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LPSp增强狂犬病毒抗原免疫效果的实验研究的开题报告
研究背景：
狂犬病是一种威胁人类健康的疾病，由狂犬病病毒引起，目前尚无特效治疗方法，因
此预防非常重要。
狂犬病疫苗是预防狂犬病的最有效手段之一，但是其抗原性较差，
需要多次接种才能获得免疫保护。
因此，提高狂犬病疫苗的免疫力是研究的重要方向
之一。
研究内容：
本文拟研究LPSp（LPS结构中的核心脂多糖部分）对狂犬病疫苗抗原的免疫增强作用。
我们将利用小鼠模型，分别注射狂犬病疫苗和LPSp狂犬病疫苗，观察两种疫苗的免疫保护效果，并通过酶联免疫吸附检测法检测其抗体反应水平。
同时，我们还将探究LPSp与狂犬病疫苗的最佳配比及时间间隔，并研究LPSp的作用机制。
研究意义：
通过本研究，可以提高狂犬病疫苗的免疫力，从而减少疫苗接种次数和病例的发生率。
同时，研究结果还可为其他疫苗的免疫增强提供理论基础。
中国畜牧兽医2018,45(7) :19K5-1971China Animal Husbandry &Veterinary Medicinedoi：10.16431/j.c n ki.1671-7236. 2018. 07.030携带G fT基因的重组狂犬病病毒的拯救及其生物学特性研究刘翠，殷相平"(中国农业科学院兰州兽医研究所，家畜疫病病原生物学国家重点实验室，兰州730046)摘要：本研究旨在构建一株携带绿色荧光蛋白（G F P)的重组病毒，以便更快速、准确地检测疫苗效价。
利用基因重组技术构建含有G F P基因的重组质粒，并利用反向遗传学操作进行重组病毒的拯救，在V e t o细胞进行病毒感染并收集蛋白样品进行WestembOtt-g试验，检测外源蛋白G F P的表达情况，测定一步法生长曲线，比较与原始毒株的生物学特性差异。
结果显示，本试验成功拯救出携带G F P基因的重组狂犬病病毒毒株SAI>G F P;W e s--emblott-g试验结果显示，重组病毒可表达G F P，且随着病毒感染时间的延长，蛋白表达增多；病毒结构蛋白G蛋白表达并未受外源蛋白表达的影响，重组毒株与原始毒株的生长并无明显差异&专代后G F P仍可在病毒中稳定表达。
在连续传代过程中，本试验成功拯救出SAI-G F P重组毒株，G P T基因并未丢失，且蛋白表达量并未降低，证明该位点表达的外源蛋白在病毒传代过程中可持续稳定表达，且对病毒生长特性并未产生影响。
关键词：狂犬病病毒；反向遗传；G F P中图分类号：S852.65文献标识码：B文章编号：1671-7236(2018)07-1965-07Rescue a n d Biological Characteristics Analysis of R e c o m b i n a n t RabiesVirus Containing GFP G e n eL I U C u i，Y I NXiangping"{State Key Labrratrry o f Veterinary Etiological Biology，Lanzhou Veterinary Research Institute，Chinese Academy o f Agricultural Sciences，Lanzhou 730046, China)Abstract ：T h e aim of this study was to construct a recombinant virus carrying green fluorescent protein (G F P) protein,and detect vaccine titer more rapidly and accurately. Recombinant plasmids containing GFP gene were constructed by gene recombination technology and rescued by reverse genetics. T h e viral infection in Vero cells and protein samples were collected for Western blotting assay to detect the e x pression of foreign protein GFP. One-step growth curve was compared with