高效液相色谱方法通则

高效液相色谱法：系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。

注入的供试品，由流动相带入色谱柱内，各组分在柱内被分离，并进入检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。

1.对仪器的一般要求和色谱条件高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。

色谱柱内径一般为3.9～4.6mm，填充剂粒径为3～10μm。

超高液相色谱仪：是适应小粒径（约2μm）填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度检测的高效液相色谱仪。

（1）色谱柱反相色谱柱：以键和非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。

常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等；常用的填充剂优十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。

正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。

常见的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。

氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反向色谱。

离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。

有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。

手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。

色谱柱的内径和长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分离物质的性质来选择合适的色谱柱。

温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。

为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度，但一般不宜超过60℃。

残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱，流动相的pH值一般应在2～8之间。

残余硅羟基已封闭的硅胶、聚合物复合硅胶或聚合物色谱柱可耐受更广泛pH值的流动相，适合于pH值小于2或大于8的流动相。

（2）检测器最常用的检测器为紫外-可见分光检测器，包括二极管阵列检测器，其他常见的检测器有荧光检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。

单抗N 糖谱测定法
第一法亲水相互作用色谱法
本法系通过N糖苷酶F（PNGase F）对单抗N糖进行酶切、对酶切的N 糖进行标记衍生，然后用超高液相色谱法对单抗N糖谱进行测定。

照高效液相色谱法（通则0512）测定。

试剂
(1)N 糖苷酶F（PNGase F）
(2)2-氨基苯甲酰胺(2-AB)标记溶液: 取 350μl 二甲基亚砜（DMSO）和 150 μl 乙酸，混均。

精密称取 25 mg 2-AB 加入上述溶液中，充分溶解。

精密称取 30 mg 氰基硼氢化钠加入上述溶液中，充分溶解（可适当加热）。

(3)系统适用性对照品。

色谱条件
用酰胺基键合硅胶填充色谱柱，柱长 150mm，内径 2.1mm，粒度 1.7 μm，或等效色谱柱；柱温为 60℃，供试品保存温度为 2～8℃；以
50 mmol/L 的甲酸铵溶液（pH4.5）为流动相 A 液，以乙腈为流动相
B 液，梯度洗脱 60.0 分钟（梯度表）；荧光检测器检测，检测波长为：激发波长 330nm，发射波长 420nm，增益 10。

系统适用性对照品溶液的制备
( 1 )N糖的酶切。

0721维生素A测定法本法是用紫外-可见分光光度法（通则0401）或高效液相色谱法（通则0512）测定维生素A 及其制剂中维生素A的含量，以单位表示,每单位相当于全反式维生素A醋酸酯0.344μg或全反式维生素A醇0.300μgo测定应在半暗室中尽快进行。

第一法（紫外-可见分光光度法）由于维生素A制剂中含有稀释用油和维生素A原料药中混有其他杂质，采用紫外-可见分光光度法测得的吸光度不是维生素A独有的吸收。

在以下规定的条件下，非维生素A物质的无关吸收所引人的误差可以用校正公式校正，以便得到正确结果。

校正公式采用三点法，除其中一点是在吸收峰波长处测得外，其他两点分别在吸收峰两侧的波长处测定，因此仪器波长应准确，在测定前，应对仪器波长进行校正。

测定法取供试品适量，精密称定，加环己烷溶解并定量稀释制成每ImI中含9〜15单位的溶液，照紫外-可见分光光度法（通则0401）,测定其吸收峰的波长，并在下表所列各波长处测定吸光度，计算各吸光度与波长328nm处吸光度的比值和波长328nm处的（E陵）值。

如果吸收峰波长在326〜329nm之间，且所测得各波长吸光度比值不超过表中规定的±0.02,可用下式计算含量：每Ig供试品中含有的维生素A的单位=（E怂）（328nm）×1900如果吸收波长在326〜329nm之间，但所测得的各波长吸光度比值超过表中规定值的±0.02,应按下式求出校正后的吸光度，然后再计算含量：4328（校正）=3.52（2A321-A3K-A340）如果在328nm处的校正吸光度与未校正吸光度相差不超过±3.0%,则不用校正，仍以未经校正的吸光度计算含量。

