双抗体夹心一步半法检测乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)实验设计

第1篇一、实验目的1. 掌握双抗体夹心法的基本原理和操作步骤。

2. 学习利用ELISA技术检测乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）。

3. 分析实验结果，验证实验方法的有效性和准确性。

二、实验原理双抗体夹心法是一种常用的酶联免疫吸附试验（ELISA）方法，用于检测抗原。

其基本原理是将抗原与抗体结合，形成抗原-抗体复合物，再加入酶标记的抗体，通过显色反应判断抗原含量。

具体步骤如下：1. 将已知抗体包被于固相载体上，形成固相抗体。

2. 加入待测标本，若标本中含有目标抗原，则与固相抗体结合，形成抗原-抗体复合物。

3. 洗涤去除未结合的标本。

4. 加入酶标记的抗体，该抗体能与抗原-抗体复合物中的抗原结合。

5. 再次洗涤去除未结合的酶标记抗体。

6. 加入底物，底物在酶的催化下发生颜色变化，颜色深浅与抗原含量成正比。

三、实验材料1. 乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）标准品2. 乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）单克隆抗体3. 酶标记的二抗（辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG抗体）4. 酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒5. 微孔板6. 仪器：酶标仪、离心机、移液器等四、实验步骤1. 包被抗体：将乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）单克隆抗体稀释后，加入微孔板中，每孔100μl，37℃孵育过夜。

2. 洗涤：弃去孔内液体，用洗涤液洗板3次，甩干。

3. 封闭：加入封闭液，每孔200μl，37℃孵育1小时。

4. 洗涤：弃去孔内液体，用洗涤液洗板3次，甩干。

5. 加样：将待测标本、阳性对照、阴性对照和空白对照分别加入对应的孔中，每孔100μl，37℃孵育1小时。

6. 洗涤：弃去孔内液体，用洗涤液洗板3次，甩干。

7. 加酶标记二抗：将酶标记的二抗稀释后，加入各孔中，每孔100μl，37℃孵育1小时。

8. 洗涤：弃去孔内液体，用洗涤液洗板3次，甩干。

9. 加底物：将底物A液和B液按比例混合，加入各孔中，每孔100μl，37℃孵育15分钟。

乙型肝炎病毒表面抗原定性检测1. 检验目的采用酶联免疫吸附试验（ELISA）- 双抗体夹心法，定性检测患者血清中的乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）。

2. 检测原理采用单克隆抗-HBs包被反应板，加入待测标本，同时加入多克隆抗-HBs-HRP，当标本中存在HBsAg时，该HBsAg与包被抗-HBs结合，并与抗-HBs-HRP结合，形成抗-HBs-HBsAg-抗-HBs-HRP复合物，加入TMB底物产生显色反应，反之则无显色反应。

3. 设备和试剂3.1仪器：Microlab STAR IVD ELISA全自动酶免仪，美国HAMILTON公司。

3.2 试剂：乙型肝炎病毒表面抗原检测试剂盒，厦门英科新创科技有限公司。

试剂盒组成：·微孔反应板：12孔*8条。

·酶结合物、阳性对照、阴性对照。

·显色剂A，显示剂B，终止液，封片。

·浓缩洗涤液，用前以蒸馏水作20倍稀释。

3.3 试剂盒2-8℃避光保存，有效期12个月。

4. 性能参数4.1 阴性参考品符合率 20/204.2 阳性参考品符合率 3/34.3精密性 CV（%，n=10）≤15%4.4灵敏性：各亚型的最低检出量符合要求4.5稳定性：试剂盒内各组分，37℃放置6天，产品性能仍符合以上标准5. 样品5.1静脉抽取病人空腹血标本2mL，置于干燥管或含分离胶的促凝管内。

5.2 样品收到后立即以3000转/分钟，离心10分钟，分离血清。

不能及时测定的血清应置于2～8℃冰箱保存，于7日内检测；长期储存应低温冻存，避免反复冻融。

5.3 严重溶血和脂血的样品不能做检测。

6. 容器及添加剂血液标本使用含分离胶的真空管或者促凝管。

（黄色管帽）。

7. 校准程序每年仪器公司对仪器校准一次，计量局每年对酶标仪、移液器、水浴箱等进行校准。

8. 操作程序8.1平衡：将试剂盒各组份取出，室温平衡30分钟后方可使用，微孔板开封后，余者及时用袋封存于冰箱中，保证7天内用完。

免疫室乙肝两对半操作规程一、试验原理“乙肝两对半”指乙型肝炎病毒表面抗原（HBSAg）、乙型肝炎病毒表面抗体（HBSAb）、乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg）、乙型肝炎病毒e抗体（HBeAb）、乙型肝炎病毒核心抗体（HBcAb）此五项指标，目前国内医院最常用的乙肝病毒感染检测血清标志物，判断是否感染乙肝与粗估病毒复制水平初步检查。