the biological characteristics of t he original strain. T h e results showed that w e successfully rescued the recombinant G F P-e x pressing recombinant rabies virus S A D-G F P using the constructed recombinant plasmids. Western blotting resutt showed that the recombinant virus could e x pressG F P,and the e x pression of G F P increased with the time of virus infection. T h e e x pression ofstructural protein G was not affected by the e x pression of foreign proteins. There was no significant difference between the recombinant strains and the original strains. After passage,GFP could stably e x press in the virus. In this e x periment,the recombinant S A D-G F P strain was successfully rescued. In the continuous passage, the GFP gene was not lost, and the protein e x pression level *收稿日期：2017-12-15基金项目：国家重点研发计划（2016Y F E0204100)作者筒介：刘翠（1991-)，女，河北沧州人，硕士生，研究方向：动物疫苗与分子免疫学，E-m a i l:2286140151®q q. c o m*通信作者：殷相平（1972-)，男，甘肃通渭人，副研究员，研究方向：动物传染病及分子流行病学，E-m a i l:y i n x i a I l gp i I l g@c a a s c ndid not decrease,which proved that the foreign protein expressed at this site could sustainedly and stablly express in the course of virus passage,and did not affect the growth c中国畜牧兽医45卷virus.Key words： rabies virus；reverse genetic；G F P狂犬病是由狂犬病病毒(rabies virus，R V)感染 引起的以侵犯中枢神经为主的致死性人畜共患病传 染病[1]。
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910206785.0(22)申请日 2019.03.19(71)申请人 华南农业大学地址 510642 广东省广州市天河区五山路483号(72)发明人 罗永文 毕水莲 梁嘉琪 曾小玲 龙家慧 潘雨晴 郭霄峰 (74)专利代理机构 广东广信君达律师事务所44329代理人 杨晓松(51)Int.Cl.C12N 7/01(2006.01)C12N 15/65(2006.01)G01N 33/569(2006.01)(54)发明名称一种重组狂犬病病毒rHEP-△G-EGFP及其应用(57)摘要本发明涉及抗体检测技术领域，尤其涉及一种重组狂犬病病毒rHEP -△G -EGFP及其应用。
所述重组狂犬病病毒rHEP -△G -EGFP为糖蛋白基因缺失型重组毒株，所述糖蛋白基因缺失型重组毒株具有如下特性：a)含有细胞来源的标准强毒株糖蛋白；b)能够感染细胞且在细胞中表达绿色荧光蛋白；c)无法在细胞和动物体中自我复制和扩散。
利用该重组狂犬病病毒rHEP -△G -EGFP建立的狂犬病病毒中和抗体水平检测方法具备以下优点：一、该病毒不能在细胞和活体中传代繁殖，因此更安全；二、该检测方法以直接荧光显微镜下观察，更加经济便捷；三、该检测方法的测定结果相对于利用弱毒株的方法更加可靠。