如果校正吸光度与未校正吸光度相差在一15%至一3%之间，则以校正吸光度计算含量。

如果校正吸光度超出未校正吸光度的一15%至一3%的范围，或者吸收峰波长不在326〜329nm 之间，则供试品须按下述方法测定。

标准操作规程1目的：建立高效液相色谱测定法操作规程，以使检验操作规化。

2适用围：适用于高效液相色谱测定法检验操作全过程。

3责任：QC人员对本SOP实施负责。

4容高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。

注入的供试品，由流动相带入色谱柱，各组分在柱被分离，并进入检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。

4.1.对仪器的一般要求和色谱条件高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。

色谱柱径一般为3.9~4.6mm，填充剂粒径为3~10μm。

超高效液相色谱仪是适应小粒径（约2μm）填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度检测的高效液相色谱仪。

4.1.1.色谱柱反相色谱柱：以键合非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。

常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等；常用的填充剂有十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。

正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。

常用的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。

氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反相色谱。

离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。

有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。

手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。

色谱柱的径与长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分离物质的性质来选择合适的色谱柱。

温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。

为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度，但一般不宜超过60℃。

残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱，流动相pH值一般应在 2〜8之间。

残余硅羟基已封闭的硅胶、聚合物复合硅胶或聚合物色谱柱可耐受更广泛pH值的流动相，适合于pH 值小于2或大于8 的流动相。

高效液相色谱法：系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。

注入的供试品，由流动相带入色谱柱内，各组分在柱内被分离，并进入检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。

1.对仪器的一般要求和色谱条件高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。

色谱柱内径一般为3.9～4.6mm，填充剂粒径为3～10μm。

超高液相色谱仪：是适应小粒径（约2μm）填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度检测的高效液相色谱仪。

（1）色谱柱反相色谱柱：以键和非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。

常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等；常用的填充剂优十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。

正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。

常见的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。

氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反向色谱。

离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。

有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。

手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。

色谱柱的内径和长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分离物质的性质来选择合适的色谱柱。

温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。

为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度，但一般不宜超过60℃。

残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱，流动相的pH值一般应在2～8之间。

残余硅羟基已封闭的硅胶、聚合物复合硅胶或聚合物色谱柱可耐受更广泛pH值的流动相，适合于pH值小于2或大于8的流动相。

（2）检测器最常用的检测器为紫外-可见分光检测器，包括二极管阵列检测器，其他常见的检测器有荧光检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。

一．概述1.维生素B2片含量测定：照高效液相色谱法（通则0512）测定。

1.1色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0. Olmol/L庚烷磺酸钠的0.5%冰醋酸溶液-乙腈-甲醇(85∶10∶5)为流动相；检测波长为444nm。

理论板数按维生素B2峰计算不低于2000。

1.2测定法避光操作。

取本品20片，精密称定，研细，精密称取适量(约相当于维生素B2 10mg)，置500ml量瓶中，加盐酸溶液(1→2)10ml，振摇使维生素B2 溶解，加水20ml，继续振摇数分钟，再加水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，精密量取20ul注入液相色谱仪，记录色谱图；另取维生素B2对照品约10mg，同法测定。

按外标法以峰面积计算，即得。

1.3本品含维生素B2计算，应为标示量的90.0% ～110.0%。

2. 维生素B2片溶出度测定：照溶出度与释放度测定法（通则0931第二法）测定法避光操作。

取本品，以冰醋酸3ml与4%氢氧化钠溶液18ml用水稀释至600ml为溶出介质，转速为每分钟100转，依法操作，经20分钟时，取溶液10ml，滤过，取续滤液，照紫外-可分光光度法（通则0401)，在444nm的波长处测定吸光度，按C17H20N4O6的吸收系数()为323计算每片的溶出量。

