褐黄孢链霉菌基因组DNA的提取及RAPD体系的优化

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２＋Ｍｇ（ｍｍｏｌ／Ｌ）
２．０２．５３．０３．５３．５３．０２．５２．０２．５２．０３．５３．０３．０３．５２．０２．５
将提取的ＤＮＡ样品经核酸蛋白分析仪测定波长６０ｎｍ、２８０ｎｍ的吸收值，根据公式：ＤＮＡ的产量为２（ｎｇ／ｌ）＝ＯＤ５０×稀释倍数，计算ＤＮＡ的产量。 μ ２６０× 然后将ＤＮＡ样品稀释至１５ｎｇ／ｌ，在０．７％的琼脂糖凝 μ 胶上电泳检测ＤＮＡ的质量。１．５ＲＡＰＤ体系的优化１．５．１ＰＣＲ扩增反应程序反应程序设置为：９４ ℃预变性４ｍｉｎ，９４ ℃变性３０ｓ，３６ ℃退火３０ｓ，７２ ℃延伸２ｍｉｎ，４０个循环，最后７２ ℃延伸１０ｍｉｎ。
摘要以改进的ＳＤＳ法提取褐黄孢链霉菌基因组ＤＮＡ，对其进行随机扩增多态性（ＲＡＰＤ）研究。通过单因素和正交试验相结合的方法，建立了适于褐黄孢链霉菌ＲＡＰＤ分析的ＰＣＲ反应体系：包
２＋ａｑ聚合酶、Ｍｇ、随机引物、ｄＮＴＰｓ和模板浓度。在２０ｌ体系中，模板ＤＮＡ浓度６０～１５０ｎｇ，括Ｔ μ ２＋Ｔａｑ聚合酶为１．０～１．５Ｕ，引物浓度０．３～０．４ｍｍｏｌ／Ｌ，ｄＮＴＰｓ浓度２００～２５０ｍｏｌ／Ｌ，Ｍｇ浓度２．５ μ
２００８，２８（６ｓ）
刘丹等：褐黄孢链霉菌基因组ＤＮＡ的提取及ＲＡＰＤ体系的优化
１７３
公司）；全自动凝胶成像仪（ＧＥＮＥＧＥＮＩＵＳ；美国基因联合公司）；核酸蛋白分析仪（ＳｍａｒｔＳｐｅｃ（ＴＭ）ＰＬＵＳ；ＢＩＯ－ＲＡＤ有限公司）；电泳仪（ＢＩＯ－ＲＡＤＳＵＢ－ＣＥＬＬＧＴＣＥＬＬ；ＢＩＯ－ＲＡＤ有限公司）。
序号１２３４５６７８９１０１１１２１３１４１５１６ＤＮＡ（ｎｇ）６０６０６０６０８０８０８０８０１００１００１００１００１５０１５０１５０１５０Ｔａｑ聚合酶（Ｕ）０．５１．０１．５２．００．５１．０１．５２．００．５１．０１．５２．００．５１．０１．５２．０Ｐｒｉｍｅｒ（ｍｏｌ／Ｌ） μ ０．２０．３０．４０．５０．３０．２０．５０．４０．４０．５０．２０．３０．５０．４０．３０．２ｄＮＴＰｓ（ｍｏｌ／Ｌ） μ １００１５０２００２５０２００２５０１００１５０２５０２００１５０１００１５０１００２５０２００
中国生物工程杂志ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００８，２８（６ｓ）：１７２～１７７
褐黄孢链霉菌基因组ＤＮＡ的提取及ＲＡＰＤ体系的优化
刘丹骆健美刘峰王敏（天津科技大学生物工程学院天津市工业微生物重点实验室天津３００４５７）
７］１．３基因组ＤＮＡ提取方法［
在单因素试验基础上，对ＲＡＰＤ影响因素模板浓ＴａｑＤＮＡ聚合酶用量、引物浓度、ｄＮＴＰｓ浓度和度、
２＋９］Ｍｇ浓度按正交组合设计［，正交试验因素水平见表５２。根据因素水平表查正交表Ｌ４），确定试验方案１６（
～３．０ｍｍｏｌ／Ｌ。在此反应体系下可扩增出条带数目多且清晰稳定的电泳图谱。关键词褐黄孢链霉菌ＤＮＡ提取ＲＡＰＤ优化
中图分类号Ｑ９３９．９２纳他霉素是一种多烯大环内酯类抗生素，对酵母，霉菌和丝状真菌具有明显的抑制作用，抑菌谱系广泛，但无抗细菌活性。所以纳他霉素作为一种天然的生物食品防腐剂可以广泛应用于易受真菌污染的食品工业各领域
［１］
ＮＡ进行ＰＣＲ扩增，电泳分离后直接检测其多态因组Ｄ性。ＲＡＰＤ技术可以在不知道物种任何分子生物学背ＮＡ多态性分析，扩增所需模板ＤＮＡ景下，对其进行Ｄ用量少，对ＤＮＡ的纯度要求也不高，操作简便、快速。目前已广泛应用于遗传多样性检测、种质纯度鉴定、起
表１ＲＡＰＤ单因素试验设计方案Ｔａｂｌｅ１ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔｄｅｓｉｇｎｆｏｒｓｉｎｇｌｅｆａｃｔｏｒｏｆＲＡＰＤｒｅａｃｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ
