知杂质与相邻色谱峰分离度均符合要求。

结论：经过对拟定的有关物质方法的方法学验证，表明本方法具有重现性和科学性，可用于曲安奈德益康唑乳膏有关物质检查。

ＨＰＬＣ法测定甘氨酰－Ｌ－谷氨酰胺有关物质目的：建立测定甘氨酰-L-谷氨酰胺有关物质的高效液相色谱法。

方法：采用ODS C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以0.05 mol/L磷酸二氢钠缓冲溶液（用磷酸溶液调节pH至3.0）-甲醇（90∶10）为流动相，流速1.0 ml/min，于225 nm波长处测定。

结果：在本色谱条件下，2种有关物质均能得到较好的分离，且在测定范围内有较好的线性及精密度。

结论：采用HPLC法测定甘氨酰-L-谷氨酰胺有关物质的方法简便、准确、灵敏度高，方法可靠，可用于甘氨酰-L-谷氨酰胺有关物质的测定。

[Abstract] Objective: To establish a HPLC method for determination of two related substances in glycyl-L-glutamine. Methods: The separation was performed with a C18 ODS column (4.6 mm×250 mm, 5μm) ; the mobile phase consisted of 0.05 mol/L sodium dihydrogen phosphate (adjust pH value to 3.0 with phosphoric acid)-methanol(90∶10); the flow rate was 1.0 ml/min; the detection wavelength was set at 225 nm.Results: In this chromatography system, two related substances had a good separation and a good linear relationship over the determination concentrations. Conclusion: This method is simple,accurate,sensitive and applicable for related substances determination of glycyl-L-glutamine.[Key words] Glycyl-L-glutamine; Related substances; HPLC甘氨酰-L-谷氨酰胺为二肽类氨基酸类，是复方氨基酸(15)双肽(2)注射液中的主要成分之一。

有关物质的HPLC方法建立有关物质特定物质中不是主要组成物，但与成份相关的物质。

有关物质的来源原料药合成过程中带入;制剂过程中产生;或是在贮藏、运输、使用过程中产生。

有关物质的计算方法杂质对照品法@加响应因子（即重量校正因子）计算的自身对照法、@不加响应因子计算的自身对照法@根据不同杂质采用不同方法等。

有关物质的计算方法定量检测和限度检测溶解度考察考察被测物在水、甲醇、乙腈、冰醋酸、乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷等几种常用溶剂中的溶解度，判断被测物极性强弱。

紫外光谱绘制考察被测物在水、甲醇、乙腈等常用溶剂的紫外吸收情况，一般选取最大吸收波长作为流动相选择时的检测波长。

几种被测物最大吸收波长不一致时，选取共同吸收较大的波长。

流动相的选择中性成分▪被测物为中性成分时，一般选择甲醇-水、乙腈-水、四氢呋喃-水三种系统。

乙腈-水系统由于粘度小，通常可以得到良好的柱效。

此外，乙腈的紫外末端吸收比甲醇小，在低波长处检测基线波动小，测定误差小。

▪被测物为极性较大的中性成分时，系统中甲醇或乙腈的比例可适当小些。

被测物为极性较小的中性成分时，可适当增大甲醇或乙腈的比例。

碱性成分▪向流动相中加入胺类扫尾剂。

常用三乙胺、二乙胺、乙二胺、正丁胺等。

▪加入反离子，常用的离子对试剂为烷基磺酸盐，如戊烷磺酸钠、庚烷磺酸钠、辛烷磺酸钠及十二烷基磺酸钠。

高碳数离子对试剂使保留时间过长，可更换低碳数的离子对试剂。

流动相的pH 一般为3-5。

酸性成分▪向流动相中加入少量弱酸，常用甲酸、醋酸。

适用于分离3≤pKa≤7的弱酸。

▪加入反离子，常用的离子对试剂为四丁基季胺盐及四丁基磷酸盐等。

流动相的pH一般为7-7.5。

流动相的要求▪被测物之间分离良好，分离度达到1.5以上。

主成分保留时间以10分钟为宜。

分析时间通常为主成分保留时间的2-3倍。

分析时间过长的可考虑采用剃度洗脱。

检测波长的确定▪以选定的流动相为溶剂，考察被测物的紫外吸收情况。

有DAD检测器的，考察主成分峰纯度，应达到98%以上。

hplc法测定有关物质时已知杂质的计算方法文章标题：深度解析HPLC法测定有关物质时已知杂质的计算方法在现代科学研究和生产实践中，高效液相色谱法（HPLC法）被广泛应用于有关物质的检测与分析。