限度为标示量的75%，应符合规定。

3. 维生素B2片有关物质测定：照高效液相色谱法（通则0512）测定。

色谱条件照含量测定。

避光操作。

取本品的细粉适量（约相当于维生素B2 10mg)，置100ml 量瓶中，加盐酸溶液（1→2)5ml，振摇使维生素B2溶解，加水10ml，继续振摇数分钟，再用水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；精密量取1ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。

精密量取供试品溶液与对照溶液各20ul，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的3倍。

供试品溶液的色谱图中如有杂质峰，单个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积的0.75倍(1.5% ) ，各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积的1.5倍（3.0% )。

2351 黄曲霉毒素测定法第一法1 本法系用高效液相色谱法(通则 0512)测定药材、饮片及制剂中的黄曲霉毒素(以黄曲霉 毒素 B1、黄曲霉毒素 B2、黄曲霉毒素 G1 和黄曲霉毒素 G2 总量计)，除另有规定外，按下 列方法测定。

当测定结果不符合规定时，以第二法测定结果为准。

色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇 - 乙腈 - 水(40∶18∶42)为流动相；采用柱后衍生法检测， （1）碘衍生法：衍生溶液为 0.05％的碘溶液 (取碘 0.5g， 加入甲醇 100ml 使溶解， 用水稀释至 1000ml 制成)， 衍生化泵流速每分钟 0.3ml， 衍生化温度 70℃； （2）光化学衍生法：光化学衍生器（254nm） ；以荧光检测器检测，激发 波长 λex=360nm(或 365nm)，发射波长 λem=450nm。

两个相邻色谱峰的分离度应大于 1.5。

混合对照品溶液的制备 精密量取黄曲霉毒素混合标准品(黄曲霉毒素 B1、 黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素 G1、黄曲霉毒素 G2 标示浓度分别为 1.0μg／ml、0.3μg／ml、1.0μg／ml、 0.3μg／m1)0.5ml，置 10ml 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为储备液。

精密量取储备液 1ml， 置 25ml 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得。

供试品溶液的制备 取供试品粉末约 15g(过二号筛)，精密称定，加入氯化钠 3g，置于均质瓶中，精密加入 70％甲醇溶液 75ml，高速搅拌 2 分钟(搅拌速度大于 11000 转／分钟)， 离心 5 分钟(离心速度 2500 转／分钟)，精密量取上清液 15ml，置 50ml 量瓶中，用水稀释至 刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，量取续滤液 20.0ml，通过免疫亲合柱，流速每分钟 3ml，用水 20ml 洗脱，洗脱液弃去，使空气进入柱子，将水挤出柱子，再用适量甲醇洗脱， 收集洗脱液，置 2ml 量瓶中，并用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

标准文件1、目的Objective：建立高效液相色谱仪内部校验规程，确保校验工作规范、顺利进行。

2、范围Scope ：本规程适用于本公司使用的高效液相色谱仪（紫外-可见光检测器/二极管阵列检测器）的校验。

3、职责Responsibilities：3.1 培训职责：本文件起草人或审核人或批准人负责对质量管理部全体人员培训。

3.2 QC：负责制定本规程，并对本规程的实施负责。

3.3 QA：负责监督和检查本规程的实施。

4、定义Definition：无。

5、程序Procedures：5.1 依据国家计量校验规程JJG 705-2002液相色谱仪，安捷伦液相说明书，岛津液相说明书。

5.2 备件及材料5.2.1水：HPLC级水。

5.2.2化学试剂：乙腈（HPLC）、丙酮（分析纯）。

5.2.3咖啡因标准品。

5.2.4咖啡因标样。

0.005 mg/ml, 0.010 mg/ml, 0.025 mg/ml,0.050 mg/ml,0.125 mg/ml和0.250 mg/ml 咖啡因水溶液。

