CDV-N重组狂犬病病毒的毒力及其免疫原性测定文兆海;周海滢;翟少华;陈凯云;胡远;简子健【摘要】为了探究CDV-N重组狂犬病病毒的毒力及对小鼠的免疫效果,将CDV-N 重组狂犬病病毒于BSR细胞上扩毒培养、浓缩后测定其FFD50及LD50;将浓缩后的重组病毒液与复合佐剂按一定比例混匀,按不同免疫剂量、不同免疫方式分组免疫接种小鼠,利用ELISA试剂盒对狂犬病、犬瘟热的特异性抗体进行定性/定量检测.结果显示,重组病毒浓缩后的FFD50值为7.85 logFFD50/0.1 mL,LD50值为7.67 logLD50/0.03 mL;免疫接种后第14天抗体阳性率达100％,小鼠血清中的特异性抗体IgG水平随着免疫剂量的递增而递增.试验结果可为CDV-N重组狂犬病病毒制备口服弱毒疫苗的进一步研究提供试验数据.【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2019(040)004【总页数】7页(P21-27)【关键词】重组狂犬病病毒;半数荧光灶形成量;半数致死量;免疫;抗体【作者】文兆海;周海滢;翟少华;陈凯云;胡远;简子健【作者单位】新疆农业大学动物医学学院 ,新疆乌鲁木齐 830052;新疆农业大学动物医学学院 ,新疆乌鲁木齐 830052;新疆农业大学动物医学学院 ,新疆乌鲁木齐830052;新疆农业大学动物医学学院 ,新疆乌鲁木齐 830052;新疆农业大学动物医学学院 ,新疆乌鲁木齐 830052;新疆农业大学动物医学学院 ,新疆乌鲁木齐 830052【正文语种】中文【中图分类】S852.659.5狂犬病是由狂犬病病毒(Rabies virus，RV)引起的以侵犯中枢神经系统为特征的一种高度致死性人兽共患传染病[1-2]。
患病动物的唾液中含有大量的RV，一般通过咬伤的方式，RV经唾液进入伤口沿着外周神经向中枢神经系统进犯，一旦到达大脑神经中枢，则引发狂犬病[3-4]。
而犬瘟热是由犬瘟热病毒(Canine distemper virus，CDV)引起的病死率高达80%以上的一种急性高度接触性传染病，具有极强传染性[5]。
目前，预防狂犬病、犬瘟热最为有效的方法就是疫苗接种，在全球范围内应用最广的就是灭活苗。
DNA疫苗、弱毒活疫苗、活病毒载体苗大多还处于研发或临床试验中，灭活疫苗虽然安全性好，但对大多数发展国家及广大农村地区来说免疫成本较高，不利于广泛推广应用[6-7]。
弱毒活疫苗相对灭活疫苗来说，其免疫原性好、生产成本低廉，但由于弱毒疫苗在动物体内存在反毒现象，所以世界卫生组织对于弱毒疫苗主要推荐口服免疫方式，使得基因重组弱毒口服疫苗成为了众多科研工作者的研究热点。
Faber M 等[8-9]构建额外增加1个或2个G基因的重组RV弱毒株，并对G基因333位进行了点突变，显著提高了G蛋白的表达量。
2012年王喜军[10]构建了表达狂犬病G蛋白的重组犬瘟热病毒，免疫试验表明该重组病毒具有良好的免疫原性。
2016年刘澜等[11]成功构建了表达3个G基因的重组狂犬病病毒RV-r3G株，使得G蛋白的表达量显著提高，且外周感染对小鼠的致病力降低。
本研究旨在对犬瘟热病毒N基因(Canine distemper virus N gene，CDV-N)重组狂犬病病毒的半数荧光灶形成量(fluorescence focus dose，FFD50)及半数致死量(median lethal dose，LD50)进行测定，通过不同免疫方式、不同免疫剂量免疫小鼠，摸索其最佳免疫方式及最佳免疫剂量，初步探究CDV-N重组狂犬病病毒作为犬瘟热-狂犬病二联口服弱毒疫苗株的潜力。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 实验动物 3日龄乳鼠、20 g±3 g昆明小鼠，购于新疆医科大学实验动物中心。
1.1.2 细胞、毒株及其他主要材料 BSR细胞，新疆天康生物股份有限公司惠赠；CDV-N重组狂犬病病毒，由本研究团队构建、拯救并于新疆农业大学动物病理实验室保存；狂犬病阳性血清，长春兽医研究所产品；FITC标志的兔抗犬IgG，北京博奥森公司产品；MRC血清，江苏恩莫阿赛生物技术有限公司产品；DMEM培养基、胰酶替代物、双抗，美国Gibco公司产品；Amicon Ultra超滤管，Merck公司产品；小鼠狂犬病抗体IgG定量检测试剂盒购，美国4adi公司产品；小鼠犬瘟热抗体IgG定量检测试剂盒，上海酶免公司产品；小鼠狂犬病抗体IgG定性检测试剂盒、小鼠犬瘟热抗体IgG定性检测试剂盒，上海酶联生物公司产品；灌胃针、无菌注射器，新疆子奇生物公司产品。
1.1.3 主要仪器 LSM800激光共聚焦显微镜，德国ZEISS公司产品；Galaxy170R CO2培养箱，德国Eppendorf公司产品；酶标仪，美国Bio-Rad公司产品。
1.2 方法1.2.1 重组狂犬病病毒的扩毒、浓缩及滴度测定将拯救成功的重组病毒按同步接毒的方法进行扩毒培养：①待BSR细胞长满时，弃液，PBS清洗3遍后加入胰酶替代物消化细胞。
②将重组病毒液按1∶3的量添加至BSR细胞悬液中(即将2 mL的重组病毒液加入含6 mL细胞悬液的75 cm2的细胞培养瓶中)，于37℃、体积分数为5% CO2培养箱中放置1 h，每10 min感作一次。
③向感作后的病毒细胞混合液中添加适量的含30 mL/L血清的完全培养液均分到2个培养瓶中，于37℃、体积分数为5% CO2培养箱中培养48 h后，于-20℃冰箱中反复冻融4次后收毒，以待后续浓缩。