权利要求书1页 说明书8页序列表1页 附图4页CN 110042087 A 2019.07.23C N 110042087A权 利 要 求 书1/1页CN 110042087 A1.一种重组狂犬病病毒rHEP-△G-EGFP，其特征在于，所述重组狂犬病病毒rHEP-△G-EGFP为糖蛋白基因缺失型重组毒株，所述糖蛋白基因缺失型重组毒株具有如下特性：a)含有细胞来源的标准强毒株糖蛋白；b)能够感染细胞且在细胞中表达绿色荧光蛋白；c)无法在细胞和动物体中自我复制和扩散。
狂犬病病毒G+N双基因重组腺病毒的构建狂犬病病毒G+N双基因重组腺病毒的构建狂犬病是一种危害极大的病毒性传染病，它主要通过动物的唾液传播给人类。
狂犬病病毒（Rabies virus，RABV）是一种负链RNA病毒，它的基因组由五个基因组成：核酸酶基因（N）、磷酸转移酶基因（P）、糖苷酸转移酶基因（G）、大蛋白基因（L）以及非结构基因（NS）。
其中，G基因编码糖蛋白，是病毒进入宿主细胞的关键，N基因编码的核蛋白则起到保护病毒基因组完整性的作用。
近年来，利用基因重组技术构建双基因重组病毒已成为狂犬病疫苗研究的热点。
为了构建狂犬病病毒G+N双基因重组腺病毒，我们首先需要获取RABV的基因组序列，并且对病毒进行分离和扩增。
然后，利用基因重组技术将G基因和N基因分别插入到适当的载体中，形成两个重组载体。
对于G基因，我们选择了腺病毒载体Ad5作为载体，可以确保G基因在宿主细胞中高效表达，并且能够避免病毒基因组的多次重组。
接下来，我们将重组载体与病毒分离得到的基因组进行共转染。
通过转染，在宿主细胞中可以同时表达G基因和N基因，从而构建出G+N双基因重组腺病毒。
为了验证构建的重组病毒的功能性，我们需要进行一系列的实验。
首先，通过PCR、Western blot等技术手段验证病毒中G基因和N基因的存在。
通过PCR，在重组病毒基因组同一个特定位置引物扩增，可以检测到G基因和N基因的存在。
通过Western blot，我们可以进一步确定这些蛋白在细胞内的表达水平。
其次，我们需要检测构建的重组病毒是否具有相应的功能。
在体外实验中，我们可以通过对宿主细胞进行感染，并观察细胞对重组病毒的反应来判断重组病毒的活性。
在体内实验中，我们可以选择小鼠作为实验动物，注射重组病毒后观察小鼠的免疫反应和保护效果。
最后，我们需要对构建的重组病毒进行安全性评估。
通过体内外实验观察病毒对宿主细胞的毒性，以及对其他动物的传播性和致病性，可以评价构建的重组病毒的安全性。
绿色荧光蛋白(GFP )的特性及其在分子生物学研究中的应用薛启汉(江苏省农业科学院农业生物遗传生理研究所,南京210014)薛启汉:男,56岁,大学,研究员。
本综述系联合国教科文组织生物技术合作研究项目部分内容。
收稿日期:1997-12-02 摘 要 作为1种新型、方便的活性标记,来自水母的绿色荧光蛋白(G FP )正在多种原核和真核生物研究中应用。
近来研究表明,GF P 具有很多理想的特性,适合用作普遍的报告标记,尤其适合于活体细胞或组织。
譬如,GF P 在细胞中表达,在蓝光或紫外光照射下可以产生明亮的绿色荧光。
而且,GF P 在细胞中呈自主性表达,没有细胞或位置表达的专一性,无需外源反应底物,无需进行细胞或组织的固定和渗透处理,使表达检测很方便。
由于G FP 对光漂白、氧化剂、还原剂以及其它许多化学试剂具有极强的稳定性,因此,可用来监测基因表达、信号转导、共转染、蛋白运输与定位,以及细胞系谱分类等。
本文就G F P 的特性及其在分子生物学研究中的应用潜力,作一简要阐述。
关键词 绿色荧光蛋白(GF P);分子生物学中图法分类号 Q 71Characteristics of the Green Fluorescent Protein (GFP )and Its Application in Molecular Biology ResearchX U E Q ihan(Institute o f Ag robiological Gene tics and Physiology ,J iang su A cad emy of A gr icultural S ciences ,Nanj ing 210014) Abstract T he gr een-fluo rescent pro tein (G FP )fro m jellyfish A equor ea v ictoria has been used as a co nvenient new vital mar