5.2.5色谱柱：4.6mm×250mm，C18，5µm。

5.2.6 容量瓶：10ml。

5.2.7玻璃注射器。

5.2.8 限流阻尼管。

5.2.9 分析天平。

5.2.10 秒表。

5.2.11 热电偶5.3 校验项目及技术指标5.3.1泵性能的测试5.3.2柱温箱温度稳定性测试*备注：如药典专论规定的特定柱温，不在以上温度范围之内，则对分析该品种的仪器增加该温度点校验，校验项目和可接受指标相同。

5.3.3 检测器性能测试5.3.4进样器性能测试5.3.5梯度组成的测试*注：*表示该项目的内部校验取决于仪器的配置，有该配置则为必检项目。

5.4 校验方法5.4.1校验通则5.4.1.1 HPLC的内部校验由仪器所属部门经培训的使用者按本规程进行校验，其校验项目依仪器配置和使用范围而定。

5.4.1.2 政府部门每一年对HPLC进行校验，每六个月内部对HPLC进行一次校验；仪器配置的关键部件大修或更换后，可参考本规程对该部件相关的项目进行校验，以对仪器的性能进行确认。

高效液相色谱法高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵人装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。

注人的供试品，由流动相带入色谱柱内，各组分在柱内被分离，并进入检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。

1. 对仪器的一般要求和色谱条件高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。

色谱柱内径一般为3.9〜4.6 mm，填充剂粒径为3〜10μm。

超高效液相色谱仪是适应小粒径（约2μm) 填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度检测的高效液相色谱仪。

(1) 色谱柱反相色谱柱：以键合非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。

常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等；常用的填充剂有十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。

正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。

常见的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。

氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反相色谱。

离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。

有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。

手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。

色谱柱的内径与长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分离物质的性质来选择合适的色谱柱。

温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。

为改善分离效果可适当提髙色谱柱的温度，但一般不宜超过60°C。

残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱，流动相pH值一般应在2〜8之间。

残余硅羟基已封闭的硅胶、聚合物复合硅胶或聚合物色谱柱可耐受更广泛pH值的流动相，适合于pH值小于2或大于8的流动相。

(2) 检测器最常用的检测器为紫外-可见分光检测器，包括二极管阵列检测器，其他常见的检测器有荧光检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。

范围：原料、中间体、成品检验。

责任：检验员、QA监控员、化验室主任、质保科科长、质量部负责人。

内容：高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。

注入的供试品，由流动相带入柱内，各成分在柱内被分离，并进入检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。

1.对仪器的一般要求和色谱条件高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。

色谱柱内径一般3.9～4.6mm，填充剂粒径为3～10μm。

超高效液相色谱仪是适应小粒径（约2μm）填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度检测的高效液相色谱仪。

1.1色谱柱反向色谱柱：以键合非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。

常用的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等。

常用的填充剂有十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。

正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。

常用的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。

氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可作反向色谱。

离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。

有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。

手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。

系统使用离子交换填充剂；分子排阻色谱系统使用凝胶或高分子多空微球等填充剂；对应异构体的分离通常使用手性填充剂。

色谱柱的内径与长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分离物质的性质来选择合适的色谱柱。

温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。

为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度，但不宜超过60℃。

残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱，流动相pH值一般应在2~8之间。

残余硅羟基已封闭的硅胶、聚合物复合硅胶或聚合物色谱柱可耐受更广泛pH值的流动相，适合于pH值小于2或大于8的流动相。

通则0512高效液相色谱法修订通则0512是指高效液相色谱法的通则，主要用于组织和生物液中小分子的定性和定量分析。

高效液相色谱法是一种非常常用的分析方法，具有灵敏、准确、速度快等优点，被广泛应用于化学分析、环境监测、食品安全、药物检测等领域。

通则0512版对高效液相色谱法的要求进行了修订，主要包括以下几个方面：1.仪器设备要求：通则0512版对高效液相色谱仪的性能要求进行了细化，包括流速范围、压力稳定性、温度控制、检测器的线性范围和灵敏度等。

