布鲁氏菌虎红平板凝集试验

虎红平板凝集试验（RBPT）：实验原理：该试验又称为板式孟加拉红平板凝集实验。

由于所用的抗原是酸性（PH3.6—3.9）带色的抗原，该抗原与被检血清作用时能抑制血清中的IgM类抗体的凝集活性，检查出的抗体是IgG类，因此提高了该项反应的特异性。

器材与试剂：虎红平板凝集抗原、载玻片、移液器、枪头方法：在载玻片上加抗原30μl，加入30μl被检血清，混匀。

在5min内观察结果，轻摇载玻片，出现凝集颗粒为阳性，否则为阴性。

试管凝集试验（SAT）：实验原理：布鲁氏菌侵入机体后，会刺激机体产生特异性抗体，这种抗体可与相应的布氏菌抗原发生特异性结合，在电介质作用下，就会形成肉眼可见的凝集反应，也就是用已知抗原查未知抗体。

器材与试剂：布病试管凝集抗原、生理盐水、试管、移液管、移液器、小烧杯、枪头、试管架方法：1.准备试管：取9支试管放在试管架中编号。

1号管为血清对照管，2—8号为试验管，9号为抗原对照管。

2.血清稀释：1号管加入2.3ml生理盐水，2号不加，3号—9号各加入0.5ml生理盐水。

1号管加入0.2ml被检血清，混匀后各吸0.5ml加入2、3号管。

从3号开始做倍比稀释，8号吸0.5ml弃去。

3.加入抗原：10倍稀释抗原（用烧杯，1ml抗原9ml生理盐水），从2号开始每支加0.5ml稀释后抗原，从2号开始，血清被稀释浓度为1：25、1:50、1:100、1:200、1:400、1:800、1:16004.凝集试验标准比浊管的配制（判定透明程度的依据）：取5支试管，编号，取稀释后的抗原再做2倍稀释。

盐水(ml) 清亮度标记管号抗原稀释液(ml)1 0.00 1.00 100% ++++2 0.25 0.75 75% +++3 0.50 0.50 50% ++4 0.75 0.25 25% +5 1.00 0.00 0% —充分混匀，将所有试管放入温箱中37℃培养20—22小时取出，在室温下放置1—2小时后观察结果。

布氏菌病虎红平板凝集试验抗原新兽药证书一、概述布氏菌病是一种由布氏菌引起的家畜和野生动物传染病，也可传染给人类。

布氏菌病的传播对动物养殖业和食品安全造成了严重威胁，因此对布氏菌进行有效的检测和防控至关重要。

其中，虎红平板凝集试验是一种常用的血清学检测方法，对布氏菌病的诊断具有重要意义。

二、布氏菌病虎红平板凝集试验抗原1. 抗原来源布氏菌病虎红平板凝集试验抗原主要来源于已知含有布氏菌的动物血清，如牛、羊、猪等。

这些血清样本需要通过严格的筛选和处理，以确保抗原的纯度和稳定性。

2. 制备方法虎红平板凝集试验抗原的制备需要严格按照相关技术规范进行操作。

首先需要从携带布氏菌的动物中提取血清样本，然后通过离心、超滤等手段去除杂质和细菌。

经过适当的稀释和加工处理，最终得到用于虎红平板凝集试验的抗原制剂。

3. 抗原质量控制为了确保抗原的稳定性和活性，需要对抗原制剂进行严格的质量控制。

包括对抗原的存储条件、保存期限、抗原效价等指标进行监测和管理，以确保虎红平板凝集试验的准确性和可靠性。

三、新兽药证书1. 申请流程布氏菌病虎红平板凝集试验抗原作为兽药的一种，需要获得新兽药证书才能在市场上合法销售和使用。

申请新兽药证书需要遵循相关政策和法规，提交包括临床试验报告、生产工艺流程、质量控制方案等材料，并经过相关部门的审批和认证。

2. 证书标注一旦获得新兽药证书，抗原制剂需要在包装、说明书等相关资料上标注证书编号、有效期限等信息。

这些信息对药品的合法性和可追溯性具有重要意义，也为用户提供了使用保障。

3. 证书更新新兽药证书的有效期通常较短，一旦过期就需要重新申请并通过审批，获得更新证书。

抗原生产企业需要及时关注证书的有效期限，提前做好证书更新工作，以保障产品的合法生产和销售。

四、结论布氏菌病虎红平板凝集试验抗原的制备和管理对于布氏菌病的检测和防控具有重要意义。

严格控制抗原的质量和规范生产流程、及时申请和更新新兽药证书，是保障抗原生产质量和市场合法的关键步骤。

动物布鲁氏菌病诊断技术GB/T18646—20021 范围本标准规定了动物布鲁氏菌病的诊断技术。

本标准规定的虎红平板凝集试验、乳牛全乳环状试验适用于家畜布病田间筛选试验和乳牛场布病的监测及诊断泌乳母牛布病的初筛试验；试管凝集试验和补体结合试验适用于诊断羊种、牛种和猪种布病感染的家畜。