ker in a wide spectr um o f pro kary otes and eukar yo tes.T he G FP g ene has r ecent ly been show n t o possess a munber o f desir able tr aits as a univer sal r epo rt er especia lly in living cells and tissues .Fo r ex ample ,GF P ex pr essed in cells can y ield a br ig ht g reen fluo rescence when the cells ar e ex cited by blue or U V lig ht.GF P ex pr ession is cell auto no mous and independent of cell t ype and locatio n,which makes its detection co venient w ithout need of ex og enous substr ates ,cell fixa tion and per mealizatio n .M o rev er ,G FP with mor e stabillity t o pho to bleaching ,ox idatio n /r eductio n ,and chemical r eagents etc .can be used in mo nitor ing g ene expr essio n ,sig nal tr ansduct ion,co -tr ansfection,tr ansfor matio n,pr ot ein t rafficking and lo calizat ion,pr otein-pr ot ein int eraction,cell seper atio n and pur ificat ion,and cell lineag e etc.T he char act erist ics o f GF P and its po tential application in molecular biolog y resear ch w ere ma inly rev iew ed in t his paper . Key words g reen fluor escent pro tein ;mo lecular bio lo gy 生物发光现象,在无脊椎动物中很普遍。
狂犬病病毒实验室检测方法研究进展杨妍梅;冯若飞;马忠仁【摘要】狂犬病病毒(RV)属于人畜共患的急性直接接触性传染病病毒,近年来又有感染上升的趋势.因此,急需一种快速、准确、灵敏的检测RV的实验室诊断方法.现就酶联免疫吸附试验(ELISA)、荧光抗体方法(FAT)、快速荧光抑制灶技术(RFFIT)、反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、荧光定量RT-PCR,环介导等温扩增技术(LAMP)和基因芯片技术等狂犬病病毒实验室诊断方法做一综述,为更好地开展实验室诊断提供参考.【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2013(034)008【总页数】5页(P102-106)【关键词】狂犬病病毒;检测方法;研究进展【作者】杨妍梅;冯若飞;马忠仁【作者单位】西北民族大学生命科学与工程学院,甘肃兰州730030;西北民族大学生物工程与技术国家民委重点实验室,甘肃兰州730030;甘肃省动物细胞工程技术研究中心,甘肃兰州730030;甘肃省动物细胞工程技术研究中心,甘肃兰州730030【正文语种】中文【中图分类】S852.659.5狂犬病（Rabies）俗称疯狗病，又称恐水症，是由狂犬病病毒（Rabies virus，RV）引起的一种人畜共患的急性接触性传染病，发病后病死率几乎为100%。
我国是狂犬病的高发地区，感染狂犬病死亡人数居世界第二，仅次于印度。
当今世界，狂犬病仍然是一种高发的人畜共患病，无论在发达国家［1］，还是发展中国家［2］，都是重点防控的传染病。
狂犬病在我国曾一度得到有效控制，值得关注的是我国城乡养犬、猫等宠物的家庭迅速增加，野犬、猫的数量均呈现增多趋势［3］，使该病的发病率近年有上升趋势。