两对半中各项试验反应原理如下： 1、乙型肝炎病毒表面抗原检测：采用ELISA“双抗体夹心法”原理，用抗-HBs包被板条，用HRP 标记抗-HBs为酶标记物，以四甲基联苯氨（TMB）和过氧化物为底物。

当标本中存在HBSAg时，该表面抗原与包被抗-HBs结合并与抗-HBs-HRP结合形成抗-HBs-HBSAg-抗-HBs-HRP复合物，加入TMB底物产生显色反应，反之则无显色反应。

在试验结束时，有颜色变化的，提示有HBSAg存在，无颜色或颜色变化微弱的，则提示不存在HBSAg。

2、乙型肝炎病毒表面抗体检测：采用ELISA“双抗原夹心法”检测人血清或血浆中的抗-HBS,采用HBSAg包被反应板，加入待测标本，同时加入HBSAg-HRP进行孵育。

当标本中存在抗-HBS时，该抗体与包被的HBSAg结合并与酶结合物形成HBSAg-抗-HBS-HBSAg-HRP复合物，洗去游离反应物，加入显色剂，将有明显颜色变化；当标本中没有抗-HBS时，加入底物后没有或只有很轻微的颜色变化。

3、乙型肝炎病毒e抗原检测：采用ELISA“双抗体夹心法”检测，用单抗-HBe包被板条，用HRP标记抗-HBe为酶标记物，以四甲基联苯氨（TMB）和过氧化物为底物。

当标本中存在HBeAg时，该HBeAg与包被抗-HBe结合并与抗-HBe-HRP结合形成抗-HBe-HBeAg-抗-HBe-HRP复合物，加入TMB底物产生显色反应，反之则无显色反应。

在试验结束时，有颜色变化的，提示有HBeAg存在，无颜色或颜色变化微弱的，则提示不存在HBeAg。

一、实训背景乙型肝炎（HBV）是一种严重危害人类健康的传染病，主要通过血液、性接触和母婴垂直传播。

乙肝病毒感染后，人体会产生相应的免疫反应，表现为血清学指标的变化。

乙肝两对半检测是诊断乙型肝炎的重要手段，包括乙肝表面抗原（HBsAg）、乙肝表面抗体（HBsAb）、乙肝e抗原（HBeAg）、乙肝e抗体（HBeAb）和乙肝核心抗体（Anti-Hbc）五项指标。