这些要求的明确可以帮助用户选择合适的仪器设备，以保证实验结果的准确性和可重复性。

2.色谱柱要求：通则0512版对色谱柱的要求进行了细化，包括柱材的选择、尺寸和填充物的要求等。

这些要求的明确可以帮助用户选择合适的色谱柱，以保证分离效果和分析速度。

3.样品前处理：通则0512版对样品前处理的要求进行了修订，包括样品的制备、溶解、过滤等。

这些要求的明确可以帮助用户选择合适的前处理方法，以减少样品中的杂质对分析结果的干扰。

4.分析方法的优化：通则0512版对分析方法的优化进行了修订，包括流动相的选择、柱温的优化、梯度程序的设定等。

这些优化方法可以帮助用户提高分析的灵敏度、选择性和分辨率。

5.数据处理：通则0512版对数据处理的要求进行了修订，包括峰检测、定量计算、系统适应性测试等。

这些要求的明确可以帮助用户准确地分析和解释实验结果。

通则0512版的修订对高效液相色谱法的应用具有重要意义。

它可以提高分析结果的准确性和可重复性，同时也可以帮助用户更好地理解和应用这种分析方法。

相关机构和实验室应该根据通则0512版的要求，对现有的分析方法进行修正，并进行相应的验收和认证。

总的来说，通则0512版的修订对高效液相色谱法的应用有着积极的推动作用。

它不仅提高了分析结果的可靠性，还为用户提供了更加规范和统一的分析方法。

⾼效液相⾊谱仪校验规程完整标准⽂件1、⽬的Objective：建⽴⾼效液相⾊谱仪内部校验规程，确保校验⼯作规范、顺利进⾏。

2、范围Scope ：本规程适⽤于本公司使⽤的⾼效液相⾊谱仪（紫外-可见光检测器/⼆极管阵列检测器）的校验。

3、职责Responsibilities：3.1 培训职责：本⽂件起草⼈或审核⼈或批准⼈负责对质量管理部全体⼈员培训。

3.2 QC：负责制定本规程，并对本规程的实施负责。

3.3 QA：负责监督和检查本规程的实施。

4、定义Definition：⽆。

5、程序Procedures：5.1 依据国家计量校验规程JJG 705-2002液相⾊谱仪，安捷伦液相说明书，岛津液相说明书。

5.2 备件及材料5.2.1⽔：HPLC级⽔。

5.2.2化学试剂：⼄腈（HPLC）、丙酮（分析纯）。

5.2.3咖啡因标准品。

5.2.4咖啡因标样。

0.005 mg/ml, 0.010 mg/ml, 0.025 mg/ml,0.050 mg/ml,0.125 mg/ml和0.250 mg/ml 咖啡因⽔溶液。

5.2.5⾊谱柱：4.6mm×250mm，C18，5µm。

5.2.6 容量瓶：10ml。

5.2.7玻璃注射器。

5.2.8 限流阻尼管。

5.2.9 分析天平。

5.2.10 秒表。

5.2.11 热电偶5.3 校验项⽬及技术指标5.3.1泵性能的测试5.3.2柱温箱温度稳定性测试*备注：如药典专论规定的特定柱温，不在以上温度范围之内，则对分析该品种的仪器增加该温度点校验，校验项⽬和可接受指标相同。