）。（表３
表２反应条件正交组合设计因素水平表Ｔａｂｌｅ２ＯｒｔｈｏｇｏｎａｌｄｅｓｉｇｎｆａｃｔｏｒｉａｌｌｅｖｅｌｓｏｆＲＡＰＤｒｅａｃｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ
水平１２３４ＤＮＡ（ｎｇ）６０８０１００１５０Ｔａｑ聚合Ｕ）酶（０．５１．０１．５２．０因素Ｐｒｉｍｅｒ（ｍｏｌ／Ｌ） μ ０．２０．３０．４０．５ｄＮＴＰｓ（ｍｏｌ／Ｌ） μ １００１５０２００２５０
２＋聚合酶５Ｕ／ｌ、２×ＧＣＢｕｆｆｅｒ（Ｍｇ５ｍｏｌ／Ｌ）、ｄＮＴＰｓ（２． μ
人工合成的约１０ｂｐ的随机序列寡核苷酸作引物，对基
收稿日期：２００８０２２６修回日期：２００８０３２６０７ＪＣＹＢＪＣ０７８００）、天津科天津市应用基础研究计划面上项目（技大学引进人才科研启动基金（２００６０４２６）、ＩＦＳ国际科学基金（Ｆ／４２３９－１）资助项目电子信箱：ｌｕｏｊｉａｎｍｅｉ＠ｔｕｓｔ．ｅｄｕ．ｃｎ通讯作者，
８］１．４ＤＮＡ的质量检测［
２．５３．０３．５
表３反应条件正交组合设计试验实施方案Ｔａｂｌｅ３ＩｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙｓｃｈｅｍｅｏｆｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｄｅｓｉｇｎｏｆＲＡＰＤｒｅａｃｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ
５ｍｍｏｌ／Ｌ）购自宝生物工程（大连）有限公司；１ｋｂＤＮＡＬａｄｄｅｒ和１０碱基随机引物（Ｓ１４５８：ＡＣＧＡＧＡＧＧＣＡ）购自上海生工生物工程技术服务有限公司。１．２．２主要仪器ＰＣＲ分析仪（ＨＢＰＸ２２２０；美国热电
４］ＡＰＤ）是由Ｗｉｌｌｉａｍｓ等［和ＷｅｌｓｈｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃＤＮＡ，Ｒ５］等［于１９９０年分别提出的一种分子标记技术。它以
鉴于此，本文对褐黄孢链霉菌基因组ＤＮＡ的提取方法ＡＰＤ分析的ＰＣＲ反应体系进行了系统的优及适于ＲＡＰＤ技术探究褐黄孢链霉菌生物合化，为进一步采用Ｒ成纳他霉素的基因表达研究和功能分析奠定了基础。
２＋初始反应体系为（２０ｌ）：２×ＧＣＢｕｆｆｅｒ，Ｍｇ２．５ μ
ｍｍｏｌ／Ｌ，ｄＮＴＰｓ２００ｍｏｌ／Ｌ，Ｐｒｉｍｅｒ０．４ｍｏｌ／Ｌ，Ｔａｑ μ μ １．５Ｕ，模板ＤＮＡ３０ｎｇ。ＲＡＰＤ单因素反应各组分的变化见表１，在其它条件不变的情况下，按照一定的梯度改变单个因子浓度来筛选最佳扩增条件。为了确定反应的稳定性，以下实验均重复３次。
２＋Ｍｇ（ｍｍｏｌ／Ｌ）２．０
离心收集菌丝体于ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ离心管中，用溶菌酶缓冲液ＴＥＳ（０．３ｍｏｌ／Ｌ蔗糖，２５ｍｍｏｌ／ＬｐＨ８．０Ｔｒｉｓ－，２５ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ）洗涤两次；将菌体用５００ｌ３ｍｇ／ＨＣｌ μ ｍｌ溶菌酶溶液悬浮，３７ ℃ 水浴至发粘，约４５ｍｉｎ；加入５０ｌ１ｍｇ／ｍｌ的蛋白酶Ｋ，５６ ℃ 水浴３０ｍｉｎ；加入３７ ℃ μ １０％的ＳＤＳ（终浓度为１％）和０．５ｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ６０ｌ水 μ ｈ；加入等体积的氯仿／异戊醇（２４ ∶ １），混匀，浴１１２０００ｒ／ｍｉｎ离心３ｍｉｎ，取上清液；重复用氯仿／异戊醇抽提两次；用两倍体积的预冷的无水乙醇沉淀ＤＮＡ；沉０％的无水乙醇洗涤两次并转至另一新的离心管淀用７中，待乙醇挥干后，加入１００ｌ的ＴＥ缓冲液溶解ＤＮＡ， μ 贮存于－２０ ℃冰箱中，备用。