在实际操作中，我们通常会遇到已知杂质的情况，而准确计算这些已知杂质的含量和相关数据是非常关键的。

本文将深入探讨HPLC法测定有关物质时已知杂质的计算方法，从理论到实践，带你全面了解该主题。

1. HPLC法的概念和原理HPLC法是一种高效的色谱分离技术，其基本原理是利用高压将样品溶液通过填充有吸附剂的色谱柱，利用样品中成分在不同吸附剂上的分配系数差异实现分离。

通过流动相、固定相和外加压力的作用，样品成分可被分离并检测。

2. 已知杂质在HPLC法中的作用已知杂质是指我们已经对其结构和性质有一定了解的杂质，在实际样品中常常存在。

在HPLC法中，已知杂质的存在可能对分析结果产生影响，因此需要对其含量进行准确计算。

3. 已知杂质的计算方法针对已知杂质的测定，我们可以使用标准曲线法、内标法或加标法等方法进行计算。

标准曲线法通过建立标准曲线，根据样品的峰面积与浓度关系进行计算；内标法是在样品中加入内标物质，利用内标物质与目标物质的浓度比计算目标物质的含量；而加标法则是在样品中添加已知量的标准品，通过比较加标前后的峰面积进行计算。

4. HPLC法测定中需要注意的关键点在实际操作中，我们需要关注样品前处理、流动相配制、色谱柱使用和检测条件设置等方面，以确保测定结果的准确性和可靠性。

对于已知杂质的计算，也需要考虑实际样品的特点和可能的干扰因素。

5. 个人观点和总结从我个人的经验来看，HPLC法测定有关物质时已知杂质的计算方法虽然较为复杂，但通过深入学习和实践检验，我们可以掌握其关键技术要点，并灵活运用于实际工作中。

在深入理解HPLC法测定的原理基础上，我们能更好地应对各种实际情况，确保分析结果的准确性和可靠性。

通过本文的深度探讨，相信读者对HPLC法测定有关物质时已知杂质的计算方法有了更清晰的认识。

有关物质测定hplc方法的建立一、开始之前必须明白：1、有关物质来源的两种途径：1）合成过程中的中间体和副产物；2）储存过程中产生的降解产物；2、分析你的样品结构，熟悉样品的基本性质；3、样品中可能含有的中间体；4、样品的基本稳定性和可能产生的降解产物；二、准备工作1、查阅文献，看看是否同行已经做过类似的工作，有的话就简单了，直接奔主题了。

2、没有文献（苦！），那就很是麻烦了。

1）分析结构，看看有无紫外吸收，有就比较简单，选用紫外检测器就行了，没有的话那就麻烦，可以选用蒸发光散射检测器等；2）分析结构，看看选用何种色谱方式进行分离（正相或者反相色谱）；3）分析结构，看看流动相该如何选择，要不要选用一些离子对试剂。

4）分析结构。

5）与同类产品进行比较；三、开工（以紫外检测为例）1、流动相的选择（采用粗品进行选择）1）、有文献，按文献进行优化。

不过我得提醒一下，文献的方法参考是可以的，要想完全按照他的条件做出来是很难的。

2）、没有文献。

a、紫外扫描一下，看看哪里有最大吸收。

将能得到的中间体、副产物、分解产物、样品配成相同浓度，在紫外扫描分光光度计上扫描一下，选择所有物质具有相同的最大吸收处的波长作为测定波长。

要是有pda检测器就不需要这一步了。

b、还是得找一些资料，看看类似的样品的流动相，以它为起始流动相进行选择，如果没有，那就找专业书吧，看看它是怎么教你选择流动相的。

2、最低检测限3、系统适应性试验重复进样5次，记录色谱图，给出系统评价报告4、考察中间体及副产物和样品的分离度。

同时定出中间体在色谱图中的出峰位置，为定质量标准提供依据。

5、考察降解产物和样品的分离情况。

这个一般是通过破坏性试验来考察。

常用的一般是高温、强光、氧化、强酸、强碱五个因素进行考察，通过考察，应该可以知道色谱图中那些峰是由于什么因素产生，这个也可为定质量标准提供依据。

6、根据上面的试验，应该可以知道样品的一些大概情况了，样品中有哪些杂质应该比较明确了。

高效液相色谱法测定Ｄ－泛酸钠有关物质目的：建立高效液相色谱法测定D-泛酸钠的有关物质。

方法：采用色谱柱C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，以甲醇-0.2%磷酸溶液（10∶90）为流动相，流速1 ml/min，进样量10 μl，检测波长214 nm。