重组狂犬病病毒的浓缩：①将回收的病毒液分装到50 mL的离心管中，4℃、2 000 r/min离心15 min沉淀细胞碎片;②用一次性无菌注射器吸取上清，经0.22μm的细菌滤器过滤;③转移滤液至超滤管中，4℃、6 000 r/min离心20 min～60 min，收集浓缩病毒液。
浓缩重组病毒的滴度测定：将浓缩后的重组病毒液倍比稀释至10-10(即100～10-10)，取10-4～10-10进行试验，消化细胞，铺板，同步接毒；40 mL/L多聚甲醛溶液固定细胞，PBS洗板3次；50 g/L脱脂奶粉封闭细胞，PBS洗板3次；加入1∶1 000配比的一抗感作，PBST洗板3次，再加二抗结合，PBST洗板3次；最后滴加适量80%甘油保护荧光；倒置荧光显微镜观察、计数。
利用Reed & Muench法计算FFD50，公式如下：感染起始稀释度对数与50%感染终点稀释度对数之差，(50%-低于50%感染的百分数)/(高于50%感染的百分数-低于50%感染的百分数)×倍比稀释的对数1.2.2 浓缩重组病毒的半数致死量测定试验①将浓缩后的病毒液按100～10-10作倍比稀释，将3日龄乳鼠按10-1 ～10-10滴度分成10组，每组10只进行试验，取10只乳鼠接种DMEM培养基作对照组;②碘酊、酒精涂抹消毒后，用微量注射器吸取病毒液0.03 mL/只乳鼠脑内注射;③连续21 d观察各组乳鼠的死亡情况并统计，按Reed-Muench法计算LD50。
公式如下：LogLD50=高于50%病毒稀释倍数+距离比×稀释系数的对数。
距离比=(高于50%死亡的百分数-50%)/(高于50%死亡的百分数-低于50%死亡的百分数)1.2.3 小鼠按不同免疫剂量、不同免疫方式进行分组免疫分组情况如下：第1组为复合佐剂50 μL+病毒液50 μL，第2组为复合佐剂150 μL+病毒液150 μL，第3组为复合佐剂300 μL+病毒液300 μL，第4组为复合佐剂50 μL+病毒液50μL，第5组为复合佐剂150 μL+病毒液150 μL，第6组为复合佐剂300 μL+病毒液300 μL，第7组为亲本毒株SRV9口服600 μL作为对照。
具体情况如表1所示。
表1 实验动物分组、免疫和检测时间表Table 1 Grouping,immunization and testing schedules of laboratory animals组别Groups免疫方式Immune mode免疫次数/次Immunization times试验动物数量Number of experimental animals免疫剂量/μLImmunizing dose免疫时间/dImmunetime检测时间/dDetection time第1组 First group口服 Oral administration341000,7,147,14,21,35,49第2组 Second group口服 Oral administration343000,7,147,14,21,35,49第3组 Third group口服 Oral administration346000,7,147,14,21,35,49第4组 Fourth group注射Injection341000,7,147,14,21,35,49第5组 Fifth group注射Injection343000,7,147,14,21,35,49第6祖 Sixth group注射Injection346000,7,147,14,21,35,49第7组 Seventh group口服 Oral administration346000,7,147,14,21,35,49复合免疫佐剂(分别将氢氧化锌0.8 mg、细菌脂多糖100 μg、甘露低聚糖10 mg、枸杞多糖50 mg加入1 mL蒸馏水中溶解混匀)与浓缩病毒液按1∶1混匀，通过灌喂和腿部肌肉注射的方式免疫小鼠。
分别于免疫接种后第7天、第14天、第21天、第35天、第49天进行断尾采血，静置离心，吸取血清，严格按照ELISA 试剂盒的说明进行操作，对免疫后小鼠血清中特异性抗体IgG水平进行检测。
免疫期间每天观察各组小鼠有无狂犬病的临床表现，有无死亡情况，如有小鼠死亡则对其进行病理剖检及病理组织学检查，查找死亡原因。
2 结果2.1 浓缩重组病毒的滴度测定结果如表2所示，根据不同视野下细胞的感染数，代入Reed & Muench公式计算FFD50的值等于10-7.85，即50%感染终点稀释度(FFD50)=10-7.85。
表2 重组狂犬病病毒感染细胞的百分比Table 2 Percentage of cells infected with recombinant rabies virus病毒稀释倍数Virus dilution 含感染细胞的视野数Visual field number of infected cells含感染细胞的视野Visual field number of infected cells不含感染细胞的视野Field of vision without infected cells含感染细胞视野的百分比Percentage of visual field with infectedcells10-410/1059059/59=100%10-510/1049049/49=100%10-610/1039039/39=100%10-710/1029029/29=100%10-89/1019119/20=95%10-96/10949/13=69%10-103/10373/10=30%2.2 浓缩重组病毒液的半数致死量(LD50)测定结果经21 d观察乳鼠的死亡情况如表3所示，按Reed-Muench计算重组病毒的LD50。