本标准规定的试管凝集试验不适用于犬种和绵羊副睾种布病感染家畜的检疫。

2 虎红平板凝集试验2.1 材料准备2.1.1 抗原、标准阳性血清、阴性血清由制标单位提供，按说明书使用。

2.1.2 受检血清应新鲜，无明显蛋白凝块，无溶血和无腐败气味。

2.1.3 洁净的玻璃板，其上划分成4cm2的方格。

2.1.4 吸管或分装器，适于滴加0.03mL。

2.1.5 牙签或火柴杆，供搅拌用。

2.2 操作方法2.2.1 将玻璃板上各格标记受检血清号，然后加相应血清0.03mL。

2.2.2 在受检血清旁滴加抗原0.03mL。

2.2.3 用牙签类小棒搅动血清和抗原使之混合。

2.2.4 每次试验应设阴、阳性血清对照。

2.3 判定2.3.1 在阴、阳性血清对照成立的条件下，方可对被检血清进行判定。

2.3.2 受检血清在4min内出现肉眼可见凝集现象者判为阳性(+)，无凝集现象，呈均匀粉红色者判为阴性(—)。

3 乳牛布病全乳环状试验3.1 材料准备3.1.1 布病全乳环状抗原由制标单位提供，按说明书使用。

3.1.2 乳样3.1.2.1 受检乳样须为新鲜的全乳。

3.1.2.2 采乳样时应将母畜的乳房用温水洗净、擦干，然后将乳液挤入洁净的器皿中。

3.1.2.3 采集的乳样夏季时应于当日内检查；保存于2℃时，7d内仍可使用。

3.2 操作方法3.2.1 取乳样lml，加于灭菌凝集试验管内。

3.2.2 取充分振荡混合均匀的全乳环状抗原1滴(约50ul)加人乳样中充分混匀。

3.2.3 置37℃一38℃水浴中60min。

3.2.4 加温后取出试管勿使振荡，立即进行判定。

虎红平板凝集试验（RBPT）检测布鲁氏菌病的原理和办法由于布鲁氏菌培养的营养条件苛刻并且时间长，所以布鲁氏菌病的诊断以血清学诊断为主。

其原理主要是根据相应抗原抗体可以在体外产生特异性结合并呈现可见反响，用已知抗原(或抗体)检测体液中未知的抗体(或抗原)。

虎红平板凝集试验（RBPT）灵敏度高，价格廉价，操纵便利，检测快速，适于群体布鲁氏菌病的普查。

在国际贸易中是牛、羊、猪布鲁氏菌病检测的指定试验，在我国也用于人布鲁氏菌病监测的初筛。

检测布鲁氏菌病所用的虎红平板凝集抗原是用抗原性良好的布鲁氏菌菌株经培养，灭活，离心收集菌体用虎红染料染色后，悬浮于乳酸缓冲液中制备而成。

试验原理：虎红平板凝集试验又称为班氏孟加拉红平板凝集试验。

由于所用的抗原是酸性（PH3.63.9）带色的抗原，该抗原与被检血清作用时能抑制血清中的IgM类抗体的凝集活性、检查的抗体是IgG类，因此提高了反响的特异性。

虎红平板凝集试验具体办法如下：一、资料准备1、虎红平板凝集抗原、标准阳性血清、阴性血清由制标单位提供，按说明书使用。

2、被检血清应新鲜，无明显卵白凝块，无溶血和无败北气味。

3、洁净的玻片或玻璃板，其上划分红4cm2的方格。

4、吸管或移液器，适于滴加0.03mL液体。

5、牙签、混合棒或火柴杆，供搅拌用。

二、操纵办法1、实验前，应将血清和抗原在室温放置3060min。

2、将玻璃板上各格标识表记标帜被检血清号，然后加相应被检血清0.03mL。

3、在被检血清旁滴加虎红平板凝集抗原0.03mL。

4、用牙签类小棒搅动血清和抗原，使之充分混合，在5分钟内观察结果。

5、每次试验应设阴性血清、阳性血清对比。

三、结果判定1、在阴、阳性血清对比成立的条件下，方可对被检血清进行判定。

2、受检血清在4min内呈现肉眼可见凝集现象者判为阳性(+)，无凝集现象，呈均匀粉红色者判为阴性()。

四、办法评价1、虎红平板凝集试验检测布鲁氏菌病，办法简便、快速、容易操纵，适于基层年夜面积检疫；2、该办法敏感性较好，检查牛的阳性率稍高于绵羊、山羊。

嘉祥县疾病预防控制中心
布鲁氏菌抗体检测原始记录
编号：JXCDC /JL-146 共页第页
样品编号样品种类血清