5.3.3 检测器性能测试5.3.4进样器性能测试5.3.5梯度组成的测试*注：*表⽰该项⽬的内部校验取决于仪器的配置，有该配置则为必检项⽬。

5.4 校验⽅法 5.4.1校验通则5.4.1.1 HPLC 的内部校验由仪器所属部门经培训的使⽤者按本规程进⾏校验，其校验项⽬依仪器配置和使⽤范围⽽定。

0521气‎相色谱法气相色谱法‎系采用气体‎为流动相（载气）流经装有填‎充剂的色谱‎柱进行分离‎测定的色谱‎方法。

物质或其衍生物气化后，被载气带入‎色谱柱进行‎分离，各组分先后‎进入检测器‎，用数据处理‎系统记录色‎谱信号。

1.对仪器的一‎般要求所用的仪器‎为气相色谱‎仪，由载气源、进样部分、色谱柱、柱温箱、检测器和数‎据处理系统‎等组成。

进样部分、色谱柱和检‎测器的温度‎均应根据分‎析要求适当‎设定。

（1）载气源气相色谱法‎的流动相为‎气体，称为载气，氦、氮和氢可用作载气，可由高压钢‎瓶或高纯度‎气体发生器提供，经过适当的‎减压装置，以一定的流‎速经过进样‎器和色谱柱‎；根据供试品‎的性质和检‎测器种类选‎择载气，除另有规定外，常用载气为‎氮气。

（2）进样部分进样方式一‎般可采用溶液直接进样、自动进样或‎顶空迸样。

溶液直接进‎样采用微量‎注射器、微量进样阀‎或有分流装‎置的气化室‎进样；采用溶液直‎接进样或自‎动进样时，进样口温度应高于柱‎温30～50℃；进样量一般‎不超过数微‎升；柱径越细，进样量应越‎少，采用毛细管‎柱时，一般应分流‎以免过载。

顶空进样适‎用于固体和‎液体供试品‎中挥发性组分的分‎离和测定。

将固态或液‎态的供试品‎制成供试液后，置于密闭小‎瓶中，在恒温控制的加热室中‎加热至供试‎品中挥发性‎组分在液态‎和气态达到‎平衡后，由进样器自‎动吸取一定‎体积的顶空‎气注入色谱柱中‎。

（3）色谱柱色谱柱为填‎充柱或毛细‎管柱。

填充柱的材‎质为不锈钢‎或玻璃，内径为2～4mm，柱长为2～4m，内装吸附剂‎、高分子多孔‎小球或涂渍‎固定液的载‎体，粒径为0.18～0.25mm、0.15～0.18mm或‎0.125～0.15mm。

常用载体为‎经酸洗并硅‎烷化处理的‎硅藻土或高‎分子多孔小‎球，常用固定液‎有甲基聚硅‎氧烷、聚乙二醇等。

毛细管柱的‎材质为玻璃‎或石英，内壁或载体‎经涂渍或交‎联固定液，内径一般为‎0.25mm、0.32mm或‎0.53mm，柱长5～60m，固定液膜厚‎0.1～5.0μm，常用的固定‎液有甲基聚‎硅氧烷、不同比例组‎成的苯基甲‎基聚硅氧烷‎、聚乙二醇等‎。

品种正文项下规定的条件除填充剂种类、流动相组分、检测器类型不得改变外，其余如色谱柱内径与长度、填充剂粒径、流动相流速、流动相组分比例、柱温、进样量、检测器灵敏度等，均可适当改变，以达到系统适用性试验的要求。

调整流动相组分比例时，当小比例组分的百分比例X小于等于33%时，允许改变范围为0.7X～1.3X；当X大于33%时，允许改变范围为X-10%～X+10%。

若需使用小粒径（约2μm）填充剂，输液泵的性能、进样体积、检测池体积和系统的死体积等必须与之匹配；如有必要，色谱条件也应作适当的调整。

当对其测定结果产生争议时，应以品种项下规定的色谱条件的测定结果为准。

当必须使用特定牌号的色谱柱方能满足分离要求时，可在该品种正文项下注明。

2.系统适用性试验色谱系统的适用性试验通常包括理论板数、分离度、灵敏度、拖尾因子和重复性等五个参数。

按各品种正文项下要求对色谱系统进行适用性试验，即用规定的对照品溶液或系统适用性试验溶液在规定的色谱系统进行试验，必要时，可对色谱系统进行适当调整，以符合要求。

（1）色谱柱的理论板数（n）用于评价色谱柱的分离效能。

由于不同物质在同一色谱柱上的色谱行为不同，采用理论板数作为衡量色谱柱效能的指标时，应指明测定物质，一般为待测物质或内标物质的理论板数。

在规定的色谱条件下，注入供试品溶液或各品种项下规定的内标物质溶液，记录色谱图，量出供试品主成分色谱峰或内标物质色谱峰的保留时间t R和峰宽（W）或半高峰宽（W h/2），按n=16（t R/W）2或 n=5.54（t R/W h/2）2计算色谱柱的理论板数。