为了更好地了解乙肝两对半检测在临床诊断中的应用，我们进行了乙肝两对半实训。

二、实训目的1. 掌握乙肝两对半检测的基本原理和操作步骤；2. 熟悉乙肝两对半检测在临床诊断中的应用；3. 提高实验室工作人员的检测能力和临床思维。

三、实训内容1. 乙肝两对半检测原理乙肝两对半检测是一种酶联免疫吸附试验（ELISA），利用特异性抗体与抗原之间的免疫反应，检测血清中相应抗原或抗体的含量。

检测原理如下：（1）乙肝表面抗原（HBsAg）：检测血清中HBsAg的含量，判断是否感染乙肝病毒。

（2）乙肝表面抗体（HBsAb）：检测血清中HBsAb的含量，判断是否产生免疫保护。

（3）乙肝e抗原（HBeAg）：检测血清中HBeAg的含量，判断病毒复制活跃程度。

（4）乙肝e抗体（HBeAb）：检测血清中HBeAb的含量，判断病毒复制受到抑制。

（5）乙肝核心抗体（Anti-Hbc）：检测血清中Anti-Hbc的含量，判断既往感染乙肝病毒。

2. 乙肝两对半检测操作步骤（1）样本处理：取血清样本，加入抗凝剂，离心分离血浆。

（2）加样：将待测样本和对照品分别加入酶联免疫吸附板孔中。

（3）加酶联抗体：加入特异性抗体，与抗原结合。

（4）洗涤：去除未结合的抗体。

（5）加酶底物：加入酶底物，与抗体-抗原复合物中的抗体发生反应。

（6）显色：酶底物被氧化还原后，产生颜色变化。

（7）终止反应：加入终止液，终止颜色反应。

（8）测定吸光度：使用酶标仪测定吸光度值，判断样本中抗原或抗体的含量。

3. 乙肝两对半检测在临床诊断中的应用（1）急性乙型肝炎的诊断：HBsAg阳性，HBeAg阳性，Anti-Hbc阳性，提示急性乙型肝炎。

人乙肝表面抗原（HBsAg）酶联免疫分析（ELISA）试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定人血清，血浆及相关液体样本中乙肝表面抗原（HBsAg）水平。

实验原理：本试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫法（ELISA）测定标本中人乙肝表面抗原（HBsAg）。

用纯化的人乙肝表面抗原（HBsAg）抗体包被微孔板，制成固相抗体，可与样品中乙肝表面抗原（HBsAg）相结合，经洗涤除去未结合的抗原和其他成分后再与HRP标记的乙肝表面抗原（HBsAg）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。

TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。

用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD值），与CUTOFF值相比较，从而判定标本中人乙肝表面抗原（HBsAg）的存在与否。

样本处理及要求：1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

胸腹水、脑脊液参照实行。

4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。

离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清。

检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。

通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。

离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清。

保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

5. 组织标本：切割标本后，称取重量。

加入一定量的PBS，PH7.4。

乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒（酶联免疫法）说明书检验原理本试剂盒采用双抗体夹心法酶联免疫吸附实验原理。