狂犬病病毒是弹状病科（Rhabdoviridae）狂犬病病毒属的成员，为不分节段的单股负链RNA病毒，基因组长度为11 928nt～11 932nt，编码5种结构蛋白，顺次为核蛋白（N）、磷酸蛋白（M1）、基质蛋白（M2）、糖蛋白（G）和 RNA聚合酶（L），分别由对应的5种结构基因编码，其中N基因具有毒株间相对保守和高拷贝复制的特点，成为病毒分型、系统发生分析和分子诊断的目标序列［4］。
表达绿色荧光蛋白重组狂犬病病毒Flury-LEP的构建及其用于中和抗体检测的研究华涛;陶丽红;葛金英;王喜军;沈向真;步志高【摘要】为确定狂犬病病毒(RV)Flury-LEP株外源基因的插入位点及其中和抗体快速检测方法,本研究在建立了Rv Flury-LEP株反向遗传操作系统的基础上,构建了表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的重组LEP基因组cDNA克隆pCI-LEP-EGFP,并成功拯救出重组病毒(rLEP-EGFP).rLEP-EGFP的生物学特性和野生型LEP(wtLEP)在NA细胞和BHK-21细胞中的生长动力学及对小鼠的致病性没有显著差异.rLEP-EGFP在BHK-21细胞中连续传代9次,各代次重组病毒均稳定表达EGFP.重组表达的EGFP可用于中和抗体检测,rLEP-EGFP免疫犬血清经间接免疫荧光(IFA)或荧光下直接观察检测RV中和抗体滴度,两种检测结果显示较好的相似性(p>0.05).本研究为研制以Flury-LEP株活载体多价疫苗奠定了基础,并为病毒中和抗体的检测提供了更为快捷的新方法.【期刊名称】《中国预防兽医学报》【年(卷),期】2010(032)008【总页数】5页(P581-585)【关键词】狂犬病病毒;Flury-LEP株;EGFP;反向遗传操作;多价疫苗;病毒中和抗体【作者】华涛;陶丽红;葛金英;王喜军;沈向真;步志高【作者单位】南京农业大学,动物医学院,江苏,南京,210095;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开发实验室,黑龙江,哈尔滨,150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开发实验室,黑龙江,哈尔滨,150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开发实验室,黑龙江,哈尔滨,150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开发实验室,黑龙江,哈尔滨,150001;南京农业大学,动物医学院,江苏,南京,210095;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开发实验室,黑龙江,哈尔滨,150001【正文语种】中文【中图分类】S852.65狂犬病病毒(Rabies virus，RV）为人兽共患狂犬病的病原。
PGG抗狂犬病病毒的作用及其分子机制研究狂犬病是由狂犬病病毒引起的一种高度致死性的人兽共患传染病,以侵害中枢神经系统为特征,引起人和其他哺乳动物的脑炎。
据统计全世界每年有超过6万人死于狂犬病,超过1,500万人接受暴露后预防免疫。
狂犬病主要发生在发展中国家,其中亚洲和非洲占绝大多数。
我国是狂犬病高发地区,每年有近千人死于狂犬病,死亡人数居世界第二位,仅次于印度。
到目前为止,狂犬病仍是一种无法治愈的疾病,唯一的预防方法是在暴露前或暴露后进行疫苗接种。
一旦出现临床症状,病死率高达100%。
因此,治疗狂犬病具有十分重要的意义。
1,2,3,4,6-五没食子酰基葡萄糖（1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-β-D-glucose,PGG）是一种水解性多酚类鞣质,广泛存在于多种传统药用植物中。
它具有多种生物学活性,包括抗癌症、抗炎症、抗氧化作用,同时它还具有广泛的抗病毒作用,其是否具有抗狂犬病病毒的活性目前尚没有报道。
据报道目前已有的广谱抗RNA病毒活性的药物,包括核苷酸类似物、干扰素、利巴韦林、氯胺酮和异丙肌苷（isoprinosine,IPS）等,由于IPS已经被报道具有很好的抑制狂犬病病毒的作用,因此,我们以IPS作为对照,在检测PGG药效的同时,比较两种化合物在体内外的治疗效果,并探讨PGG抑制病毒复制的分子机制。