结果：D-泛酸钠主峰与有关物质峰达到有效分离。

结论：高效液相色谱法准确、灵敏，重现性好，可用于D-泛酸钠有关物质的检查。

标签：泛酸钠；有关物质；HPLC泛酸钠（Sodium Pantothenate）是泛酸的钠盐。

泛酸是B族维生素的一种，为多种代谢环节中包括碳水化合物、蛋白质、脂肪及上皮功能维持正常所必需的辅酶A的组成部分，临床主要用于泛酸缺乏(如吸收不良综合征、热带口炎性腹泻、乳糜泄、局限性肠炎或泛酸拮抗药物应用)的预防和治疗，维生素B族物质缺乏时的辅助治疗以及一些其他疾病的辅助治疗（如链霉素中毒、术后肠梗阻、类风湿等）。

游离泛酸极不稳定，常以钠盐或钙盐的形式存在。

近年，对泛酸钠的研究日趋增多，已见有泛酸钠的制备、结构确证和药理方面的报道[1~5]，但在质量控制方面尚未见有关物质检查的研究报道。

本文采用自身对照，建立了HPLC法检测D-泛酸钠的有关物质，方法准确、简便、重现性好，可作为控制D-泛酸钠产品质量的方法。

1 仪器与试药Agilent1100高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；HH-2数显恒温水浴锅（国华电器有限公司）。

泛酸钠（浙江杭康海洋生物药业有限公司，批号040602，040606，040610）；盐酸（分析纯，杭州试剂总厂）；氢氧化钠（分析纯，青岛海智通科技有限公司）；过氧化氢（分析纯，河北健宁医药化工厂）；磷酸（分析纯，天津市益民化学试剂厂）；甲醇（色谱纯，天津四友生物医学技术有限公司）。

2 方法与结果2.1 色谱条件色谱柱：C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.2%磷酸溶液（10∶90）；流速1 ml/min；进样量10 μl；检测波长214 nm。

HPLC测定有关物质和含量方法验证1．有关物质（适用于API，制剂，也适用于起始物料，中间体）有关物质方法验证的前提条件：1.各杂质与主峰的混合溶液能用拟定的分析方法有效分离2.根据混合溶液中各峰的紫外吸收波长（或单独测定各组分紫外吸收），选择合适的检测波长。

多波长检测（如有）则分别考察。

3.在检测波长下，选择峰高最小的，计算S/N，预估主成分浓度4.各杂质纯度已知5.根据合成跟踪检测，合理制定各杂质的限度6.供试品溶解方法和提取方法得到合理证明1.1专属性：1.1.1概念在其他成分（如其他杂质，辅料，溶剂）可能存在的情况下，拟定的分析方法能正确测定被检测物的能力。

1.1.2试验方法1.1.2.1定位试验：A.目的对各已知杂质和主峰进行定位B.试验方法：a．配制一定浓度（能够显示出峰纯度，一般为0.1mg/ml）的各已知杂质溶液、拟检测浓度的主成分作为定位溶液b．配制限度浓度各已知杂质与检测浓度的主成分的混合溶液作为分离度试验溶液c．使用拟定分析方法分别进行定位。

C.试验要求：a．空白应不干扰各杂质的测定：如杂质附近有空白峰，二者分离度应大于1.5；杂质峰保留时间处不得为梯度峰拐点b．定位溶液中，已知杂质与主峰的峰纯度应符合规定c．分离度试验溶液中，主峰与相邻杂质的分离度应大于2.0（至少1.5）；各已知杂质之间的分离度应大于1.5（至少1.2）；1.1.2.2强制降解试验A.目的一是通过考察药品在一系列剧烈条件下的稳定性，了解该药品内在的稳定特性及其降解途径与降解产物。

其二，这些试验也能在一定程度上对有关物质分析方法用于检查降解产物的专属性进行验证。

B.试验方法对于高温、光照、强酸、强碱及强氧化剂的浓度及时间、取样方式等没有明确的规定。

具体品种具体模索，初步试验了解样品对影响的因素（高温、光照、酸、碱、氧化）等条件基本稳定情况后，进一步调整破坏试验条件，只要使主药有一定量的降解，并对可能的降解途径和降解机制进行分析，保证实验的意义即可。