在微孔条上预包被纯化乙肝表面抗体（HBsAb），配以酶标记抗体（HBsAb-HRP）及TMB显色剂等其他试剂，检测人血清或血浆中的乙肝表面抗原（HBsAg）。

适用机器加样器、温箱、洗板机、含波长450mm的酶标仪样本要求1.本试剂使用样品为人血清或血浆，含有EDTA、柠檬酸钠或肝素等抗凝剂的样品可用于本实验。

2.不能检测含叠氮钠、悬浮纤维蛋白或聚集物、重度溶血的样品。

3.样品中应无微生物，可在2~8℃储存一周，长期储存应低温冻存，避免反复冻融。

使用前请将样品室温平衡30分钟以上，冷冻样品实验前需混匀。

检验方法1.配液：将浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水20倍稀释。

2.编号：将样品对应微孔板按序编号，每板应设阴性对照孔3孔，阳性对照孔2孔和空白对照孔1孔。

（用双波长检测，可不设空白对照孔）。

3.稀释：每孔加入样品稀释液20 μL，空白对照孔除外。

4.加样：分别在相对应孔中加入待测样品或阴性、阳性对照100μL，轻轻振荡混匀。

（非常重要）5.温育：用封板膜封后，置37±1℃温育60±2分钟。

（如有酶联反应加速仪温育时间可减半）。

6.加酶：每孔加入酶标试剂50μL，空白孔除外，轻轻振荡混匀。

7.温育：用封板膜封后，置37±1℃温育30±1分钟。

（如有酶联反应加速仪温育时间可减半）。

8.洗版：小心揭掉封板膜，用洗板机洗涤5遍，拿出来在扣在洗版纸上重重拍干。

9.显色：每孔加入显色剂A、B液（底物）各50μL，轻轻振荡混匀，37±1℃避光显色30分钟。

10.测定：每孔加入终止液50μL，轻轻振荡混匀，十分钟内测定结果。

设定酶标仪波长于450nm处（建议用双波长450um/600~650nm），用空白孔凋零点后测定各孔A值。

检验结果的解释1.阴性对照孔A值≤0.10，阳性对照孔A值≥0.80，否则试验无效。

广西中医药大学赛恩斯新医药学院医学免疫学与微生物学实验报告（供本科各类专业选用）广西中医药大学医学免疫学与微生物学教研室二○一八年三月实验一、溶血实验原理：方法与结果：摇匀，置37℃水浴30分钟结果分析：实验二、环状沉淀试验原理：结果分析：实验三、ELISA 、淋巴细胞转化与E 花环观察一、ELISA 双抗体夹心法检测乙肝病毒表面抗原（HBsAg ）原理：二、淋巴细胞转化与E 花环观察淋转 E 花环三、未转化与转化淋巴细胞形态特征比较实验四、凝集实验一、试管凝集反应原理：管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9生理盐水（ml）1:10病人血清（ml）0.5 0.5诊断菌液（ml）0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5血清稀释度充分混匀，置 52℃水浴箱孵育45分钟左右结果血清凝集效价：二、玻片凝集反应原理：实验步骤：实验结果：0.5实验五、细菌的革兰氏染色、细菌形态与结构观察一、基本形态观察：球菌杆菌弧菌菌名：特点：二、细菌的特殊结构观察：菌名：结构：功能：实验六、细菌的培养与代谢产物观察一、细菌的培养二、细菌代谢产物观察（一）细菌对糖发酵作用——糖发酵试验（二）细菌对蛋白质或氨基酸的分解作用（三）色素的产生实验七、细菌分布的检测一、结果记录二、结果分析实验八、理化因素对细菌的影响一、物理因素对细菌的影响二、化学因素对细菌的影响三、抗菌药物对细菌的影响。

人乙肝表面抗原（HBsAg）酶联免疫分析（ELISA）试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定人血清，血浆及相关液体样本中乙肝表面抗原（HBsAg）水平。

实验原理：本试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫法（ELISA）测定标本中人乙肝表面抗原（HBsAg）。

用纯化的人乙肝表面抗原（HBsAg）抗体包被微孔板，制成固相抗体，可与样品中乙肝表面抗原（HBsAg）相结合，经洗涤除去未结合的抗原和其他成分后再与HRP标记的乙肝表面抗原（HBsAg）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。

TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。

用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD值），与CUTOFF值相比较，从而判定标本中人乙肝表面抗原（HBsAg）的存在与否。

样本处理及要求：1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

胸腹水、脑脊液参照实行。

4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。

离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清。

检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。

通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。

离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清。

保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

5. 组织标本：切割标本后，称取重量。

加入一定量的PBS，PH7.4。

ELISA（双抗体夹心法）—检测HBsAg摘要：以已知抗体(抗HBs)包被载体，然后将含有抗原的待检标本加入，共同孵育后，抗原结合于包被抗体上，再加入酶标记特异抗体(酶标抗HBs)，酶标抗体连接到抗原上，最后加入底物溶液，根据颜色反应来判定抗原含量。

【材料】HBsAg试剂盒，本试剂盒含: 1、包被抗-HBs反应条 1瓶 2、酶结合物 1瓶 3、HBsAg阳性对照 1瓶 4、HBsAg阴性对照 1瓶 5、洗涤液:用前每瓶作1：20稀释 1瓶 6、显色剂（找产品，上生物帮>> >>相关专题ELISA免疫实验技术以已知抗体(抗HBs)包被载体，然后将含有抗原的待检标本加入，共同孵育后，抗原结合于包被抗体上，再加入酶标记特异抗体(酶标抗HBs)，酶标抗体连接到抗原上，最后加入底物溶液，根据颜色反应来判定抗原含量。

【材料】HBsAg试剂盒，本试剂盒含:1、包被抗-HBs反应条1瓶2、酶结合物1瓶3、HBsAg阳性对照1瓶4、HBsAg阴性对照1瓶5、洗涤液:用前每瓶作1：20稀释1瓶6、显色剂(TMB)A1瓶7、显色剂(TMB)B1瓶8、终止液1瓶【方法】1、加入待测标本每孔0.05ml，并设HBsAg阳性对照2孔，HBsAg阴性对照2孔，空白对照1孔，然后加入酶结合物每孔1滴(0.05ml、空白对照孔不加)，充分混匀后置37℃孵育30分钟。

2、洗板:弃去反应条孔内液体、拍干、用洗涤液注满每孔，弃去拍干，反复五次后拍干。

3、显色剂:先加显色剂A每孔1滴(0.05ml)，然后再加显色剂B每孔1滴(0.05ml)，混匀，37℃孵育10分钟。

4、每孔加终止液1滴(0.05ml)，混匀。

【结果】比色法:波长450nm，先用空白孔校零点，然后读取各孔光密度值。

样品OD值/阴性对照平均OD值≥ 2.1判断为阳性，否则为阴性。

备注：阴性对照平均OD值低于0.05作0.05计算，高于0.05按实际OD值计算。