首先,我们采用SRB法检测PGG的细胞毒性(半数细胞毒性浓度,CC<sub>50</sub>),通过测定病毒滴度来检测它对狂犬病病毒CVS-11的抑制率(半数抑制浓度,IC<sub>50</sub>),结果用选择性指数(SI=CC<sub>50</sub>/IC<sub>50</sub>)来表示PGG抗狂犬病病毒效果的安全范围。
我们的结果显示PGG的CC<sub>50</sub>和IC<sub>50</sub>分别为22.48±2.20μM和3.90±0.82μΜ,其SI为5.76,表明PGG具有明显的抑制狂犬病病毒的作用。
华南农业大学学报 Journal of South China Agricultural University 2024, 45(2): 190-198DOI: 10.7671/j.issn.1001-411X.202211015肖宇, 吴凡, 张宝石, 等. 狂犬病病毒强、弱毒株糖蛋白调节I型干扰素作用的差异分析[J]. 华南农业大学学报, 2024, 45(2): 190-198.XIAO Yu, WU Fan, ZHANG Baoshi, et al. The different regulatory effect of glycoproteins from virulent and attenuated strain of rabies virus on type I interferon signaling pathway[J]. Journal of South China Agricultural University, 2024, 45(2): 190-198.狂犬病病毒强、弱毒株糖蛋白调节I型干扰素作用的差异分析肖 宇，吴 凡，张宝石，徐孟磊，龙家慧，罗 均，郭霄峰，罗永文(华南农业大学 兽医学院/广东省动物源性人兽共患病预防与控制重点实验室, 广东 广州 510642)摘要: 【目的】狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒(Rabies virus，RABV)引起的一种高致死性人兽共患传染病。
I型干扰素(IFN-I)通路在抵抗RABV感染中发挥重要作用。
RABV可通过磷蛋白及核蛋白的功能逃逸IFN-I的抗病毒作用，本研究旨在探讨对RABV的致病性有重要影响的糖蛋白(Glycoprotein，G)在调节IFN-I通路方面扮演怎样的角色。
【方法】将RABV弱毒株Hep-Flury的G基因替换成致病株CVS-11的G基因，拯救得到重组病毒HepG，分析Hep-Flury、CVS-11和HepG这3种毒株在体内和体外感染对IFN-I通路激活和调控的差别，比较它们在神经细胞中对抗IFN-I抗病毒作用的差异性。
携带GFP基因的重组狂犬病病毒的拯救及其生物学特性研究刘翠;殷相平【摘要】本研究旨在构建一株携带绿色荧光蛋白(GFP)的重组病毒,以便更快速、准确地检测疫苗效价.利用基因重组技术构建含有GFP基因的重组质粒,并利用反向遗传学操作进行重组病毒的拯救,在Vero细胞进行病毒感染并收集蛋白样品进行Western blotting试验,检测外源蛋白GFP的表达情况,测定一步法生长曲线,比较与原始毒株的生物学特性差异.结果显示,本试验成功拯救出携带GFP基因的重组狂犬病病毒毒株SAD-GFP;Western blotting试验结果显示,重组病毒可表达GFP,且随着病毒感染时间的延长,蛋白表达增多;病毒结构蛋白G蛋白表达并未受外源蛋白表达的影响,重组毒株与原始毒株的生长并无明显差异;传代后GFP仍可在病毒中稳定表达.在连续传代过程中,本试验成功拯救出SAD-GFP重组毒株,GFP基因并未丢失,且蛋白表达量并未降低,证明该位点表达的外源蛋白在病毒传代过程中可持续稳定表达,且对病毒生长特性并未产生影响.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2018(045)007【总页数】7页(P1965-1971)【关键词】狂犬病病毒;反向遗传;GFP【作者】刘翠;殷相平【作者单位】中国农业科学院兰州兽医研究所,家畜疫病病原生物学国家重点实验室,兰州730046;中国农业科学院兰州兽医研究所,家畜疫病病原生物学国家重点实验室,兰州730046【正文语种】中文【中图分类】S852.65狂犬病是由狂犬病病毒(rabies virus，RV)感染引起的以侵犯中枢神经为主的致死性人畜共患病传染病[1]。