用于RAPD分析的树莓基因组总DNA提取初报

用于RAPD分析的树莓基因组总DNA提取初报
卞贵建;路艳;周庆阳
【期刊名称】《广东农业科学》
【年(卷),期】2007(000)003
【摘要】以树莓嫩叶为材料,进行树莓基因组总DNA不同提取方法的比较试验.结果表明:CTAB法、SDS法、改良CTAB法均可成功提取树莓DNA,但无论在质量上还是在数量上,改良CTAB法都优于常规CTAB法和SDS法,所提取的DNA大多呈现无色透明状,A260/ A280值多数介于1.65～1.90,完全可以用于RAPD分析.【总页数】3页(P36-38)
【作者】卞贵建;路艳;周庆阳
【作者单位】山东交通职业学院公路系,山东,潍坊,261206;潍坊学院生物工程学院,山东,潍坊,261061;四川农业大学林学园艺学院,四川,雅安,625014
【正文语种】中文
【中图分类】S663.2
【相关文献】
1.用于RAPD分析的油菜总DNA的快速提取 [J], 王灏;王道杰;谭小力;胡选萍;李殿荣
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3.适用于RAPD分析的蚕卵基因组DNA快速提取方法的探讨 [J], 莫红丽;廖富蘋;林健荣;余爱群;文哲光
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5.桑树有性杂交后代与双亲基因组DNA的RAPD分析初报 [J], 楼程富;张有做因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

药用百合DNA提取和RAPD条件的优化

药用百合DNA提取和RAPD条件的优化童巧珍;盛孝邦;刘湘丹;周日宝;吴佳【期刊名称】《湖南中医药大学学报》【年(卷),期】2008(28)2【摘要】目的确定药用百合最佳随机扩增多态DNA(RAPD)分析方法 .方法以药用百合新鲜鳞叶为材料,研究DNA的提取方法 ,并对影响RAPD反应的各因素进行优化.结果药用百合RAPD反应体系及程序为:在40 μL反应体系中,含40 ng模板DNA,0.3 μmol/L随机引物,0.2 mmol/L dNTPs,1.7 mmol/L Mg2+,3 μL10×PCRBuffer,1.5 U Taq酶;扩增程序为:第一步94℃预变性2 min,第二步94℃变性1 min,第三步36℃退火45s,第四步72℃延伸90s.返回至第二步重复40个循环,第六步72℃延伸10 min,最后4℃保存以备电泳.结论建立了药用百合RAPD 的优化反应体系及程序.【总页数】4页(P33-36)【作者】童巧珍;盛孝邦;刘湘丹;周日宝;吴佳【作者单位】湖南农业大学,湖南,长沙,410128;湖南中医药大学,湖南,长沙,410007;湖南农业大学,湖南,长沙,410128;湖南中医药大学,湖南,长沙,410007;湖南中医药大学,湖南,长沙,410007;湖南中医药大学,湖南,长沙,410007【正文语种】中文【中图分类】R284.2【相关文献】1.兰州百合DNA提取方法比较及RAPD体系的快速优化 [J], 崔文娟;林玉红;欧巧明;石有太;罗俊杰2.广东野百合DNA提取和RAPD条件的优化 [J], 黄永芳;杨懋勋;柳军;周锦平3.兰州百合DNA提取方法比较及RAPD体系的快速优化 [J], 崔文娟;林玉红;欧巧明;石有太;罗俊杰4.濒危药用植物降香黄檀DNA提取及RAPD反应体系优化 [J], 杨新全;冯锦东;杨成民;魏建和;李榕涛;何明军5.亚洲百合DNA的提取及RAPD-PCR反应体系的优化 [J], 赵琛因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