检测项目布鲁氏菌抗体检测检测依据布病诊断标准附录WS 269-2007 试剂厂家试剂批号
设备名称生物安全柜、电热恒温培养箱试剂效期
一、虎红平板凝集试验（RBPT）：
取0.03ml被检血清，滴于洁净玻片上，然后加入虎红平板抗原0.03ml，混匀，在5分钟内判断结果。

二、试管凝集试验（SAT）：
1、取被检血清0.08ml加入第一管0.92ml的生理盐水内，混匀后，取0.5ml加入第二管中（含0.5ml生理盐水）作1:1稀释，以后各管以此类推，后一管弃去0.5ml。

血清稀释度依次为1:12.5，1:25，1:50，1:100，1:200，1:400，1:800。

2将稀释10倍的布氏菌菌液分别加入各血清管管内，每管加入0.5ml，混匀。

放37℃温箱中22小时观察结果。

最后血清的稀释度为1:25，1:50，1:100，1:200，1:400，1:800，1:1600。

3.菌液凝集程度的判断与同时配制的比浊管透明程度为参照，比浊管的配制方法见表1。

三、布鲁氏菌抗体检测结果：
样品编号姓名RBPT SAT滴度：1:25 1:50 1:100 1:200
检测起至时间年月日时至月日时
检测人：复核人：。

布氏杆菌病虎红平板凝集实验操作流程材料与试剂以布氏杆菌病平板凝集反应为例。

1．玻璃板、刻度吸管等。

2．布氏杆菌平板凝集抗原、布氏杆菌标准阳性血清。

操作方法1．取洁净玻板一块，用玻璃铅笔划成方格，并注明待检血清号码。

2．取０.２ml吸管分别吸取0.08ml、0.04ml、0.02ml和0.01ml各放入一方格内。

大规模检验时，可只做２个血清量，大动物用0.04ml和0.02ml，中小动物用0.08ml和0.04ml。

每检一个样品需换一只吸管。

3．每格内加布氏杆菌平板凝集抗原0.03ml，滴在血清附近，而不要与血清接触。

用牙签（或火柴杆）自血清量最小的一格起，将血清与抗原混匀，每份血清用一根牙签。

4．混合完毕，将玻板置凝集反应箱上均匀加温或采用别的办法适当加温，使温度达到３０℃左右。

3min～5min内记录结果。

结果判定＋＋＋＋：出现大的凝集块，液体完全清亮透明，即100％凝集。

＋＋＋：有明显的凝集片，液体几乎完全透明，即75％凝集。

＋＋：有可见的凝集片，液体不甚透明，即50％凝集。

＋：液体混浊，有小的颗粒状物，即25％的凝集。

－：液体均匀混浊，即不凝集。

以出现＋＋凝集的血清最高稀释倍数作为该份血清的凝集价。

大动物（牛、马、骆驼等）以0.02ml出现凝集价判为布氏杆菌病血清阳性，0.04ml出现凝集价判为可疑。

中小动物（猪、山羊、绵羊等）以0.04ml出现凝集价判为该份血清为布氏杆菌病阳性血清，0.08ml出现凝集价判为可疑。

注意事项1．每次试验必须以标准阳性血清和标准阴性血清进行对照。

2．加抗原前必须摇匀。

3．反应温度最好保证在30℃左右，3min～5min内判定。

如反应温度偏低，可适当延长判读时间。

4．如用两个血清量作试验，任何一个血清量出现凝集反应时，则需要用四个血清量重检。

5．平板凝集反应最好是用于初筛，如出现阳性或可疑反应，再用试管凝集反应进行复检，以定性。

6．平板凝集反应与试管凝集反应的关系。

随着全国各地牛养殖业规模的不断扩大，养牛数量越来越多，各种传染性疾病发病率也呈现逐年上升的趋势。

布鲁氏杆菌病是牛养殖业中较为常见的疫病之一，也是一种人畜共患病，具有较强的传染性与危害性，已被我国列为二类动物性传染病。

该病一旦暴发流行，则会长期潜伏在养殖场内难以净化，当前尚无特效药可以治疗，很容易给养殖户造成不可挽回的经济损失。

因此，如何对牛布鲁氏杆菌病进行有效净化并做好预防控制工作显得尤为重要。

一、牛布鲁氏杆菌病原及流行特点1、病原学特征布鲁氏杆菌病由布鲁氏杆菌感染所致，其菌属众多，当前已知的就有19个生物型、6个种类，该病菌主要寄生在细胞内，侵袭力与传播力均较强，主要侵害宿主淋巴系统及生殖系统。