RV可感染人及所有温血动物，引起狂犬病，一旦发病致死率几乎达100%，全球每年约有55 000人死于该病[2]，主要是由犬、猫等动物的咬伤所致，且大部分发生在发展中国家，中国也属于狂犬病高发区，在亚洲仅次于印度。
RV属于弹状病毒科狂犬病病毒属，是一种不分节段的单股负链RNA病毒。
RV基因组长约12 kb，从3′到5′端依次为N-P-M-G-L，分别编码核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)、转录大蛋白(L)5个结构蛋白[3-6]。
RV是严格的嗜神经病毒，由于神经系统的复杂性，目前RV的免疫机制尚不明确。
通过强弱毒基因置换研究发现，G蛋白是决定RV致病性的关键蛋白质，且RV基因组是插入外源基因很好的潜在疫苗载体[7-10]。
目前,国内外很多学者在RV基因组G 和L之间插入外原基因并表达外原蛋白，但由于外原基因在基因组的中后段，因此，外原蛋白的表达量较低[11-13]。
绿色荧光蛋白(GFP)最早发现于水母中，该基因所产生的蛋白质在蓝色波长范围的光线激发下会发出绿色荧光。
GFP自从发现以来，应用非常广泛，作为一种新的报告基因，广泛用于分子标记。
利用GFP独特的发光机制，构建携带GFP的重组病毒，借助荧光显微镜便可对标记的病毒进行细胞内活体观察。
因此,本研究在RV 反向遗传操作的基础上将克隆的GFP基因插入到RV N和P基因之间构建全长cDNA，并进行重组病毒的拯救，获得携带GFP基因的重组RV，然后进行重组病毒生物学特性研究，期望通过这种方式构建的重组病毒能高效表达原基因，为后续狂犬病基础和应用研究奠定基础。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 质粒、细胞和病毒RV全长质粒cDNA、GFP基因、RV SAD株及Vero E6、BSR细胞均为本实验室保存。
1.1.2 主要试剂转染试剂Lipofectamine 2000 Reagent购自Life Technology公司；T4 DNA连接酶和限制性内切酶均购自NEB公司；Opti-MEM、FBS均购自Gibco公司；pMD19-T载体、大肠杆菌DH5α感受态细胞、DNA Marker、Taq DNA聚合酶均购自宝生物工程(大连)有限公司；DMEM、MEM均购自HyClone公司；β-actin抗体、GFP一抗及羊抗兔二抗均购自武汉三鹰公司；G蛋白抗体为本实验室保存；BCA测定蛋白浓度试剂盒购自上海英潍捷基公司。
1.2 方法1.2.1 含有GFP基因的全长cDNA的构建重组全长cDNA构建示意图见图1。
利用本实验室保存的含有GFP基因的质粒为模板，PCR扩增目的基因GFP。
扩增GFP基因的引物序列为：上游引物GFP(BsiW 1)：5′-ATACGGCGTACGATGGTGAGCAAGGGCGAG-3′；下游引物GFP(Nhe 1)：5′ - GGCTATGCTAGCTTACTTGTACAGCTCG-TCCAT-3′。
引物由北京华大基因公司合成。
PCR反应体系50 μL：Ex Taq预混酶25 μL，上、下游引物各1 μL，GFP模板1 μL，超纯水22 μL。
PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃延伸10 min。
将扩增产物克隆至pMD19-T载体，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，提取质粒进行酶切鉴定并送华大基因公司测序，核酸凝胶电泳回收目的片段GFP。
本实验室所保存的SAD毒株的cDNA在N、P基因之间存在Nhe 1和BsiW 1两个酶切位点，进行双酶切，并对载体片段进行核酸凝胶电泳回收。
使用T4 DNA 连接酶进行载体与目的片段GFP的连接，4 ℃过夜。
将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，对连接产物转化质粒进行双酶切鉴定并送华大基因公司测序。
图1 SAD毒株与重组SAD-GFP毒株的基因结构Fig.1 Genetic structures of SAD strain and reorganization SAD-GFP strain1.2.2 含有GFP基因病毒(SAD-GFP)的拯救将重组全长质粒cDNA，辅助质粒N、P、G、L、T7进行质粒大提，测定质粒浓度，稀释至1 μg/μL，按照5 μg SAD-GFP、2.5 μg N、1.25 μg P、1 μg G、1.25 μg L、1.5 μg T7在1.5 mL离心管进行混合。