t R、W、W h/2可用时间或长度计（下同），但应取相同单位。

（2）分离度（R）用于评价待测物质与被分离物质之间的分离程度，是衡量色谱系统分离效能的关键指标。

可以通过测定待测物质与已知杂质的分离度，也可以通过测定待测物质与某一指标性成分（内标物质或其他难分离物质）的分离度，或将供试品或对照品用适当的方法降解，通过测定待测物质与某一降解产物的分离度，对色谱系统分离效能进行评价与调整。

通则0512高效液相色谱法--)日26月3年-(-2016．18) 页药典四部60日） (26（ 2016年3月 0512高效液相色谱法通则2 /高效液相色谱法：系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。

注入的供试品，由流动相带入色谱柱内，各组分在柱内被分离，并进入检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。

1.对仪器的一般要求和色谱条件高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。

色谱柱内径一般为3.9～4.6mm，填充剂粒径为3～10μm。

超高液相色谱仪：是适应小粒径（约2μm）填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度检测的高效液相色谱仪。

（1）色谱柱反相色谱柱：以键和非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。

常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等；18) 页60） (药典四部3（ 2016年月26日高效液相色谱法通则0512/ 3常用的填充剂优十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。

正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。

常见的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。

氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反向色谱。

离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。

有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。

手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。

色谱柱的内径和长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分离物质的性质来选择合适的色谱柱。

．18) 页药典四部6026日） (（ 2016年3月 0512通则高效液相色谱法4 /温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。

为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度，但一般不宜超过60℃。

通则0512高效液相色谱法修订通则0512高效液相色谱法修订1. 引言高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种常用的分离和定量分析方法，广泛应用于化学、医药、环境等领域。

为了保证该方法的准确性和可靠性，需要对通则0512进行修订。

2. 术语和定义2.1 高效液相色谱法（HPLC）：一种通过液相将待分离的物质分离并定量测定的方法。

2.2 色谱柱：用于分离物质的柱状装置。

2.3 流动相：用于推动样品在色谱柱中流动的溶剂。

3. 仪器设备3.1 色谱仪：应具备稳定的流速和压力控制功能。

3.2 注射器：应具备准确的进样容量和稳定的进样速度。

3.3 色谱柱：应具备较高的分离效率和较长的使用寿命。

4. 操作方法4.1 样品处理：样品应在适当的条件下进行前处理，以去除杂质和提高分离效果。

4.2 柱温控制：根据样品的特性和分离条件的要求，应在适当的温度下进行色谱分离。

4.3 流动相选择：根据待分离物质的性质和分离要求，选择合适的流动相组合。

4.4 进样方式：根据样品的性质和需求，选择适当的进样方式，确保进样量准确。

5. 结果计算和报告5.1 峰面积计算：根据峰的面积进行定量计算，应采用准确的积分算法。

5.2 结果修约：对测定结果应进行正确的修约，保证结果准确性和可靠性。

5.3 报告格式：测试结果应按规定的格式进行报告，包括样品名称、测定结果、仪器信息等。

6. 质量控制6.1 标准品的选择：选择适当的标准品进行方法验证和质量控制。

6.2 校准曲线的建立：根据标准品的浓度和峰面积数据建立校准曲线。

6.3 质控样品的测定：应进行质控样品的测定，以验证方法的准确性和可靠性。

7. 场所和安全7.1 实验场所：实验室应具备适当的设备和环境条件，确保实验的安全进行。

7.2 安全操作：操作人员应具备相应的实验操作知识，严格按照操作规程进行操作，确保人员的安全。