布鲁氏杆菌外观呈球杆、球型或短杆状，其中牛属菌多呈短杆状，长度为0.5～1.3μm，宽度约为0.4μm，未长有鞭毛、荚膜和芽孢等结构，为革兰式染色阴性菌，涂片镜检多呈单个排布。

该病菌在外界环境中适应能力极强，阳光直射条件下可存活4h，但难耐湿热环境，在60℃温度条件下30min即被灭活，70℃温度条件下5min即被灭活，100℃热水中会被立即灭活，普通的消毒剂均可将其杀灭。

2、流行病学人类与多种动物均易感染布鲁氏杆菌病，其中，以牛、羊、猪等易感性最强，母畜比公畜更易感，成年动物比幼龄动物更易感，发病率也更高。

布鲁氏杆菌病在一年四季均可发生，尤以春、夏季高发。

牛养殖场内患病牛与带菌牛是该病主要的传染源，公牛感染后期的精液、尿液、粪便中会携带大量病菌，患病的妊娠母牛生产或流产后，其乳汁、胎衣、胎盘羊水、恶露等分泌物中携带有大量致病菌，对产房周边环境造成污染，健康牛接触后染病。

通常情况下，患有该病的妊娠母羊在流产后的3年内，其阴道分泌物中仍带有布鲁氏杆菌。

呼吸道、生殖道、消化道等是该病主要的感染途径，也可通过破损的皮肤或黏膜等传染该病。

二、临床症状及病理变化1、临床症状布鲁氏杆菌病多呈地方性流行，牛只染病后通常会有15～180d的潜伏期，大部分为隐性感染。

虎红平板凝集试验（RBPT）检测布鲁氏菌病的原理和方法由于培养的营养条件苛刻而且时间长，所以病的诊断以血清学诊断为主。

其原理主要是根据相应抗原抗体可以在体外发生特异性结合并呈现可见反应，用已知抗原(或抗体)检测体液中未知的抗体(或抗原)。

虎红平板（RBPT）灵敏度高，价格便宜，操作方便，检测快速，适于群体布鲁氏菌病的普查。

在国际贸易中是牛、羊、猪布鲁氏菌病检测的指定试验，在我国也用于人布鲁氏菌病监测的初筛。

检测布鲁氏菌病所用的虎红平板凝集抗原是用抗原性良好的布鲁氏菌菌株经培养，灭活，离心收集菌体用虎红染料染色后，悬浮于乳酸缓冲液中制备而成。

试验原理：虎红平板凝集试验又称为班氏孟加拉红平板凝集试验。

由于所用的抗原是酸性（）带色的抗原，该抗原与被检血清作用时能抑制血清中的IgM类抗体的凝集活性、检查的抗体是IgG类，因此提高了反应的特异性。

虎红平板凝集试验具体方法如下：一、材料准备1、虎红平板凝集抗原、标准阳性血清、阴性血清由制标单位提供，按说明书使用。

2、被检血清应新鲜，无明显蛋白凝块，无溶血和无腐败气味。

3、洁净的玻片或玻璃板，其上划分成4cm2的方格。

4、吸管或移液器，适于滴加液体。

5、牙签、混合棒或火柴杆，供搅拌用。

二、操作方法1、实验前，应将血清和抗原在室温放置30-60min。

2、将玻璃板上各格标记被检血清号，然后加相应被检血清。

3、在被检血清旁滴加虎红平板凝集抗原。

4、用牙签类小棒搅动血清和抗原，使之充分混合，在5分钟内观察结果。

5、每次试验应设阴性血清、阳性血清对照。

三、结果判定1、在阴、阳性血清对照成立的条件下，方可对被检血清进行判定。

2、受检血清在4min内出现肉眼可见凝集现象者判为阳性(+)，无凝集现象，呈均匀粉红色者判为阴性(-)。

四、方法评价1、虎红平板凝集试验检测布鲁氏菌病，方法简便、快速、容易操作，适于基层大面积检疫；2、该方法敏感性较好，检查牛的阳性率稍高于绵羊、山羊。