同时将24 μL Lipofectamine 2000加入到600 μL Opti-MEM中，室温静置5 min，然后将混合质粒加入到Lipofectamine 2000和Opti-MEM混合物中，充分混匀，室温静置15～30 min。
将混合物转染至已长满单层Vero E6细胞的6孔板中，1～5孔每孔100 μL，第6孔留作对照，十字法晃动混匀，37 ℃细胞培养箱放置4 h，然后转移至34 ℃细胞培养箱。
3 d后将6孔板细胞转移至60 mm平皿，培养皿中添加适量新的培养基，34 ℃继续培养观察。
3 d后在荧光显微镜下观察是否出现绿色荧光。
1.2.3 含有GFP基因病毒的传代将6孔板中出现绿色荧光孔的上清收集在15 mL离心管中，4 ℃存放。
取4瓶T75 Vero E6细胞，弃去细胞培养液，加入10 mL含有2% FBS的细胞培养液，然后分别加入1 mL收集的6孔板中的上清，放置34 ℃培养箱培养。
每3 d收毒，分别记为F1H1、F1H2、F1H3、F1H4,连续传至3代。
1.2.4 重组病毒毒力测定96孔板，每孔加入90 μL无血清DMEM，第一排加入10 μL收集的病毒液混匀，每个代次的病毒做3个重复，依次10倍稀释至最后一排；取用DMEM悬浮的BSR细胞，每孔加入10 μL，34 ℃培养箱孵育48 h。
在荧光显微镜下观察并进行病毒滴度测定。
1.2.5 Western blotting 检测GFP蛋白的表达在6孔板中进行接毒，以感染复数(multiplicity of infection,MOI)为2进行接毒,分别在12、24、36、48、72和96 h收样。
收样时，弃掉细胞上清，用PBS洗3次，尽量不要残留液体，每孔加入200 μL细胞裂解液，在冰上放置5 min裂解，将细胞刮下收集在1.5 mL离心管，4 ℃离心15 min，将上清吸入新的离心管，BCA测定蛋白浓度。
加入上样缓冲液，95 ℃金属浴10 min，超声破碎蛋白1 min，-20 ℃保存。
SDS-PAGE电泳时每孔加入5 μg蛋白进行电泳，转膜后在5%脱脂奶粉中过夜封闭，5%脱脂奶粉稀释一抗结合2 h，TBST洗脱3次，每次10 min，5%脱脂奶粉稀释二抗结合1 h，TBST洗脱3次，每次10 min，暗室曝光。
1.2.6 一步法生长曲线测定取T25细胞瓶培养的Vero E6细胞，除去细胞培养液并用无血清DMEM清洗3次后加5 mL含有2% FBS的DMEM，同时按照MOI=5接毒SAD和SAD-GFP，接毒2 h后换液，再次使用无血清DMEM清洗3次，加入含有2% FBS的DMEM 5 mL培养，在24、48、72和96 h分别收样，每次吸出200 μL培养液。
对几次收取的样品进行病毒滴度测定并绘制一步法生长曲线。
2 结果2.1 GFP基因的扩增和重组质粒的鉴定GFP基因PCR扩增结果见图2。
由图2可知，扩增条带大小为714 bp,与目的片段相符，阴性对照并无任何条带。
将PCR产物纯化与pMD19-T载体连接，提取阳性质粒送公司进行测序，测序结果表明片段未突变。
由图3可知，重组质粒出现两条酶切片段：一条为15 000 bp载体片段；一条为714 bp 的GFP基因片段。
将阳性质粒送公司进行序列测定，未发现突变，可用该菌液复摇大提质粒进行转染试验。
1，阴性对照；2～5，GFP基因PCR产物；M，DL2000 DNA Marker1，Negative control；2-5， PCR products of GFP gene；M，DL2000 DNA Marker图2 GFP基因PCR扩增电泳结果Fig.2 PCR amplification results of GFP geneM，15000 bp DNA Marker；1～3，重组质粒的BsiW 1和Nhe 1双酶切产物M，15000 bp DNA Marker;1-3，Products of recombinant plasmid digested by BsiW 1 and Nhe 1图3 重组质粒双酶切鉴定结果Fig.3 Double enzyme digestion results of recombinant plasmid2.2 病毒拯救将含有GFP的重组质粒和辅助质粒与Lipofectamine 2000在Optim中混合进行Vero E6细胞转染，将转染细胞转移至60 mm平皿,3 d后在荧光显微镜下观察，发现绿色荧光及明显的病毒感染荧光灶，表明SAD-GFP毒株拯救成功。