玉米种子基因组DNA提取及RAPD分析

玉米种子基因组DNA 提取及RAPD 分析Ξ徐其放1,朱苏文2,常　弘1(1.中山大学生命科学学院,广东广州510275;2.安徽农业大学生命科学学院,安徽合肥230036)摘　要:采用了两种不同DNA 提取方法(常规法及改进法)从玉米Zea mays 种子的胚和胚乳中分别提取基因组。

结果表明,在两种不同的提取方法中,改进法比常规法有提取的DNA 纯度高、RNA 含量少、DNA 降解少等优点。

无论从胚和胚乳中提取的DNA 都可以满足RAPD 的要求。

为玉米RAPD ,分子标记,品质鉴定等研究提供可行的依据。

关键词:玉米;胚;胚乳;基因组;RAPD 中图分类号:Q503 文献标识码:A 文章编号:052926579(2003)0520078204 RAPD (Random Am plified ploym orphic DNA )技术是1990年由William 和Welsh 等发展的一种分子生物学技术,在此前国内外对玉米Z ea mays 自交系和杂交系的室内鉴定工作主要是利用蛋白质及同工酶电泳方法,而RAPD 技术测定是特定的DNA 片段,对于一个特定的基因型来说,这些扩增的片段是唯一的,所以用RAPD 技术来鉴定玉米自交系及杂交种的纯度及真伪有很强的优势,因此它被迅速用于品质鉴定[1]、分子标记、转基因分析及克隆等生物技术领域里。

本实验就是探讨从玉米种子中提取基因组DNA 及用于RAPD 分析,而不同于一般方法的从植株中提取基因组DNA 。

因为从种子中提取DNA 快速,不用等待其萌发,甚至长出子叶,这样就可以随时对其进行DNA 提取作相关的研究。

而且实验又从种子胚乳中提取基因组DNA ,不破坏种子胚,直接切取种子胚乳部分,这样没有受到损伤的种子胚仍可以发芽,长出植株。

1　材料与方法111　材　料以玉米种子(L 173)用做实验材料,分别取种子的胚及胚乳两个不同的部分进行。

112　实验仪器及试剂DNA 提取液(100mm ol ΠL Tris-HCl ,100mm ol ΠL E DT A ,500mm ol ΠL NaCl ,ρ=115%S DS ),氯仿,无水乙醇,φ=70%乙醇,TE (含RNA 酶),PCR 反应体系(bu ffer ,T aq 酶,dNTPs ,MgCl 2,primers ,DNA 模板,无菌水),移液枪(20,200,1000μL ),电泳仪,PCR 扩增仪(HE M A 4800),离心机,冰箱,水浴锅。

何首乌基因组DNA提取及RAPD反应体系正交设计优化

何首乌基因组DNA提取及RAPD反应体系正交设计优化(作者：_________ 单位： ____________ 邮编： __________ )【摘要】目的确定适合何首乌RAPD-PC的基因组DNA 提取方法及最适宜反应体系。

方法通过改良的CTAB法提取何首乌基因组DNA研究其用于RAPD-PCR勺可行性。

利用正交设计方法L16 (45)，针对Tag酶，引物，dNTP镁离子，模板设计了5因素4水平的正交实验，优化RAPD-PC反应体系。

结果正交设计结果表明，可以得到几种不同的有效扩增反应体系组合。

根据实际需求，最适宜的RAPD-PC 反应体系为20 卩I，其中1X PCR buffer, Tag 酶1U，弓I 物 1 卩mol/L，镁离子2 mmol/L，dNTP 300 卩mol/L，模板40 ng。

结论改良的CTAB法和正交优化得到的反应体系适合用于何首乌RAPD 遗传多样性分析。

【关键词】何首乌；DNA提取；RAPD正交设计何首乌是我国传统医药中的名贵药材，何首乌块根及茎叶均可入药。

何首乌具有补肝肾、益精血、乌须黑发、养心安神等功效，主治血虚身痛、心烦失眠、劳伤多汗等症。

同时可用于保健和食品等多方面，何首乌块根富含淀粉，含量高达45.2%,药食两用。

RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)技术是由美国学者Williams : 1］和Welsh :2］两个研究团队在1990年几乎同时发展起来的。

Williams等在发现RAPD多态性的同时还证明了RAPD标记的分离情况符合孟德尔遗传规律，因而明确了RAPD乍为分子标记用于研究生物遗传变异的理论基础。

RAPD分子标记建立在PCR基础之上。

通过使用一系列具有10个碱基的单链随机引物，对基因组的全部DNA进行PCR扩增以检测多态性。

RAPD^术因其操作简便、反应迅速、成本低和DNA用量少等优点而被广泛应用于药用植物种内或种间亲缘关系和遗传多样性方面的研究。

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